ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-

Summary

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Abstract

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

Introduction

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

Protocol

بيان الأخلاق: وقد أجريت الدراسة المشيمة البشرية مستقبلا، مع موافقة مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث البشري من جامعة كوريا (AN09085-001). أجريت جميع التجارب في-جرثومة الحرة منشأة غرفة نظيفة في المركز الطبي لجامعة كوريا. تمت الموافقة على تصميم والإجراءات باستخدام hPSCs التجريبي من قبل مجلس المراجعة المؤسسية من المركز الطبي في جامعة كوريا (AN12277-003).

1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق

1. معطف جميع الأطباق الثقافة بنسبة 0.1٪ الجيلاتين. المالحة الأوتوكلاف الفوسفات مخزنة (PBS) وملقط. تعقيم مقص جراحي، أنابيب microcentrifuge، والشاش على 121 درجة مئوية تحت £ 15 رطل لمدة أكثر من 15 دقيقة.
2. 0.25٪ التربسين الاثيلين أمين رباعي حمض الخل استعداد استعد مسبقا (التربسين-EDTA) واستعد مسبقا سائل الإعلام والثقافة تصفيتها (DMEM) تحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 U / البنسلين مل، و 100 غرام / مل streptomycقبل البدء في الإجراءات.

2. عزل الخلايا من المشيمة البشرية

1. الحصول على أنسجة المشيمة بعد ولادة قيصرية قسم الولادة، من النساء الحوامل صحية تمر الإجهاض الطبيعي أو العلاجي في 7-32 أسبوعا من الحمل بعد الحصول على الموافقة المسبقة الخطية.
2. لدينا أخصائي الولادة المشيمة البشرية لوحات المشيمي منفصلة جراحيا (HPCS) من المشيمة. احتضان هذه في 0.25٪ التربسين-EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم يغسل مع 5 مل PBS.
3. عزل الزغابات المشيمية من HPCS باستخدام مقص. تخطر على الزغابات وغسلها ثلاث مرات مع 1ML PBS. بعد تنميق، ضع الزغابات المشيمية في أنبوب microfuge باستخدام طرف ماصة. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS التي pipetting صعودا وهبوطا، وأنابيب الطرد المركزي لمدة 120 x ج لمدة 3 دقائق. غسل الأنسجة مرتين مع 500 ميكرولتر من قبل تحسنت مستنبت.
4. خلايا الثقافة في المتوسط ​​على لوحات الجيلاتين المغلفة في 37 ° C، في 5٪ CO ₂ ، وتحت 95٪ الرطوبة. قبل معطف جميع لوحات مع الجيلاتين 0.1٪ لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. سوف مستعمرات الخلايا مثل الخلايا الليفية تشكيل ونمو ملتصقة ما يقرب من 5-7 أيام بعد بدء الثقافة في نفس المتوسطة.
5. تبادل المتوسطة كل 2-3 أيام حتى مرور الثالث. خلال الثقافة، وإزالة الحطام الخلية عائمة في مستنبت. وتزايد الخلايا الليفية الرحمية نعلق على طبق من ذهب. ثقافة الخلايا مثل الخلايا الليفية المستمدة من HPC حتى مرور 10 ^عشر ثم حصادها للثقافات HESC بعد trypsinization وميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) العلاج.
6. قبل التجميد HPCS كعينات الاسهم، استخدم عكس النسخ-البلمرة المتسلسل (RT-PCR) للتأكد من أن HPCS ليست ملوثة مع مسببات الأمراض التي تصيب عادة المشيمة، بما في ذلك الميكوبلازما (M. المخمرة، M. الأنافية الخنزيرية، M. ارجينين، M . الفويهى، M. اللعابية، M. هومينيس، M. للرئة، M. arthritidis، M. neurolyticum، M. hyopneumoniae،وM. capricolum) والأنواع البكتيرية، الميورة الحالة لليوريا، وذلك باستخدام مجموعة الكشف عن الميكوبلازما.
   1. اتبع تعليمات الشركة الصانعة لأداء RT-PCR، استخدم كل الاشعال ومخاليط المنصوص عليها في عدة. استخدام supernatants من الخلايا التي تم زراعتها لمدة 36 يوما للكشف عن الميكوبلازما. إضافة 3 ميكرولتر من هذه العينات لمخاليط PCR وتنفيذ الإجراء 1 ^ش PCR لمدة 35 دورات، يتألف كل منها من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 55 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
   2. إضافة بعناية 0.5 ميكرولتر من 1 ^الحادي PCR المنتج إلى خليط PCR وتنفيذ الإجراء 2 ^{الثانية} PCR لمدة 30 دورات باستخدام نفس الشروط كما كان من قبل. تحليل المنتجات تضخيمها من قبل 1٪ هلام الاغاروز الكهربائي. تطبيق 10 ميكرولتر من كل من ^شارع 1 و 2 ^{الثانية} المنتجات PCR إلى المواد الهلامية.
7. إذا تم العثور على HPCS أن تكون ملوثة مع مسببات الأمراض، والقضاء على هذهباستخدام مزيج من المضادات الحيوية (BM-السيكلين)، باتباع إرشادات الشركة المصنعة. إضافة الوسيلة الجديدة التي تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من BM-السيكلين 1 لمدة 3 أيام، ثم علاج الخلايا مع 5 ميكروغرام / مل BM-السيكلين 2 لمدة 4 أيام أخرى. كرر هذه الدورة مرتين ومن ثم التحقق من وجود تلوث الميكوبلازما مرة أخرى.

