微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

要約

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

要約

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

概要

微小電極アレイ（MEAの）に結合された試験管 2次元（2D）のニューラルネットワークではニューロンのダイナミクスと基礎接続の間の相互作用を研究するために採用した金標準実験モデルをarethe。開発中に、ニューロンは、よくdefinedspatio-temporalpatternsof活性を示す複雑なネットワーク^1,2（ すなわち 、バースト、ネットワークバースト、ランダムスパイク活動を）再作成します。 MEAがネットワークレベルで発現ダイナミクスの詳細な調査を可能にする、多くのサイトから（数十から数千の微小電極に）電気生理学的活動を記録。また、解離文化の使用は、設計、ネットワークを設計することが可能ですになります。これは、異種の神経ポップの存在、このように記録された電気生理学的活性および細胞密度^3、モジュール^4,5度のようなネットワーク組織のパラメータとの間の機能の関係を理解することは容易ですulations ⁶などがしかし、解離培養細胞上のすべてのin vitroでの研究は、2D神経回路網に基づいています。このアプローチは 、in vivo（本質的に3次元、3D）システムに関してoversimplificationsにつながる：2Dモデル、細胞体と成長円錐（I）における平坦化され、軸索、樹状突起の伸長は、全方向⁷に拡散することはできません。 （ii）の2D インビトロネットワークの展示は、ネットワーク⁸のニューロンの大部分を伴う活動を破裂によって支配電気生理学的ダイナミクスをステレオタイプ。

最近、 インビトロの3次元構造を可能にするために開発されてきた別の解決法は、神経ネットワークを解離しました。一般的な考え方は、ニューロンが、3Dの方式で成長することができます足場を作ることにあります。そのような足場は、高分子ゲル、固体多孔質マトリックス^9-13で実現することができます。ポリマーの機械的性質を利用することにより、THES細胞内を埋め込むことが可能ですニューロスフェア¹¹の3次元培養の均一なブロックを定義することにより、電子構造。このアプローチの主な特徴は、神経球^9,12の剛性機械的性質です。しかしながら、これらの材料は、多孔性が制限されており、それらは、マトリックス内部の細胞移動を保証しません。この欠点を克服するために、可能な解決策は、「ユニット」モジュールにマトリクスをスライスすることからなります。残念ながら、粒子のサイズおよび形状の多様性は、通常、層状構造への充填を妨げる可能性があります。 ^7では 、カレンと共同研究者は、生物活性、細胞外マトリックスベースの足場内のニューロンおよび/ ​​またはアストロサイトで構成された3D神経構造物を設計しました。このような操作された神経組織は、3Dマイクロ環境内の神経生物学的応答を研究し、操作するためにインビトロの研究では許可 。このモデルでは、細胞外マトリックス（ECM）および/またはヒドロゲル足場（500-600ミクロン厚）全体に分散ニューロンおよびグリア細胞から成っていました。この共同で5,000細胞/ mm ³ - ndition、最適な細胞生存率（90％より大きい）が約3750の最終密度で細胞をプレーティングすることによって発見されました。そのような濃度値がマウスの脳皮質の細胞密度が90,000細胞/ mm ^{3 14}でのin vivo条件でのものよりもはるかに低いことに留意しなければなりません。この制限を克服し、Pautot ^15は、細胞密度とのネットワーク接続は、ネットワークのリアルタイムイメージングを可能にしながら、インビボ条件に似ているように制御される三次元インビトロシステムを実現するために、同僚。実際に、この方法は、培養神経細胞は、 シリカマイクロビーズ上で増殖することができる解離概念に基づいています。これらのビーズは付着する神経細胞体のためと、成熟した、成長し拡張し、他のニューロンへのシナプスの連絡先を定義するために、彼らのarborizationsための十分な大きさの成長表面を提供します。この方法は、FOする単分散ビーズの自発的な組立特性を利用RM 3Dは、異なるビーズ上のニューロンの間で拘束された接続性を有する異なる層のニューロンの明確なサブセットを含む六角形の配列をレイヤード。この方法で達成された細胞密度は約75,000細胞/ mm ^3でした 。

最近、我々は、MEAを¹⁶にPautotの方法を適応している。得られた結果は、3D電気生理学的活性は、2Dネットワークによって発現される1以上の活動の広いレパートリーを提示することを示しています。 3D成熟した文化がネットワークバーストと、ランダムなスパイク活動の共存の両方強化ダイナミックを示します。同様に、唐-Schomerと同僚^17は、数ヶ月のために、in vitroでの一次皮質培養を維持シルクプロテイン系の多孔質足場を実現し、タングステン電極を用いて電気生理学的活性を記録しました。

