A Novel cultura Modello pluripotenti staminali umane propagazione delle cellule su Gelatina in Media Placenta condizionata

Riepilogo

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Abstract

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

Introduzione

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

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Protocollo

Etica dichiarazione: Lo studio è stato condotto placenta umana prospetticamente, con l'approvazione del Institutional Review Board per la ricerca umana della University Korea (AN09085-001). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in un Germ-Free Clean facility in camera presso il Medical Center Korea University. Il design e le procedure che utilizzano hPSCs sperimentale sono state approvate dal Institutional Review Board della Korea University Medical Center (AN12277-003).

1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti

1. Coat tutti i piatti della cultura con il 0,1% di gelatina. Salino Autoclave tampone fosfato (PBS) e pinze. Sterilizzare forbici chirurgiche, tubi microcentrifuga, e garze a 121 ° C sotto £ 15 psi per più di 15 min.
2. 0,25% tripsina-etilene ammina tetra-acetico preparati pre-riscaldato (tripsina-EDTA) e mezzi di pre-riscaldato cultura filtrato (DMEM) contenente siero bovino fetale 20% (FBS), 100 U / ml di penicillina, e 100 g / ml streptomycin prima di iniziare le procedure.

2. Isolamento delle cellule da placenta umana

1. Ottenere tessuto placentare, dopo il parto cesareo, da parte delle donne sane in gravidanza normale fase di aborto o terapeutico a 7-32 settimane di gestazione dopo aver ottenuto il consenso informato scritto.
2. Hanno lo specialista ostetrico placenta umana piastre coriali chirurgicamente separati (HPC) dalla placenta; incubare questi in 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per 20 minuti, e poi lavare con 5 ml di PBS.
3. Isolare villi coriali da HPC con le forbici; Tritare i villi e lavarli tre volte con 1 ml di PBS. Dopo macinazione, posizionare i villi coriali in una provetta per microcentrifuga con un puntale; lavare i campioni con 500 microlitri di PBS pipettando su e giù, e centrifugare le provette per 120 xg per 3 min. Lavare tessuti due volte con 500 ml di terreno di coltura pre-riscaldata.
4. Cellule culturali in media su piastre di gelatina rivestite a 37 ° C, in 5% di CO ₂ , e sotto il 95% di umidità. Pre-coat tutti i piatti con lo 0,1% di gelatina per 1 ora a 37 ° C. Le colonie di cellule fibroblasto-simili formeranno e crescita aderente circa 5-7 giorni dopo l'inizio cultura nello stesso mezzo.
5. Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni fino al terzo passaggio. Durante la coltura, rimuovendo detriti cellulari galleggianti nel mezzo di coltura; crescita fibroblasti placentari si attaccheranno alla piastra. Coltivare le cellule di fibroblasti, come derivati ​​dal HPC fino al 10 ^° passaggio e poi li raccolgono per le culture hESC dopo tripsinizzazione e mitomicina-C (10 mg / ml) trattamento.
6. Prima di congelamento HPC come campioni azionari, utilizzare trascrizione inversa-polymerase chain reaction (RT-PCR) per confermare che HPC non sono contaminati da agenti patogeni che normalmente infettano la placenta, tra cui micoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,e M. capricolum) e le specie batteriche, Ureaplasma urealyticum, utilizzando un kit di rilevamento micoplasma.
   1. Seguire le istruzioni del produttore per effettuare RT-PCR, utilizzare tutte primer e miscele fornite nel kit. Utilizzare il surnatante delle cellule che sono state coltivate per 36 giorni per la rilevazione micoplasma. Aggiungere 3 ml di questi campioni per le miscele PCR ed eseguire la procedura 1 ^st PCR per 35 cicli, ciascuno costituito da 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 2 min, e 72 ° C per 1 min.
   2. Aggiungere con cautela 0,5 ml di 1 ^° prodotto PCR alla miscela PCR ed eseguire la procedura 2 ^° PCR per 30 cicli usando le stesse condizioni di prima. Analizzare i prodotti amplificati di 1% gel di agarosio; applicare 10 ml di ogni del 1 ^° e 2 ^° prodotti di PCR per i gel.
7. Se HPC si trovano ad essere contaminati da agenti patogeni, eliminarliutilizzando una combinazione di antibiotici (BM-ciclina), seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere un nuovo terreno contenente 10 mg / ml di BM-ciclina 1 per 3 giorni, e poi trattare le cellule con 5 mg / ml BM-ciclina 2 per altri 4 giorni. Ripetere questo ciclo per due volte e quindi verificare la presenza di contaminazione da micoplasma di nuovo.

