Schnittstellen 3D Engineered neuronalen Kulturen auf Mikroelektrodenarrays: ein innovatives<em&gt; In-vitro-</em&gt; Experimental Modell

Zusammenfassung

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Zusammenfassung

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Einleitung

In vitro zweidimensionale (2D) neuronale Netze zu Micro-Elektroden-Arrays (MEAs) gekoppelt arethe Goldstandard angenommen, um das Zusammenspiel von neuronaler Dynamik und der zugrunde liegenden Konnektivität studieren experimentellen Modell. Bei der Entwicklung, Nervenzellen neu zu komplexen Netzwerken, die auch angezeigt werden definedspatio-temporalpatternsof Tätigkeit ^1,2 (dh platzt, Netzwerk-Bursts, zufällige spiking Aktivität). MEAs erfassen die elektrophysiologische Aktivität von vielen Websites (von zehn bis Tausende von Mikroelektroden), so dass eine detaillierte Untersuchung der Dynamik zum Ausdruck auf Netzwerkebene. Darüber hinaus ist die Verwendung von dissoziierten Kulturen macht possibile, um technisch-Netzwerke zu entwerfen. Es ist einfacher, auf diese Weise zu verstehen, die funktionalen Beziehungen zwischen dem aufgezeichneten elektrophysiologische Aktivität und die Parameter der Netzwerkorganisation, wie Zelldichte ³ Grad an Modularität ^4,5, Gegenwart heterogener neuronalen populations ^{6 usw.} Aber alle in vitro-Studien auf distanzierte kultivierten Zellen werden auf 2D neuronale Netze. Dieser Ansatz führt zu Vereinfachungen in Bezug auf die in vivo (eigen 3-dimensional, 3D-System): (i) in einem 2D-Modell, Somata und Wachstumskegeln sind abgeflacht und die Axone-Dendriten Auswuchs kann nicht in allen Richtungen ⁷ verbreiten. (ii) 2D-in-vitro-Netzwerke weisen stereoelektrophysiologischen Dynamik durch Platzen Tätigkeit, die die meisten Neuronen des Netzes ⁸ dominiert.

In jüngster Zeit verschiedene Lösungen entwickelt worden, um die Konstruktion von in-vitro-3D dissoziierten neuronalen Netzen zu ermöglichen. Die gemeinsame Idee besteht in der Schaffung eines Gerüsts, wo Nervenzellen können in einer 3D-Mode wachsen. Ein solches Gerüst kann mit Polymer-Gelen und festen porösen Matrizen ^9-13 realisiert werden. Durch Ausnutzung der mechanischen Eigenschaften der Polymere ist es möglich, Zellen in thes einbettene Strukturen durch einen einheitlichen Block von 3D-Kulturen von Neurosphären ¹¹ definieren. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die starre mechanische Eigenschaft der Neurosphären ^9,12. Jedoch haben diese Materialien beschränkt Porosität, und sie garantieren nicht die Zellmigration in der Matrix. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist eine mögliche Lösung besteht im Trennen der Matrix in "Einheit" Modulen. Leider konnte die Größe und Form der Partikel Vielfalt Packung in regulären Schichtstrukturen zu behindern. In ^7, Cullen und Mitarbeiter entwickelt einen 3D-neuronalen Konstrukt up von Neuronen und / oder Astrozyten innerhalb eines bioaktiven extrazellulären Matrix-basierten Gerüst gemacht. Eine solche konstruiert Nervengewebe in vitro Untersuchungen erlaubt, zu studieren und zu manipulieren neurobiologischen Reaktionen innerhalb von 3D-Mikro-Umgebungen. Dieses Modell besteht aus Neuronen und Gliazellen im gesamten extrazellulären Matrix (ECM) und / oder Hydrogel Gerüste (500-600 & mgr; m dick) verteilt. In dieser Co5000 Zellen / mm ^{3 -} ndition eine optimale Zelllebensfähigkeit (mehr als 90%) wurde durch Ausplattieren Zellen bei einer endgültigen Dichte von ungefähr 3,750 gefunden. Es ist zu beachten, dass eine solche Dichtewert ist viel niedriger als die in der in-vivo-Zustand, in dem die Zelldichte der Maus Hirnrinde als etwa 90000 Zellen / mm ^{3 14} werden. Um diese Einschränkung zu überwinden und Mitarbeiter Pautot ¹⁵ realisiert ein 3D in vitro System, in dem die Zelldichte und die Netzwerkverbindung gesteuert werden, um in vivo-Bedingungen ähnlich und ermöglichen eine Echtzeitabbildung des Netzwerks. In der Praxis wird diese Methode auf dem Konzept, das dissoziiert kultivierten Neuronen können auf Siliciumdioxid-Mikroperlen wachsen basiert. Diese Kügelchen eine Wachstumsoberfläche groß genug für neuronalen Zellkörpern zu haften und ihre Verzweigungen zu wachsen, reifen, zu erweitern und zu definieren synaptische Kontakte zu anderen Neuronen. Diese Methode nutzt die spontane Versammlung Eigenschaften von monodispersen Perlen form 3D-Schichten-hexagonalen Arrays mit verschiedenen Untergruppen von Neuronen auf verschiedenen Ebenen mit eingeschränkter Konnektivität zwischen Nervenzellen auf verschiedenen Perlen. Die erzielte Zelldichte bei diesem Verfahren betrug etwa 75.000 Zellen / ^mm 3.