3. خلايا حصاد الإنسان المشيمة المستمدة مكيفة متوسط ​​(hPCCM)

1. بعد استبعاد التلوث، وعلاج الخلايا المرفقة (85-90٪ التقاء؛ (1.5 × 10 ⁷ خلايا / قارورة) مع ميتوميسين-C (10 ميكروغرام / مل) لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة، ويغسل خلايا ثلاث مرات مع 10 مل برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع المتوسط ​​قبل تحسنت دون ميتوميسين-C لمدة 24 ساعة.
2. بعد يوم واحد من العلاج، واحتضان خلايا في 10 مل المتوسطة (DMEM-F12 تستكمل مع 20٪ خروج المغلوب المصل استبدال [KOSR]، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 1٪ NEAA، و 1٪ البنسلين ستربتومايسين). بعد 24 ساعة من الحضانة، والحصاد CM في أنبوب مخروطي 15 مل وتصفية CM باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
3. إضافة 10 مل أخرى من الوسيلة الجديدة والحضانة. جمع كل supernatants من ثقافات كل يوم لمدة 1 أسبوع وتجميد المتوسطة تحصد في -80 ° C. تجنب تكرار تجميد أذاب دورات.

4. ثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) وتحريض الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)

1. الحصول الجنينية خطوط الخلايا الجذعية البشرية، H1 و H9 الخلايا (المدرجة في التسجيل NIH HESC تحت اسم WA01 وWA09، على التوالي) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة التوجيهية-1: الجذع (القلفة) -1 والتوجيهية 2 (IISH1i- BM) من معهد أبحاث معهد ويسيل (ماديسون، WI، الولايات المتحدة الأمريكية). يجب إذابة الخلايا ومثقف باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
2. لمجموعة المراقبة، وخلايا الثقافة على أطباق الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة في استخدامها على نطاق واسع تحديدا مستنبت حرة المصل خالية من وحدة التغذية وعند 37 درجة مئوية و5٪ CO _2. في البداية، البذور 80-100 كتل من hPSCs طن 35 ملم الأطباق. تنمو الخلايا في هذه الأطباق حتى 70-80٪ التقاء وبشكل روتيني خلايا مرور لمرة واحدة كل 5-6 أيام، وذلك باستخدام الطرق الميكانيكية أو الأنزيمية (Dispase)، زراعة الفرعية. غسل الخلايا مرتين مع المتوسط ​​ومنها لوحة في نسبة 1: 4. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة كل يوم.
3. للمجموعات التجريبية، وخلايا الثقافة في hPCCM على الأطباق قبل المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪ وأداء الركض روتيني مرة كل 5 أيام، إما ميكانيكيا أو إنزيمي. لوحة الخلايا في نسب في حدود 1: 6-1: 10. hPSCs نعلق على الجيلاتين داخل 2 يوما بعد النقل. استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة يوميا.

5. توصيف المحفزة الإنسان الخلايا الجذعية

ملاحظة: توصيف hPSCs باستخدام عدة طرق، مثل تلطيخ الفوسفاتيز القلوية، مناعية، الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QRT-PCR)، والنشاف الغربي.

