Cultures interface 3D Engineered neuronales à des micro-électrodes tableaux: Une innovante<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle expérimental

Résumé

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Résumé

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 µm in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Introduction

In vitro en deux dimensions (2D), les réseaux de neurones couplés à micro-électrodes (AME) Arrays arethe modèle expérimental étalon-or adoptée pour étudier l'interaction entre les dynamiques neuronales et de la connectivité sous-jacente. Lors du développement, les neurones de recréer des réseaux complexes qui affichent ainsi l'activité definedspatio-temporalpatternsof ^1,2 (ie, des éclats, des éclats de réseau, l'activité de dopage aléatoire). AME enregistrent l'activité électrophysiologique de nombreux sites (de quelques dizaines à des milliers de microélectrodes), permettant une étude détaillée de la dynamique exprimées au niveau du réseau. En outre, l'utilisation de cultures dissociées rend possibile de concevoir-réseaux d'ingénierie. Il est plus facile de comprendre de cette manière les relations fonctionnelles entre l'activité électrophysiologique enregistrées et les paramètres de l'organisation de réseau comme la densité cellulaire ^3, degré de modularité ^4,5, la présence de la pop neuronale hétérogèneglement ^6, etc. Cependant, toutes les études in vitro sur des cellules en culture dissociés sont basés sur des réseaux neuronaux 2D. Cette approche conduit à des simplifications excessives par rapport à la (intrinsèquement 3 dimensions 3D) système in vivo: (i) dans un modèle 2D, Somata et de croissance cônes sont aplaties et l'excroissance des axones-dendrites peut pas se propager dans toutes les directions ^7. (ii) 2D in vitro réseaux exposition stéréotypé dynamique électrophysiologiques dominés par l'éclatement activité impliquant la plupart des neurones du réseau ^8.

Récemment, différentes solutions ont été développées pour permettre la construction d'dissocié in vitro 3D réseaux neuronaux. L'idée commune consiste à créer un échafaudage où les neurones peuvent se développer dans un mode 3D. Un tel échafaudage peut être réalisé avec des gels de polymères et de matrices poreuses solides ^9-13. En exploitant les propriétés mécaniques des polymères, il est possible d'incorporer des cellules à l'intérieur thesstructures de e en définissant un bloc uniforme des cultures 3D de neurosphères ^11. La principale caractéristique de cette approche est la propriété mécanique rigide des neurosphères ^9,12. Cependant, ces matériaux ont une porosité limitée, et ils ne garantissent pas la migration des cellules à l'intérieur de la matrice. Pour pallier cet inconvénient, une solution possible consiste à découper la matrice en modules de «base». Malheureusement, la taille et la forme de la diversité des particules pourrait entraver l'emballage dans des structures en couches régulières. Dans ^7, Cullen et ses collègues ont conçu une construction neuronale 3D constitué de neurones et / ou des astrocytes dans un extracellulaire échafaudage à base de matrice bioactive. Un tel tissu neural conçu permis dans les enquêtes in vitro pour étudier et manipuler les réponses neurobiologiques dans des micro-environnements 3D. Ce modèle est composée de neurones et de cellules gliales distribuées dans toute la matrice extracellulaire (ECM) et / ou des échafaudages d'hydrogel (500 à 600 pm d'épaisseur). Dans ce condition, une viabilité cellulaire optimale (supérieur à 90%) a été trouvée en étalant les cellules à une densité finale d'environ 3750 - 5000 cellules / mm ^3. Il est à noter qu'une telle valeur de densité est beaucoup plus faible que celle de la condition in vivo, où la densité de cellules du cortex cérébral de souris est d'environ 90 000 cellules / mm ^{3 14.} Pour surmonter cette limitation Pautot et ses collaborateurs ¹⁵ réalisé un système 3D in vitro où la densité cellulaire et la connectivité réseau sont contrôlés à ressembler à des conditions in vivo, tout en permettant l'imagerie en temps réel du réseau. En pratique, ce procédé est basé sur le concept que dissociées sont des neurones en culture capable de croître sur des microbilles de silice. Ces perles offrent une surface assez grande pour les corps cellulaires neuronaux à respecter et pour leurs arborisations à grandir, mûrir, étendre, et de définir des contacts synaptiques avec d'autres neurones croissance. Cette méthode exploite les propriétés d'assemblage spontané de perles mono-dispersées à form 3D couches réseaux hexagonaux contenant des sous-ensembles distincts de neurones sur des couches différentes avec la connectivité entre les neurones contraint sur différentes perles. La densité cellulaire obtenue avec cette méthode était d'environ 75 000 cellules / mm ^3.