Vor kurzem haben wir Pautot Methode angepasst MEAs ^16: Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die 3D-elektrophysiologische Aktivität stellt einen größeren Repertoire von Aktivitäten als die von 2D-Netze ausgedrückt. 3D reife Kulturen weisen eine verbesserte Dynamik in der sowohl Netzwerk-Burst und zufällige Spike-Aktivität koexistieren. Ähnlich Tang-Schomer und Mitarbeiter ¹⁷ realisiert eine Seidenproteinbasis poröse Gerüst, das eine primäre kortikale Kultur in vitro für einige Monate beibehält, und nahm die elektrophysiologische Aktivität mittels einer Wolfram-Elektrode.

In dieser Arbeit wurden die experimentellen Verfahren, um 3D-neuronalen Netzen, um MEAs gekoppelt bauen beschrieben.

Protokoll

Das experimentelle Protokoll wurde von der Europäischen Animal Care Gesetzgebung (2010/63 / EU), von der italienischen Gesundheitsministerium in Übereinstimmung mit dem DL 116/1992 von den Richtlinien der Universität Genua (Prot genehmigt. N. 13130, Mai 2011). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Zahl der Tiere, für das Projekt zu reduzieren und ihr Leiden zu minimieren.

1. Herstellung von Materialien und Unterstützungen

1. Konstruieren Sie die Form, um die PDMS (Poly-Dimethyl-Siloxan) Einschränkung mit Hilfe einer CNC (Computer Numerical Control) Fräsmaschine zu bauen. Eine solche Form ist aus Polycarbonat mit dem zentralen Zylinder in Polytetrafluorethylen (PTFE) realisiert. Dieses Material ermöglicht eine einfachere Entnahme der Maske, sobald das PDMS ausgehärtet ist.
   HINWEIS: Das Design der Form wurde von Computer-Aided-Design (CAD) durchgeführt und dann an die CNC-Fräsmaschine ausgeliefert.
2. Bereiten Sie die PDMS-Elastomer. PDMS ist ein organisches Polymer. Er besteht aus zwei Elementen zusammengesetzt istEin Härtungsmittel und ein Polymer. Mischen sie von einem Volumenverhältnis von 1:10, wobei ein Teil des Härtungsmittels und neun Teile Polymer. Setzen Sie die beiden Komponenten in einer Petrischale, schütteln und legen Sie die Mischung in der Vakuumkammer für 10 Minuten, um Luftblasen zu beseitigen. 3 g PDMS ausreichend sind für eine Einschränkung.
3. Konstruieren Sie die PDMS-Einschränkung. Legen Sie die PDMS-Material in den Formgeber und legen Sie sie in den Ofen für 30 Minuten bei 120 ° C. Die PDMS-Einschränkung die Form eines idealen Zylinders mit einem äußeren und inneren Durchmesser von 22,0 und 3,0 mm betragen und einer Höhe von 650 um.
4. Am Tag vor dem Plattieren Paar der Maske auf den aktiven Bereich der Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) mittels einer Pinzette unter einem Stereomikroskop und Sterilisieren der PDMS-Maske in einem Ofen bei 120 ° C.
5. Sterilisation der Mikroglaskugeln (Nenndurchmesser von 40 ± 2 um; zertifiziert mittleren Durchmesser von 42,3 ± 1,1 & mgr; m) in 70% Ethanol für 2 h in einem konischen Röhrchen und drehen every 30 Minuten, um alle Mikrokügelchen freizulegen.
6. Entfernen Sie die Ethanol-Lösung aus dem Fläschchen und spülen Sie die Mikroperlen zweimal mit sterilem Wasser.
7. Konditionieren des zentralen Teils der MEA Bereich begrenzt durch die PDMS Maske (Durchmesser gleich 3,0 mm) mit 24 & mgr; l der gemischten Lösung von Poly-D-Lysin und Laminin bei 0,05 ug / ml.
8. Beschichtung der Mikrokügelchen mit Adhäsionsproteine, Laminin und Poly-D-Lysin bei 0,05 ug / ml und lassen Sie sie über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C, um eine stabile und langanhaltende neuronale Netz zu erhalten.
9. Entfernen der Haftfaktoren sowohl von der Glasoberfläche der MEA und den Mikroglaskugeln. Aspirat etwa 95% der Beschichtungslösung mit einer Pipette und eine kleine Volumen- 24μl- sterilem Wasser auf der Oberfläche MEA. Saugen Sie wieder mehr als 95% des Wassers und lassen Sie die MEA trocken unter der laminaren Haube 1 Stunde vor dem Ausplattieren der Zellen.
   HINWEIS: Im Fall von Mikrokügelchen statt absaugen BeschichtungLösung und eine erste Wäsche mit sterilisiertem Wasser und ein zweiter mit dem Grundmedium und seine Ergänzung wie B27, um die Glasoberfläche, wo Neuronen plattierenden konditionieren. Lassen Sie sich nicht die Mikroperlen trocken. Lassen sie in Suspension in dem Kulturmedium im Inneren der Ampulle.
10. Verteilen, mittels einer Pipette -200 μl- die Suspension der behandelten Mikrokügelchen (ca. 32.000) auf einer Multiwellplatte mit Membraneinsatz (Porendurchmesser 0,4 um), wo sie selbstorganisieren Bildung einer gleichförmigen Schicht.
11. Füllen Sie jede auch der Membran mit 0,5 ml Medium, und steckte es in den Inkubator (T = 37,0 ^o C, _CO 2 = 5%), bis die Neuronen sind bereit, plattiert werden (3.2).

