Interfaz culturas 3D Engineered neuronales a micro-electrodos matrices: un innovador<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Resumen

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Resumen

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Introducción

In vitro de dos dimensiones (2D) redes neuronales acoplados a micro-electrodos Arrays (AMUMA) arethe modelo experimental de oro-estándar adoptado para estudiar la interacción entre la dinámica neuronal y la conectividad subyacente. Durante el desarrollo, las neuronas recrean redes complejas que muestran bien definedspatio temporalpatternsof actividad ^1,2 (es decir, las explosiones, las explosiones de red, actividad clavar al azar). AAM registran la actividad electrofisiológica de muchos sitios (de decenas a miles de microelectrodos), lo que permite una investigación detallada de la dinámica expresadas a nivel de red. Además, el uso de cultivos disociados hace possibile para diseñar-redes de ingeniería. Es más fácil de entender de esta manera las relaciones funcionales entre la actividad electrofisiológica registrada y los parámetros de la organización de la red, como la densidad de células ^3, grado de modularidad ^4,5, presencia de pop neuronal heterogéneaulations ^6, etc. Sin embargo, todos los estudios in vitro sobre células cultivadas disociadas se basan en redes neuronales 2D. Este enfoque conduce a simplificaciones con respecto al sistema in vivo (intrínsecamente 3-dimensional, 3D): (I) en un modelo conos, somata de crecimiento y 2D son aplanadas y la consecuencia axones-dendritas no puede extenderse en todas las direcciones ^7. (ii) 2D in vitro redes exhibición estereotipada dinámica electrofisiológicos dominadas por la actividad que implica la mayor parte de las neuronas de la red ⁸ reventar.

Recientemente, diferentes soluciones han sido desarrolladas para permitir la construcción de in vitro 3D disociada redes neuronales. La idea común consiste en crear un andamio donde las neuronas pueden crecer en una forma 3D. Un andamio de este tipo puede realizarse con geles de polímeros y matrices porosas sólidas ^9-13. Mediante la explotación de las propiedades mecánicas de los polímeros, es posible incrustar dentro de las células Tse estructuras mediante la definición de un bloque uniforme de las culturas 3D de neuroesferas ^11. La característica principal de este enfoque es la propiedad mecánica rígida de las neuroesferas ^9,12. Sin embargo, estos materiales han porosidad limitada, y no garantizar la migración de células dentro de la matriz. Para superar este inconveniente, una posible solución consiste en cortar la matriz en módulos "unidad". Por desgracia, el tamaño y la forma de las partículas de diversidad podría obstaculizar el embalaje en estructuras en capas regulares. En ^7, Cullen y sus colaboradores diseñaron un constructo neuronal 3D compuesto por neuronas y / o astrocitos dentro de un andamiaje basado en la matriz extracelular bioactiva. Tal tejido neural ingeniería permitido en investigaciones in vitro para estudiar y manipular las respuestas neurobiológicas dentro de micro-ambientes 3D. Este modelo consistía en neuronas y glia distribuidos por toda la matriz extracelular (ECM) y / o andamios de hidrogel (de 500-600 m de espesor). En este condition, una viabilidad celular óptima (mayor que 90%) se encontró en placas células a una densidad final de aproximadamente 3.750 - 5.000 células / mm ^3. Debe tenerse en cuenta que un valor tal densidad es mucho menor que el que está en la condición in vivo, donde la densidad de células de la corteza cerebral de ratón es de aproximadamente 90.000 células / mm ^{3 14.} Para superar esta limitación Pautot y compañeros de trabajo ¹⁵ se dieron cuenta de un sistema in vitro en 3D donde la densidad celular y la conectividad de red están controlados para asemejarse a las condiciones in vivo al tiempo que permite imágenes en tiempo real de la red. Prácticamente, este método se basa en el concepto de que disocian neuronas cultivadas son capaces de crecer en microperlas de sílice. Estas cuentas proporcionan una superficie de crecimiento lo suficientemente grande para que los cuerpos celulares neuronales para adherirse y para sus arborizaciones para crecer, madurar, ampliar y definir contactos sinápticos con otras neuronas. Este método aprovecha las propiedades de montaje espontáneas de cuentas monodispersados ​​a form 3D en capas matrices hexagonales que contienen distintos subconjuntos de neuronas en diferentes capas con conectividad restringida entre las neuronas en diferentes cuentas. La densidad celular lograda con este método fue de alrededor de 75.000 células / mm ^3.