Récemment, nous avons adapté la méthode de Pautot aux AME ^16: les résultats obtenus montrent que l'activité électrophysiologique 3D présente un répertoire plus large d'activités que celui exprimé par des réseaux 2D. Cultures matures 3D présentent une dynamique améliorée dans laquelle les deux rafale de réseau et aléatoire l'activité de pointe coexistent. De même, Tang-Schomer et ses collaborateurs ont réalisé ¹⁷ un échafaudage poreux à base de protéine de soie qui maintient une culture corticale primaire in vitro pour plusieurs mois, et enregistré l'activité électrophysiologique à l'aide d'une électrode en tungstène.

Dans ce travail, les procédures expérimentales de construire des réseaux neuronaux 3D couplés à AME sera décrite.

Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par la législation européenne de protection des animaux (2010/63 / UE), par le ministère italien de la Santé, conformément à la DL 116/1992 et par les lignes directrices de l'Université de Gênes (Prot. N. 13130, mai 2011). Tous les efforts ont été faits pour réduire le nombre d'animaux pour le projet et pour minimiser leur souffrance.

1. Préparation des matériaux et supports

1. Construire le moule pour construire les PDMS (Poly-diméthyl-siloxane) contrainte au moyen d'un CNC (commande numérique par ordinateur) fraiseuse. Un tel moule est réalisé en polycarbonate avec le cylindre central en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Ce matériau permet une extraction plus facile du masque une fois que le PDMS a durci.
   REMARQUE: La conception du moule a été réalisé par Computer-Aided-Design (CAD), puis livré à la fraiseuse CNC.
2. Préparer l'élastomère PDMS. PDMS est un polymère organique. Il est composé de deux éléments, Un agent de durcissement et un polymère. Mélangez par un rapport en volume de 1:10, une partie d'agent de durcissement et neuf parties de polymère. Mettez les deux composants dans une boîte de Pétri, secouez et insérez le mélange dans la chambre à vide pendant 10 min pour éliminer les bulles d'air. 3 g de PDMS sont suffisantes pour une contrainte.
3. Construire la contrainte PDMS. Insérez le matériau PDMS dans le mouleur et le mettre dans le four pendant 30 min à 120 ° C. La contrainte PDMS a la forme d'un cylindre idéal avec un diamètre externe et interne de 22,0 mm et 3,0, respectivement, et une hauteur de 650 pm.
4. Le jour avant le placage, coupler le masque à la zone active des réseaux de micro-électrodes (AME) à l'aide d'une pince à épiler sous un stéréomicroscope et stériliser le masque PDMS dans le four à 120 ° C.
5. Stériliser les microbilles de verre (diamètre nominal de 40 ± 2 um; diamètre moyen de 42,3 ± certifié 1,1 pm) dans 70% d'éthanol pendant 2 heures dans un flacon conique et tourner evEry 30 min pour exposer tous les microbilles.
6. Retirer la solution d'éthanol à partir de la fiole et les microbilles rincer deux fois avec de l'eau stérilisée.
7. Conditionner la partie centrale de la zone délimitée par la MEA masque PDMS (diamètre égal à 3,0 mm) avec 24 ul d'une solution mixte de Poly-D-Lysine et laminine à 0,05 ug / ml.
8. Enduire les microbilles avec des protéines d'adhérence, de la laminine et de poly-D-lysine à 0,05 ug / ml et de les laisser pendant une nuit à l'étuve à 37 ° C, pour obtenir un réseau neuronal stable et de longue durée.
9. Retirer les facteurs d'adhésion à la fois à partir de la surface du verre de la MEA et de microbilles de verre. Aspirer environ 95% de la solution de revêtement avec une pipette et appliquer une petite 24μl- en volume d'eau stérile à la surface du MEA. Aspirer à nouveau plus de 95% de l'eau et laissez la MEA à sec sous le capot laminaire pendant 1 h avant l'ensemencement des cellules.
   NOTE: Dans le cas de microbilles place, aspirer le revêtementsolution et faire un premier lavage avec de l'eau stérilisée et un second avec le milieu de base et son supplément comme B27, afin de conditionner la surface de verre où les neurones seront étalées. Ne laissez pas les microbilles sec. Les laisser en suspension dans le milieu de culture à l'intérieur du flacon.
10. Distribuer, au moyen d'une pipette -200 μl-, la suspension de microbilles traités (environ 32 000) sur une plaque à puits multiples avec insert de membrane (diamètre des pores 0,4 pm), où ils auto-assemblage formant une couche uniforme.
11. Remplir chaque puits de la membrane avec 0,5 ml de milieu et le mettre dans l'incubateur (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) jusqu'à ce que les neurones sont prêts à être plaqué (3.2).