2. Dissection von Embryonen und Dissoziation von Tissue

1. Haus erwachsene weibliche Ratten (200-250 g) bei einer konstanten Temperatur (22 ± 1 ° C) und die relative Luftfeuchtigkeit (50%) im Rahmen eines regelmäßigen Hell-Dunkel-Zeitplan (licht auf 7.00 Uhr bis 19.00 Uhr) in derTierhaltung. Stellen Sie sicher, dass Lebensmittel und Wasser sind frei verfügbar.
2. Anesthetize eine schwangere weibliche Ratten nach 18 Tagen Entwicklung (E18) unter Verwendung von 3% Isofluran. Dann, zu opfern das Tier durch Genickbruch.
3. Entfernen hippocampi voneinander Rattenembryo und legen Sie sie in eiskaltes Hanks ausgewogener Salzlösung ohne Ca ^{2+ und Mg 2+.} An Tag 18 der Entwicklung Hippocampus und Cortex Geweben sind sehr weich und müssen nicht in kleine Stücke geschnitten werden. Weitere Details können gefunden ^18,19 werden.
4. Dissoziation des Gewebes in 0,125% Trypsin / Hanks-Lösung, die 0,05% DNAse für 18-20 min bei 37 ° C.
5. Entfernen der überstehenden Lösung mit einer Pasteurpipette und Stoppen der enzymatischen Verdau durch Zugabe von Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) für 5 min.
6. Entfernen Sie das Medium mit FBS und einmal mit dem Medium mit seiner zu ergänzen, zu 1% L-Glutamin, Gentamycin 10 ug / ml zu waschen. Entfernen Sie wieder das Medium mit einer Pasteur-pipette und füllen es wieder mit einer kleinen Menge (500 ul) des Wachstumsmediums mit seiner Ergänzung, 1% L-Glutamin, Gentamycin 10 ug / ml.
7. Dissoziieren die Gewebepellet mechanisch mit einem schmalen Pasteurpipette bis eine milchige Suspension von Zellen ist offensichtlich. Es ist nicht notwendig, die Zellsuspension zentrifugiert.
8. Verdünnen des geringen Volumens der Zellsuspension mit dem Wachstumsmedium, um ein Endvolumen von 2,0 ml zu erhalten. Zählen Sie die erhaltenen Zellkonzentration mit einem Hämocytometer Kammer. Verdünnte diese Konzentration in einer 1: 5, um die gewünschte Zellkonzentration von 600-700 Zellen / & mgr; l zu erhalten.

3. Zell Plating

1. Platten Zellen in einer Dichte von etwa 2000 Zellen / mm ^{2 auf die} aktive Fläche der MEA von der PDMS Einschränkung definiert, um eine 2D neuronalen Netzwerks.
   Hinweis: Jeder Hippocampus etwa 5 x ¹⁰ 5 Zellen enthält, (1 x 10 ⁶ für einen einzigen Embryo). Sezieren 6 Embryonen auf einen Gesamtbetrag von 6 x 10 bekommen^{6 Zellen in} 2 ml, und einer geschätzten Konzentration von 3.000 Zellen / & mgr; l. Verdünnen Sie diese Konzentration bei 1: 5, um die gewünschte Zellkonzentration zu erhalten und die Platte ca. 600-700 Zellen / ul. Wenn die MEA Bereich durch die PDMS-Einschränkung begrenzt ist etwa 7.065 mm ^2, und die Gesamtzahl der plattierten Zellen 600 Zellen / ul x 24 & mgr; l = 14.400 Zellen, die endgültige Dichte 2.038 Zellen ^/ mm 2.
2. Platzieren der MEA Vorrichtungen in den Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre _CO 2 (5%) bei 37 ° C.
3. Verteilen 160 ul der Suspension mit einer Zellkonzentration von 600-700 Zellen / ul (etwa 100.000 Zellen) auf die Oberfläche der Monoschicht Mikrokugeln im Inneren der Multiwell-Platten angeordnet, um die Vorstufe für den Aufbau von dreidimensionalen Kultur abzuschließen. Setzen die Multiwell-Platten im Brutschrank mit befeuchteter Atmosphäre _CO 2 (5%) bei 37 ° C.