Recientemente, hemos adaptado el método de Pautot los AMUMA ^16: los resultados obtenidos muestran que la actividad electrofisiológica 3D presenta un repertorio más amplio de actividades que la expresada por las redes 2D. Culturas maduras 3D muestran una dinámica mejorada en la que tanto la explosión de la red y actividad pico aleatoria coexisten. Del mismo modo, Tang-Schomer y compañeros de trabajo ¹⁷ se dieron cuenta de un armazón poroso a base de proteínas de seda-que mantiene una cultura cortical primaria in vitro para algunos meses, y registraron la actividad electrofisiológica por medio de un electrodo de tungsteno.

En este trabajo, los procedimientos experimentales para construir redes neuronales en 3D, junto a los acuerdos ambientales multilaterales se describirá.

Protocolo

El protocolo experimental fue aprobado por la Legislación Europea de Cuidado de Animales (2010/63 / UE), por el Ministerio de Salud de Italia, de conformidad con el DL 116/1992 y por las directrices de la Universidad de Génova (Prot. N. 13130, de mayo 2011). Se hicieron todos los esfuerzos para reducir el número de animales para el proyecto y para minimizar su sufrimiento.

1. Preparación de Materiales y Apoyos

1. Construir el molde para construir el PDMS (poli-dimetil-siloxano) de restricciones por medio de un CNC (Control Numérico Computarizado) fresadora. Tal molde se realiza en policarbonato con el cilindro central en politetrafluoroetileno (PTFE). Este material permite una extracción más fácil de la máscara una vez que el PDMS ha endurecido.
   NOTA: El diseño del molde se ha realizado por Computer-Aided-Design (CAD) y luego entregado a la fresadora CNC.
2. Preparar el elastómero PDMS. PDMS es un polímero orgánico. Se compone de dos elementos, Un agente de curado y un polímero. Mezclar por una relación en volumen de 1:10, una parte del agente de curado y nueve partes de polímero. Ponga los dos componentes en una placa de Petri, agitar e introduzca la mezcla en la cámara de vacío durante 10 min para eliminar las burbujas de aire. 3 g de PDMS son suficientes para una restricción.
3. Construir la restricción PDMS. Inserte el material de PDMS en el moldeador y ponerlo en el horno durante 30 minutos a 120 ° C. La restricción de PDMS tiene la forma de un cilindro ideal, con un diámetro externo e interno de 22,0 y 3,0 mm, respectivamente y una altura de 650 m.
4. El día antes de la galvanoplastia, acoplar la máscara a la zona activa de las matrices de micro-electrodos (AMUMA) por medio de una pinza bajo un microscopio estereoscópico y esterilizar la máscara de PDMS en el horno a 120 ° C.
5. Esterilizar las microesferas de vidrio (diámetro nominal de 40 ± 2 micras; diámetro medio certificada de 42,3 ± 1,1 micras) en etanol al 70% durante 2 horas en un vial cónico y girar every 30 minutos para exponer todas las microesferas.
6. Retirar la solución de etanol del vial y enjuagar las microperlas dos veces con agua esterilizada.
7. Acondicionar la parte central de la zona MEA delimitada por la máscara de PDMS (diámetro igual a 3,0 mm) con 24 l de solución mixta de poli-D-lisina y laminina en 0.05 g / ml.
8. Escudo las microperlas con proteínas de adhesión, laminina y poli-D-lisina en 0,05 g / ml y se dejan durante la noche en la incubadora a 37 ° C, para obtener una red neuronal estable y de larga duración.
9. Retire los factores de adhesión tanto de la superficie de vidrio de la MEA y de las microesferas de vidrio. Aspirar aproximadamente 95% de la solución de revestimiento con una pipeta y se aplica una pequeña en volumen 24μl- de agua estéril en la superficie MEA. Aspirar de nuevo más de 95% del agua y dejar que el MEA seca bajo el capó laminar durante 1 hora antes en placas las células.
   NOTA: En el caso de las microesferas lugar, aspirar el recubrimientosolución y hacer un primer lavado con agua esterilizada y una segunda con el medio basal y su suplemento tales como B27, con el fin de acondicionar la superficie del vidrio en el que se sembraron las neuronas. No dejes que las microesferas secas. Deja ellos en suspensión en el medio de cultivo en el interior del vial.
10. Distribuir, por medio de una pipeta -200 μl-, la suspensión de microperlas tratados (aproximadamente 32.000) en una placa de múltiples pocillos con inserción de membrana (diámetro de poro 0,4 micras) donde se auto-ensamblan formando una capa uniforme.
11. Llene cada pocillo de la membrana con 0,5 ml de medio y ponerlo en la incubadora (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) hasta que las neuronas están listos para ser plateado (3,2).