この作品では、多国間環境協定に結合された3次元神経回路網を構築するための実験手順を説明します。

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プロトコル

実験プロトコルは、DL 1992分の116とし、ジェノバ大学（Protののガイドラインにより応じた保健のイタリア語省によって、ヨーロッパの動物保護法制（63分の2010 / EU）によって承認された。N. 13130​​、月を2011）。すべての努力は、プロジェクトのための動物の数を減少させ、その苦痛を最小限にするために行われました。

材料と支持体の作製

1. CNC（コンピュータ数値制御）フライス盤を用いて、PDMS（ポリジメチルシロキサン）の制約を構築するための金型を作成します。このような金型は、ポリテトラフルオロエチレンで中心筒（PTFE）とポリカーボネートで実現されます。この材料は、PDMSが硬化した後にマスクを容易に抽出することができます。
   注：金型の設計は、コンピュータ支援設計（CAD）によって行われ、その後、CNCフライス盤に配信されています。
2. PDMSエラストマーを準備します。 PDMSは、有機ポリマーです。これは、二つの要素から構成されています、硬化剤及びポリマー。 1：10の体積比で混合して、硬化剤の一部とポリマー9部。ペトリ皿に二つの成分を入れ、気泡を除去するために10分間真空チャンバ内で混合を振るとインサート。 PDMSの3グラムは、つの制約のために十分です。
3. PDMS制約を構築します。成形機にPDMS材料を挿入し、120℃で30分間オーブンに入れて。 PDMS制約はそれぞれ22.0と3.0ミリメートルの外部および内部直径650ミクロンの高さの理想的な円筒の形状を有しています。
4. メッキ前日、カップル実体顕微鏡下でピンセットを用いた微小電極アレイ（MEAの）の活性領域にマスクと120℃のオーブンで、PDMSマスクを滅菌します。
5. 円錐バイアル中で2時間、70％エタノールおよびEVを回転させ、ガラスビーズ（42.3±1.1ミクロンの認定平均直径40±2μmの呼び径）滅菌すべてのマイクロビーズを公開するERY 30分。
6. バイアルからのエタノール溶液を除去し、滅菌水でマイクロビーズを2回すすいでください。
7. 0.05μgの/ mlのポリ-D-リジンおよびラミニンの混合溶液の24μlの（直径3.0ミリメートルに等しい）PDMSマスクによって画定MEA領域の中央部を条件付けます。
8. コー​​トは0.05μg/で接着タンパク質、ラミニンおよびポリ-D-リジンとのマイクロビーズはmlであり、安定的かつ長期的な神経ネットワークを得るために、37℃のインキュベーター内で一晩置いておきます。
9. MEAのガラス表面からガラスマイクロビーズの両方から接着因子を削除します。吸引するピペットでコーティング溶液の約95％とは、MEAの表面に滅菌水の小さなVOLUME-24μl-を適用します。吸引し、再び水の95％以上と細胞をプレーティングする前に1時間層状フードの下で、MEAの乾燥をしてみましょう。
   注：マイクロビーズの場合は代わりに、コーティングを吸引ニューロンはメッキされたガラス表面を調整するために、滅菌水や、B27などの基礎培地とサプリメント第1と第一の洗浄を、ソリューションとなります。マイクロビーズを乾燥させないでください。バイアル内部の培養液中の懸濁液のままにしておきます。
10. 彼らは均一な層を形成する自己集合する膜インサート（細孔直径0.4ミクロン）とのマルチウェルプレートにピペット-200μl-、処理されたマイクロビーズの懸濁液（約32,000）を用いて、配布します。
11. 培地0.5mlを有する膜の各ウェルを記入し、インキュベーターに入れて（T = ^37.0°Cの 、CO ₂ = 5％）ニューロンは（3.2）メッキすることの準備が整うまで。

2.胚の解剖と組織の解離

1. 中（点灯午前7時 - 午後7時）、通常の明暗スケジュールの下で一定温度（22±1℃）および相対湿度（50％）でハウス大人雌ラット（200〜250グラム）動物施設。食料と水は自由に利用可能であることを確認してください。
2. 3％のイソフルランを使用して、開発の18日（E18）の後に妊娠したメスのラットを麻酔。その後、頸椎脱臼により動物を生け贄に捧げます。
3. 各ラットの胚から海馬を削除およびCa ²⁺およびMgのない氷冷ハンクス液²⁺に入れます。日目に開発海馬および皮質組織の18は非常に柔らかく、小片に切断する必要はありません。さらなる詳細は^18,19を見ることができます。
4. 37℃で18〜20分間のDNAse 0.05％を含むトリプシン/ハンク溶液の0.125％で組織を解離します。
5. パスツールピペットを用いて上澄み液を除去し、5分間、10％ウシ胎児血清（FBS）を含む培地を加えることによって、酵素消化を停止します。
6. FBSで培地を除去し、そのサプリメント、1％L-グルタミン、ゲンタマイシンを10μg/ mlの培地で1回洗浄します。パスツールピップで再びメディアを削除しますETTEおよび10μg/ mlのゲンタマイシン、そのサプリメント、1％L-グルタミンを有する成長培地の少量（500μL）で再度補充。
7. 細胞の乳白色の懸濁液が明らかになるまで、狭いパスツールピペットで機械的に組織ペレットを解離します。これは、細胞懸濁液を遠心分離する必要はありません。
8. 2.0 mlの最終容積を得るために、増殖培地で細胞懸濁液の少量を希釈します。血球計数器室で得られた細胞濃度を数えます。 /μL600-700細胞の所望の細胞濃度を得るためには5：1で、この濃度を希釈します。