4. 3D-Neuronal Network Construction

1. 6-8 Stunden nach der Plattierung, übertragen Sie die Suspension (Mikroperlen mit Neuronen) von den Multiwell-Platten sehr sorgfältig in den durch die PDMS-Einschränkung begrenzt durch die mit einer Pipette für ein Volumen von etwa 30-40 & mgr; l eingestellt. Nach jeder Übertragung, warten Sie etwa eine halbe Minute, um die Mikroperlen zur Selbstorganisation in einem sechseckigen kompakten Aufbau zu ermöglichen.
2. Nachdem alle Schichten abgeschieden werden und sich spontan zusammengebaut, füllen Sie mit einem großen Tropfen von etwa 300 ul Medium die Spitze des von der PDMS-Einschränkung begrenzt.
3. Setzen die 3D-Struktur an die MEA gekoppelt im Inkubator (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) für 48 Stunden, bevor eine endgültige Volumen (etwa 1 ml) des Wachstumsmediums Kultur mit Ergänzung.
   HINWEIS: Beachten Sie die Gesamtzahl der Perlen auf der Multiwell-Platten mit Membraneinsatz (30.000) und die Anzahl der Perlen auf einer einzigen Schicht auf die MEA-Gerät (6000). Die resultierende 3D-Struktur besteht aus 5 Schichten zusammengesetzt microbeads und Zellen. Unter Berücksichtigung, dass die 3D neuronalen Netzwerk nicht geometrisch vollkommen, könnte das resultierende 3D-Struktur von 5-8 Schichten bestehen.
4. Am Tag nach der Beschichtung, sorgfältig fügen Sie das endgültige Volumen des Mediums (etwa 900 ul) in der MEA-Ring. Aufrechterhaltung der 3D-Kulturen in einem befeuchteten CO _{2 -Atmosphäre} (5%) bei 37 ° C für 4-5 Wochen. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums einmal pro Woche.

5. konfokale Mikroskopie Acquisition

1. Fixierung der biologischen Proben auf der Bühne des Mikroskops in einer Halterung. Stellen Sie den Laser (Argon, 496 bis 555 nm), der Abtastgeschwindigkeit (400 Hz), bei dem, um das Bild, das Gain und Offset (-0,3%) der PMT für jedes Bild zu erwerben, um die richtige Bandbreite Emissionsfilter und um zu erfassen um eine Sättigung zu vermeiden und um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Ergebnisteil meldet die verwendet werden, um die Bilder von 4 zu erwerben Werte.
2. Für den Erwerb der z -stack Sequenz, Tannest wählen, den Wert der z-Position der oberen und der unteren Schicht der Probe, und wählen Sie dann die Schrittweite auf die Übernahme vorzunehmen.

Ergebnisse

. In diesem experimentellen Verfahren wird eine relevante Rolle der Mikrokügelchen, die die mechanische Gerüst für das Wachstum des 3D neuronales Netzwerk definieren gespielt 1A und B-Anzeige, die die Anordnung der Mikrokügelchen (Nenndurchmesser von 40 ± 2 um; zertifiziert mittlere Durchmesser 42,3 ± 1,1 & mgr; m) in der Ebene. Die Besonderheit solcher Strukturen besteht darin, daß Mikrokügelchen spontan selbst zusammensetzen, die einen kompakten hexagonalen Geometrie (1B und C).

Diskussion

In dieser Arbeit wird eine neuartige experimentelle in vitro-Plattform aus 3D gemacht entwickelt neuronalen Kulturen auf MEAs für Netzwerk-Elektrophysiologie wurde vorgestellt gekoppelt. Die Verwendung von Mikrokügelchen als Gerüst, um das Auswachsen neuritischen entlang der z-Achse zu ermöglichen wurde maßgeschneidert, um mit der planaren MEA integriert werden. Auf diese Weise können die erhaltenen Mikrosystem ergibt eine gültige und zuverlässige in vitro- 3D-Modells, um die austreten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5mg/liter
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1gr Glass Part.Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L