2. Dissection d'embryons et de la dissociation des tissus

1. Maison rats femelles adultes (200-250 g) à une température constante (22 ± 1 ° C) et l'humidité relative (50%) selon un calendrier clair-obscur régulière (la lumière sur les sept heures-19 heures) dans leanimalerie. Veiller à ce que la nourriture et l'eau sont disponibles gratuitement.
2. Anesthésier un rat femelle enceinte après 18 jours de développement (E18) en utilisant 3% d'isoflurane. Ensuite, sacrifier l'animal par dislocation cervicale.
3. Retirer hippocampes de l'embryon de rat et les placer dans une solution saline équilibrée de la glace froide de Hank sans Ca ^{2+ et Mg} 2+. Au jour 18 de l'hippocampe de développement et de tissus de cortex sont très doux et ne nécessitent pas d'être coupé en petits morceaux. De plus amples détails peuvent être trouvés ^18,19.
4. Dissocier le tissu à 0,125% de solution de trypsine / 0,05% de Hank contenant de 18 à 20 pour la DNAse min à 37 ° C.
5. Retirer la solution de surnageant avec une pipette Pasteur et arrêter la digestion enzymatique par addition de milieu avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) pendant 5 min.
6. Retirer le moyen de FBS et laver une fois avec du milieu avec son complément, 1% de L-glutamine, la gentamicine 10 ug / ml. Retirer à nouveau le milieu avec un pip Pasteurette et remplir à nouveau avec une petite quantité (500 pi) de milieu de croissance avec son complément, 1% de L-glutamine, la gentamicine 10 ug / ml.
7. Dissocier le culot tissulaire mécaniquement avec une pipette Pasteur étroite jusqu'à une suspension laiteuse de cellules est apparent. Il est pas nécessaire de centrifuger la suspension cellulaire.
8. Diluer le faible volume de suspension de cellules avec le milieu de croissance pour obtenir un volume final de 2,0 ml. Compter le concentration cellulaire obtenue avec une chambre de hémocytomètre. Diluer cette concentration à 1: 5 pour obtenir la concentration souhaitée de cellules de 600-700 cellules / ul.

3. Cellule Placage

1. Cellules de la plaque à une densité d'environ 2000 cellules / mm ² sur la zone active de la MEA, définis par la contrainte de PDMS pour créer un réseau neuronal 2D.
   NOTE: Chaque hippocampe contient environ 5 x 10 ⁵ cellules, (1 x 10 ^{6 pour} un seul embryon). Disséquer 6 embryons pour obtenir un montant total de 6 x 10^{6 cellules} dans 2 ml, et une concentration d'environ 3.000 cellules / ul. Diluer cette concentration à 1: 5 pour obtenir la concentration souhaitée de la cellule et la plaque environ 600-700 cellules / ul. Si la zone de MEA délimitée par la contrainte est d'environ 7,065 PDMS mm ^2, et le nombre total de cellules étalées à 600 cellules / ul ul x 24 = 14.400 cellules, la densité finale de 2.038 cellules / mm ^2.
2. Placez les dispositifs de MEA dans l'incubateur humidifié avec _atmosphère de CO 2 (5%) à 37 ° C.
3. Distribuer 160 pl de la suspension à une concentration cellulaire de 600-700 cellules / ul (environ 100 000 cellules) sur la surface de la monocouche de microbilles placée à l'intérieur des plaques multipuits pour terminer l'étape préliminaire à la construction de culture en trois dimensions. Mettre les plaques à puits multiples dans l'incubateur humidifié avec _atmosphère de CO 2 (5%) à 37 ° C.