2. La disección de embriones y la disociación de Tejidos

1. Ratas hembras Casa adultas (200-250 g) a una temperatura constante (22 ± 1 ° C) y humedad relativa (50%) en un horario de luz-oscuridad normal (luz de 7 a.m.-7 p.m.) en elanimalario. Asegurar que los alimentos y el agua son de libre acceso.
2. Anestesiar una rata hembra embarazada después de 18 días de desarrollo (E18) con 3% de isoflurano. Luego, sacrificar al animal por dislocación cervical.
3. Retire hipocampos de cada embrión de rata y colocarlos en una solución salina equilibrada helada de Hank sin Ca ²⁺ y Mg ^2+. En el día 18 de hipocampo de desarrollo y los tejidos de la corteza son muy suaves y no tienen que ser cortado en trozos pequeños. Más detalles se pueden encontrar ^18,19.
4. Disociar el tejido en 0,125% de solución de tripsina / de Hank que contiene 0,05% de ADNasa durante 18-20 min a 37 ° C.
5. Eliminar la solución sobrenadante con una pipeta Pasteur y detener la digestión enzimática mediante la adición de medio con suero bovino fetal al 10% (FBS) durante 5 min.
6. Eliminar el medio con FBS y lavar una vez con el medio con su suplemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 mg / ml. Quite de nuevo el medio con un pip Pasteurette y vuelva a llenar de nuevo con una pequeña cantidad (500 l) de medio de crecimiento con su suplemento, 1% de L-glutamina, gentamicina 10 mg / ml.
7. Disociar el sedimento de tejido mecánicamente con una pipeta Pasteur estrecha hasta una suspensión lechosa de las células es evidente. No es necesario centrifugar la suspensión celular.
8. Diluir el pequeño volumen de suspensión de células con el medio de crecimiento para obtener un volumen final de 2,0 ml. Contar la concentración celular obtenida con una cámara de hemocitómetro. Diluir esta concentración a 1: 5 con el fin de obtener la concentración celular deseada de 600-700 células / mL.

3. celular Chapado

1. Células de placas a una densidad de aproximadamente 2.000 células / mm ² en el área activa del MEA, definidos por la restricción de PDMS para crear una red neuronal 2D.
   NOTA: Cada hipocampo contiene aproximadamente 5 x 10 ⁵ células, (1 x 10 ⁶ para un solo embrión). Diseccionar 6 embriones para conseguir un total de 6 x 10⁶ células en 2 ml, y una concentración estimada de 3.000 células / mL. Diluir esta concentración a 1: 5 con el fin de obtener la concentración deseada de células y la placa aproximadamente de 600-700 células / l. Si el área de MEA delimitada por la restricción de PDMS es de aproximadamente 7,065 mm ^2, y el número total de células cultivadas en placas células 600 / l x 24 l = 14.400 células, la densidad final de 2.038 células / mm ^2.
2. Coloque los dispositivos de los AMUMA en la incubadora con humidificado _atmósfera de CO 2 (5%) a 37 ° C.
3. Distribuir 160 l de la suspensión con una concentración celular de 600-700 células / l (aproximadamente 100.000 células) sobre la superficie de la monocapa microperlas posicionado dentro de las placas de múltiples pocillos para completar el paso preliminar para la construcción de cultivo tridimensional. Coloque las placas de múltiples pocillos en la incubadora con humidificado _atmósfera de CO 2 (5%) a 37 ° C.