3. Cellule raccolta umana Placenta derivati ​​condizionata Media (hPCCM)

1. Dopo aver escluso contaminazione, trattare le cellule attaccate (85-90% di confluenza, (1,5 × 10 ⁷ cellule / fiasco) con mitomicina-C (10 ug / ml) per 2 ore e 30 minuti, e le cellule lavate tre volte con 10 ml PBS. Incubare le cellule con mezzo di pre-riscaldato senza mitomicina-C per 24 ore.
2. Un giorno dopo il trattamento, incubare cellule in 10 ml di mezzo (DMEM-F12 integrato con il 20% di knock-out siero sostituzione [KOSR], 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 1% NEAA, e l'1% di penicillina-streptomicina). Dopo 24 ore di incubazione, il raccolto CM in un tubo da 15 ml efiltrata del CM con un filtro siringa da 0,22 micron.
3. Aggiungere altri 10 ml di nuovi media e di incubazione. Raccogliere tutte surnatanti dalle culture ogni giorno per 1 settimana e congelare il medium raccolto a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.

4. Cellule Cultura di staminali embrionali umane (hESC) e induzione di cellule staminali pluripotenti (iPSCs)

1. Ottenere linee di cellule staminali embrionali umane, H1 e H9 cellule (elencati nel Registro NIH hESC con il nome di WA01 e WA09, rispettivamente) e di cellule staminali indotte pluripotenti-IPSC-1: iPS (prepuzio) -1 e IPSC-2 (IISH1i- BM) dal Research Institute WiCell (Madison, WI, USA). Le cellule devono essere scongelati e coltivate seguendo le istruzioni del produttore.
2. Per il gruppo di controllo, le cellule di coltura su piatti matrice di membrana basale rivestite in diffuso mezzo di coltura definito senza siero-libero-alimentazione e a 37 ° C e in 5% di CO _2. Inizialmente, sementi 80-100 ciuffi di hPSCs in 35 mm piatti. Crescere cellule in questi piatti fino a 70-80% di confluenza e di routine cellule passaggio per sub-coltura una volta ogni 5-6 giorni, con metodi meccanici o enzimatici (dispasi). Lavare le cellule due volte con terreno e li piastra in un rapporto di 1: 4. Sostituire il supporto con terreno fresco ogni giorno.
3. Per i gruppi sperimentali, le cellule di coltura in hPCCM sui piatti pre-rivestite con 0,1% di gelatina e di eseguire passaging di routine una volta ogni 5 giorni, sia meccanicamente o enzimatica. Cellule piastra a rapporti nella gamma di 1: 6-1: 10. hPSCs allegare alla gelatina entro 2 giorni dopo il trasferimento. Sostituire il supporto con terreno fresco tutti i giorni.

5. Caratterizzazione di cellule staminali pluripotenti umane

NOTA: Caratterizzare hPSCs utilizzando diversi metodi, come la colorazione fosfatasi alcalina, immunocitochimica, quantitativa real-time PCR (qRT-PCR), e western blotting.