3.セルメッキ

1. PDMSの制約によって定義され、MEAの活性領域上に約2,000細胞/ mm ²の密度でプレートの細胞は、2次元神経回路網を作成します。
   注：各海馬は約5×10 ⁵細胞を含む、（単一胚のための1×10 ^6）。 6×10の合計量を取得するために6胚を解剖⁶ 2ml中の細胞、および/μlの3000細胞の推定濃度。 /μlの所望の細胞濃度およびプレート約600-700の細胞を得るために、5：1で、この濃度を希釈します。 PDMSの制約によって区切られたMEAの面積は約7.065ミリメートル^2、播種した細胞600個/μL×24μL= 14,400細胞/ ^mm 2で2038細胞の最終濃度の合計数である場合。
2. 37℃の加湿_CO 2雰囲気下（5％）でインキュベーターにMEAデバイスを配置します。
3. 三次元培養の構築のための予備的なステップを完了するために、マルチウェルプレートの内側に位置するマイクロビーズ単層の表面に600〜700個/μlの（約100,000細胞）の細胞濃度で懸濁液の160μlのを配布します。 37℃の加湿_CO 2雰囲気下（5％）でインキュベーターでマルチウェルプレートを置きます。

4. 3D神経ネットワークの構築

1. 6-8時間、めっき後、約30〜40マイクロリットルの容量に設定されたピペットを用いて、PDMSの制約によって区切られた領域の内側に非常に慎重に、マルチウェルプレートからサスペンション（ニューロンとマイクロビーズ）を転送します。各転送後、自己集合六角形のコンパクトな構造にするマイクロビーズを可能にするために、約半分の分を待ちます。
2. すべての層が堆積され、自然に組み立てられると、媒体の約300μlのPDMS制約で区切られた領域の上部の大滴で補充します。
3. インキュベーター内（T = 37.0を^O℃、CO ₂ = 5％）をMEAに結合された三次元構造を入れ48時間のサプリメントで成長培地培養物の最終体積（約1ml）を添加する前に。
   注：メンブレンインサート（3万）とMEAデバイス（6000）上に単層のビーズの数をマルチウェルプレート上のビーズの総数を考えてみましょう。得られた三次元構造は、MIの5 層から構成されていますcrobeads細胞。 3D神経ネットワークが幾何学的に完全ではないことを考慮すると、結果として得られる3次元構造は、5-8の層で構成することができます。
4. メッキ後の日は、慎重に、MEAのリングの内側に培地（約900μL）の最終容量を追加します。 4-5週間、37℃の加湿_CO 2雰囲気下（5％）での3次元培養を維持します。週に一度培地の半分を交換してください。

5.共焦点顕微鏡の取得

1. ホルダーに顕微鏡のステージに、生物学的サンプルを修正。正しい帯域幅発光フィルターをキャプチャするイメージごとに、順番にPMTの（-0.3％）画像を取得することで、レーザー（アルゴン、496から555 nm）で、スキャン速度（400 Hz）を設定し、ゲインとオフセット飽和を回避し、信号対雑音比を増加させます。結果セクションは 、図4の画像を取得するために使用される値を報告します。
2. Z -stackシーケンスの取得については、モミSTは、上部とサンプルの底層のz位置の値を選択し、取得を行うためのステップサイズを選択します。

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結果

この実験手順では、関連する役割が3Dニューロンネットワークの成長のための機械的な足場を定義するマイクロビーズで再生され、図1A及びBは、マイクロビーズの配置を表示する（40±2μmの公称直径;の認定平均直径平面で42.3±1.1ミクロン）。このような構造の特殊性は、マイクロビーズが自発的にコンパクト六角形の幾何学（ 図1BおよびC）を定義する自己集合すると...

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ディスカッション

この作品では、3Dで構成された試験管プラ ​​ットフォームにおける新規の実験では、ネットワークの電気生理学のためのMEAに結合された神経細胞培養は、提示された設計しました。 Z -軸に沿って神経突起伸長を可能にするための足場としてのマイクロビーズの使用は、平面MEAと統合するように調整されています。このように、有効かつ信頼性の高いin vitroでの3D?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5 mg/L
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1 gr Glass Part. Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L