4. Construction 3D Neuronal réseau

1. 6-8 heures après le placage, transférer la suspension (microbilles avec les neurones) des plaques à puits multiples très soigneusement l'intérieur de la zone délimitée par la contrainte PDMS en utilisant une pipette fixé pour un volume d'environ 30-40 ul. Après chaque transfert, attendez pendant environ une demi-minute, pour permettre aux microbilles se auto-assembler dans une structure hexagonale compacte.
2. Une fois toutes les couches sont déposées et spontanément assemblés, remplir avec une forte baisse d'environ 300 pi de milieu du haut de la zone délimitée par la contrainte PDMS.
3. Mettre la structure 3D couplée à la MEA dans l'incubateur (T = 37,0 ^{° C,} CO ₂ = 5%) pendant 48 heures avant d'ajouter un volume final (environ 1 ml) de milieu de croissance avec la culture de son complément.
   NOTE: Considérons le nombre total de perles sur les plaques à puits multiples avec insert de membrane (30 000) et le nombre de perles sur une seule couche sur le dispositif de MEA (6000). La structure 3D résultante se compose de 5 couches de microbeads et des cellules. Tenant compte du fait que le réseau neuronal 3D est pas géométriquement parfaite, la structure 3D qui en résulte pourrait être composé de 5-8 couches.
4. Le jour après l'étalement, ajouter soigneusement le volume final du milieu (environ 900 pi) à l'intérieur de l'anneau de MEA. Maintenir les cultures 3D dans une atmosphère humidifiée _de CO2 (5%) à 37 ° C pendant 4-5 semaines. Remplacer la moitié du milieu une fois par semaine.

5. microscopie confocale Acquisition

1. Fixer les échantillons biologiques à l'étape du microscope dans un support. Réglez le laser (Argon, de 496 à 555 nm), la vitesse de balayage (400 Hz) à laquelle d'acquérir l'image, le gain et l'offset (-0,3%) de PMT pour chaque image pour capturer le filtre bande passante d'émission correcte et dans l'ordre pour éviter la saturation et à augmenter le rapport signal à bruit. La section Résultats rapporte les valeurs utilisées pour acquérir les images de la figure 4.
2. Pour l'acquisition de la séquence z -stack, sapinst sélectionner, la valeur de z position de la partie supérieure et la couche inférieure de l'échantillon, puis sélectionnez la taille de l'étape pour faire l'acquisition.

Résultats

. Dans ce mode opératoire, un rôle important est joué par les microbilles qui définissent l'échafaudage mécanique pour la croissance du réseau neuronal 3D figures affichage 1A et B la disposition des microbilles (diamètre nominal de 40 ± 2 um; diamètre moyen certifiée de 42,3 ± 1,1 pm) dans le plan. La particularité de ces structures est que microbilles auto assembler spontanément définissant une géométrie hexagonale compacte (figure 1B et C). L'...

Discussion

Dans ce travail, un roman expérimental dans la plateforme vitro constitué de 3D ​​conçu cultures de neurones couplés à AME pour électrophysiologie de réseau a été présenté. L'utilisation des microbilles comme échafaudage pour permettre au long de l'excroissance neuritique axe des z a été adapté pour être intégré avec le MEA plane. De cette façon, les résultats micro-système obtenus dans un modèle in vitro 3D valide et fiable pour étudier la dynamique électro...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0.05 µg/ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	0.05 µg/ml
Trypsin	Gibco	25050-014	0.125% diluted 1:2 in HBSS w\o CA++, MG++
DNAase	Sigma-Aldrich	D5025	0.05% diluted  in Hanks solution
Neurobasal	Gibco Invitrogen	21103049	culture medium
B27	Gibco Invitrogen	17504044	2% medium supplent
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	10%
Glutamax-I	Gibco	35050038	0.5 mM
gentamicin	Sigma-Aldrich	G.1272	5mg/liter
Poly-Dimethyl-Siloxane (PDMS)	Corning Sigma	481939	curing agent and the polymer
Micro-Electrode Arrays	Multi Channel Systems (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA with: Electrode grid 8x8; Electrode spacing and diameter 200 and 30 µm, respectively; plastic ring without thread
Microbead	Distrilab-Duke Scientific	9040	1gr Glass Part.Size Stds 40 µm
Transwell	Costar Sigma	CLS 3413	multiwell plates with membrane insert (6.5 mm diameter porous 0.4 µm)
HBSS w\o Ca++ ,Mg++	Gibco Invitrogen	14175-052
Hanks Buffer Solution	Sigma	H8264
Teflon	Sigma	430935-5G	polytetrafluoroethylene
Rat	Sprague Dawley	Wistar Rat
Confocal Microscopy Upright	Leica	TCS SP5 AOBS
20.0x0.50 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
40.0x0.80 WATER objective	Leica	Leica HCX APO L U-V-I
25.0x0.95 WATER objective	Leica	HCX IRAPO L