Construcción 4. Red Neuronal 3D

1. 6-8 horas después de la galvanoplastia, transferir la suspensión (microperlas con neuronas) de las placas de múltiples pocillos con mucho cuidado dentro del área delimitada por la restricción PDMS mediante el uso de una pipeta fijada para un volumen de alrededor de 30-40 l. Después de cada transferencia, espere alrededor de medio minuto, para permitir que las microesferas de auto-ensamblan en una estructura compacta hexagonal.
2. Una vez que todas las capas se depositan y espontáneamente se reunieron, vuelva a llenar con una gran caída de unos 300 l de medio con la parte superior de la zona delimitada por la restricción PDMS.
3. Ponga la estructura 3D acoplado a la MEA en la incubadora (T = 37.0 ^{o C,} CO ₂ = 5%) durante 48 horas antes de añadir un volumen final (aproximadamente 1 ml) del crecimiento medio de cultivo con su suplemento.
   NOTA: Tenga en cuenta el número total de cuentas en las placas de múltiples pocillos con inserto de membrana (30.000) y el número de cuentas en una sola capa sobre el dispositivo MEA (6000). La estructura 3D resultante se compone de 5 capas de microbeads y células. Teniendo en cuenta que la red neuronal 3D no es geométricamente perfecto, la estructura 3D resultante podría estar compuesto por capas 5-8.
4. El día después de la siembra, añadir con cuidado el volumen final del medio (aproximadamente 900 l) en el interior del anillo de MEA. Mantener las culturas 3D en _una atmósfera de CO2 humidificado (5%) a 37 ° C durante 4-5 semanas. Reemplazar la mitad del medio una vez por semana.

5. Microscopía Confocal Adquisición

1. Fijar las muestras biológicas a la platina del microscopio en un soporte. Ajuste el láser (argón, 496-555 nm), la velocidad de exploración (400 Hz) en el que adquirir la imagen, la ganancia y el offset (-0,3%) de PMT para cada imagen para capturar el filtro de emisión de ancho de banda correcto y con el fin para evitar la saturación y para aumentar la relación señal a ruido. La sección de resultados informa de los valores utilizados para adquirir las imágenes de la Figura 4.
2. Para la adquisición de la z -stack secuencia, abetost seleccionar, el valor de la posición z de la parte superior y la capa inferior de la muestra, a continuación, seleccione el tamaño de paso para hacer la adquisición.

Resultados

. En este procedimiento experimental, un papel relevante es interpretado por las microperlas que definen el andamiaje mecánico para el crecimiento de la red neuronal 3D Figuras pantalla 1A y B la disposición de las microperlas (diámetro nominal de 40 ± 2 m; diámetro medio certificada de 42,3 ± 1,1 micras) en el avión. La peculiaridad de tales estructuras es que microperlas espontáneamente se auto-ensamblan definir una geometría hexagonal compacta (Figura 1B y C).

Discusión

En esta obra, una novela experimental en la plataforma vitro formado por 3D diseñado cultivos neuronales, junto a los acuerdos ambientales multilaterales para electrofisiología red se ha presentado. El uso de microperlas como andamio para permitir la consecuencia a lo largo del eje x neurítico z se ha adaptado para ser integrado con el MEA planar. De esta manera, los resultados obtenidos micro-sistema en un modelo in vitro de 3D ​​válido y fiable para estudiar la din?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5mg/liter
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1gr Glass Part.Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L