1. Immunofluorescenza
   1. Per immunofluorescence di colorazione, hPSCs cultura e fissare le cellule nelle camere di scorrimento 8 pozzetti con il 4% (w / v) paraformaldeide per 10 minuti; poi, le cellule permeabilizzate con 0,1% (v / v) Triton-X100 per 15 min, e bloccare le cellule per 1 ora con 3% (v / v) di siero di cavallo normale in PBS contenente 0,1% (v / v) Tween- 20. Lavare PBS due volte per 5 minuti tra ogni passo.
   2. Incubare le cellule con l'anticorpo primario (ottobre-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, diluizione di 1: 1.000) O / N a 4 ° C e con l'anticorpo secondario.
   3. Prima del montaggio, incubare le cellule con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti al buio. Lavare le cellule rigorosamente tre volte per 5 minuti ciascuno e secche cellule completamente, nel buio. Conservare le cellule in mezzo di montaggio fluorescenza e osservarli al microscopio a fluorescenza.
2. qRT-PCR
   1. Isolare RNA totale da cellule utilizzando un kit RNeasy mini secondo le specifiche del produttore e quantificare l'RNA estratto utilizzando un Nano goccia spettrofotometro.
   2. Sintetizzare cDNA aggiungendo 2 ug di RNA totale per un oligo contenente 20 microlitri miscela di reazione (dT) primer e Superscript II trascrittasi inversa; seguire le istruzioni del produttore in questa procedura.
   3. Amplificare il cDNA sintetizzato con un sistema iQ Bio-Rad iCycler, utilizzando iQ SYBR Green qPCR Master Mix e le sequenze di primer descritti nella tabella di riferimento S1. Normalizzare i valori di soglia ciclo dei geni di interesse a quelli di deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH).
3. La fosfatasi alcalina (AP) colorazione
   1. Rilevare l'attività AP utilizzando il cellulare ES Caratterizzazione Kit, secondo il protocollo del produttore.
   2. Il giorno 5, aspirare i media e fissare i hPSCs con paraformaldeide al 4% in PBS per 12 min. Non overfix; fissa cellule per più di 2 min comporterà l'inattivazione di fosfatasi alcalina. Aspirare il fissativo e lavare con 1x Sciacquare tampone. Noni pozzetti si asciughino tra i passaggi.
   3. Aggiungere soluzione colorante sufficiente a coprire ogni pozzetto (1 ml per pozzetto di un piatto da 35 mm). Incubare le piastre al buio a temperatura ambiente per 15 min.
   4. Dopo l'incubazione, lavare i piatti con 1x Sciacquare tampone. Celle di copertura con PBS 1x per prevenire l'essiccazione ed esaminare e immagine le cellule colorate utilizzando un microscopio Olympus.
4. Western Blot
   1. Eseguire l'analisi western blot come descritto in precedenza in ^9. In breve, determinare le concentrazioni di proteine ​​in lisati cellulari. Risolvere uguali quantità di proteine ​​su un gel elettroforesi solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) gel di sodio dodecil e trasferire le proteine ​​su un fluoruro di polivinilidene (PVDF) membrana.
   2. Bloccare la macchia e la sonda è O / N con anticorpi primari diversi a 4 ° C; successivamente incubare la macchia con anticorpi secondari HRP-coniugati per 1 ora. Lavare la membrana per tre volte per 10 minuti ogni volta tra incubazione. Rileva segnali mediante un reagente ECL.
5. Short Tandem Repeat (STR) Analisi
   1. hPSCs sono state raccolte dal controllo e gruppi sperimentali allo stesso passo. DNA genomico è stato estratto utilizzando un kit Micro DNA, secondo le istruzioni del produttore.
   2. Amplificare il DNA genomico per 16 loci genetici diversi utilizzando il kit CF / STR PCR amplificazione, secondo le specifiche del produttore e elettroforesi capillare è stata effettuata utilizzando un analizzatore genetico.

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Risultati

Un vantaggio di questo metodo di propagazione HPSC è che utilizza componenti secreti dalle cellule umane. Un passo più ciritical nel protocollo è l'isolamento e la coltura di cellule derivate da placenta umana. Ciò richiede ed accurata dissezione da una parte precisa di HPC piastra villi. La Figura 1 mostra la procedura per l'isolamento delle cellule derivate placenta umana. Questo processo è semplice e conveniente per l'isolamento delle cellule, e può essere facilmente eseguita entro ...

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Discussione

Questo modello è stato sviluppato per propagare successo hPSCs, pur mantenendo le loro caratteristiche, in condizioni di coltura privo di alimentazione umanizzati senza aggiunta di esogeni fattori di crescita ricombinanti come bFGF o insulina, consentendo la manipolazione di hPSCs in un microambiente umanizzato. Supplementazione esogena bFGF è comune e l'applicazione di substrati come Matrigel o laminina è essenziale per la coltura senza alimentatore di hPSCs ^14.

Questo pro...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.