1. المناعي تلطيخ
   1. لimmunofluorescencالبريد تلطيخ، hPSCs ثقافة وإصلاح الخلايا في غرف الشريحة 8 جيدا مع 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق لمدة 10 دقيقة. ثم، permeabilized الخلايا بنسبة 0.1٪ (V / V) تريتون-X100 لمدة 15 دقيقة، ومنع الخلايا لمدة 1 ساعة مع 3٪ (V / V) مصل الحصان العادي في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ (V / V) Tween- 20. يغسل PBS مرتين لمدة 5 دقائق بين كل خطوة.
   2. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية (OCT-4، SSEA4، TRA-1-81، TRA-1-60، التخفيف من 1: 1000) O / N عند 4 درجات مئوية ومع الأجسام المضادة الثانوية.
   3. قبل التركيب، واحتضان الخلايا مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 5 دقائق في الظلام. غسل الخلايا بشكل صارم ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل والجافة الخلايا تماما، في الظلام. الحفاظ على الخلايا في مضان المتوسطة المتزايدة وننظر إليها تحت المجهر مضان.
2. QRT-PCR
   1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام عدة RNeasy مصغرة وفقا لمواصفات الشركة الصانعة وتحديد الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام نانو قطرة مقياس الطيف الضوئي.
   2. توليف [كدنا بإضافة 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لتحتوي بنسبة ضئيلة 20 ميكرولتر خليط التفاعل (DT) الاشعال ومرتفع II عكس الناسخ. اتبع تعليمات الشركة الصانعة في هذا الإجراء.
   3. تضخيم كدنا] توليفها مع نظام معدل الذكاء بيو راد iCycler، وذلك باستخدام معدل الذكاء SYBR الأخضر QPCR ميكس ماجستير وتسلسل التمهيدي هو موضح في الجدول التكميلي S1. تطبيع القيم عتبة دورة من الجينات التي تهم تلك نازعة غليسيرألدهيد-3-فوسفات (GAPDH).
3. الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلطيخ
   1. كشف النشاط AP باستخدام خلية ES توصيف كيت، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   2. في يوم 5، ونضح وسائل الإعلام وإصلاح hPSCs مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 12 دقيقة. لا overfix. وتحديد الخلايا لمدة تزيد عن 2 دقيقة يؤدي إلى تثبيط إنزيم الفوسفاتيز القلوية. نضح تثبيتي، وشطف مع 1X شطف العازلة. لاتسمح الآبار لتجف بين الخطوات.
   3. إضافة ما يكفي من حل تلطيخ لتغطية كل بئر (1 مل لكل بئر من صحن 35 ملم). احتضان لوحات في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
   4. بعد الحضانة، وغسل الصحون مع 1X شطف العازلة. تغطية الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X لمنع جفاف ودراسة وصورة الخلايا الملون باستخدام مجهر أوليمبوس.
4. البقعة الغربية
   1. إجراء تحليل لطخة غربية كما هو موضح سابقا في ^9. لفترة وجيزة، وتحديد تركيزات البروتين في الخلية لست]. حل كميات متساوية من البروتين على دوديسيل الصوديوم وكبريتات بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS-PAGE) جل ونقل البروتينات على غشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF).
   2. منع وصمة عار وتحقيق ذلك O / N مع الأجسام المضادة الأولية المختلفة في 4 ° C؛ في وقت لاحق احتضان وصمة عار مع الأجسام المضادة الثانوية HRP-مترافق لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة بين حضانات. كشف الإشارات باستخدام كاشف ECL.
5. قصيرة جنبا إلى جنب كرر (STR) تحليل
   1. كانت تحصد hPSCs من السيطرة والمجموعات التجريبية في نفس المقطع. تم استخراج DNA الجينومية باستخدام طقم DNA مايكرو، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   2. تضخيم الحمض النووي الجيني لمدة 16 المكاني وراثية مختلفة باستخدام أدوات AmpF / STR PCR التضخيم، وفقا لمواصفات الشركة الصانعة والكهربائي الشعري أجريت باستخدام محلل الوراثية.

النتائج

ومن مزايا هذه الطريقة نشر hPSC هو أنه يستخدم مكونات يفرز من خلايا الإنسان. والخطوة الأكثر ciritical في البروتوكول هو العزلة والثقافة من الخلايا المشتقة من المشيمة البشرية. وهذا يتطلب وتشريح دقيق من جزء محدد من HPC لوحة الزغب الشكل يظهر 1 إجراءات المستمدة من...

Discussion

وقد تم تطوير هذا النموذج إلى نشر بنجاح hPSCs، مع الحفاظ على خصائصها، وأنسنة ظروف ثقافة خالية من التغذية بدون إضافة عوامل النمو المؤتلف خارجية مثل bFGF أو الأنسولين، مما يتيح التلاعب hPSCs في المكروية أنسنة. bFGF مكملات خارجي هو شائع وتطبيق الطبقات التحتية مثل Matrigel أو Laminin الح?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.