Роман Культура модель человека плюрипотентных стволовых клеток Распространение на Желатин в Плацента-баром СМИ

Резюме

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Аннотация

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

Введение

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этика заявление: Исследование плаценты человеком был проведен перспективно, с одобрения Institutional Review Board в человеческой исследований Университета Кореи (AN09085-001). Все эксперименты проводились в чистом стерильном номер объекта в Медицинском центре Университета Кореи. Опытно-конструкторских и процедуры с использованием hPSCs были одобрены Институциональные наблюдательного совета Университета медицинского центра Корея (AN12277-003).

1. Подготовка инструментов, медиакультуры и блюда

1. Пальто все культуры блюда с 0,1% желатина. Автоклав забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), и щипцы. Стерилизовать хирургические ножницы, микроцентрифужных трубки и марлю в 121 ° С при 15lb фунтов на квадратный дюйм в течение более чем 15 мин.
2. Приготовленный подогретого 0,25% трипсина-этилен амин тетра-уксусную кислоту (трипсин-ЭДТА) и предварительно нагревают культуральную среду фильтруют (DMEM), содержащей 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл streptomycв перед началом процедуры.

2. Выделение клеток из плаценты человека

1. Получить плацентарной ткани, после кесарева сечения, от здоровых беременных женщин, которым нормальный или терапевтического аборта на 7-32 недель беременности, после получения письменного информированного согласия.
2. Имейте акушерской специалиста хирургическим отдельные человеческие плацентарные хориона пластины (HPCS) из плаценты; инкубировать их в 0,25% трипсин-ЭДТА при 37 ° С в течение 20 мин, а затем промывают 5 мл PBS.
3. Изолировать хорионический ворсинки от HPCS с помощью ножниц; фарш ворсинки и мыть им три раза 1 мл PBS. После измельчения, место ворсин хориона в пробирке с использованием пипетки; мыть образцы с 500 мкл PBS с помощью пипетки вверх и вниз, и центрифуги трубки на 120 мкг в течение 3 мин. Промыть ткань дважды 500 мкл подогретого культуральной среде.
4. Культуры клеток в среде на покрытые желатином пластин при 37 ° С, в 5% CO ₂ , а под 95% влажности. Предварительное покрытие все пластины с 0,1% желатина в течение 1 часа при 37 ° С. Колонии фибробластоподобных клеток и образует прилипший рост примерно 5-7 дней после начала культуры в той же среде.
5. не Обменять среду каждые 2-3 дня до третьего прохода. Во культуры, удалением клеточного дебриса, плавающие в культуральной среде; растущие плацентарные фибробласты приложить к пластине. Культура фибробластов-подобные клетки, полученные из КВД до ^10-го прохода, а затем собрать их для чЭСК культур после обработки трипсином и митомицин-C (10 мкг / мл) лечение.
6. Перед замораживанием HPCS как образцы акции, использовать обратный транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), чтобы подтвердить, что HPCS не загрязнены патогенными микроорганизмами, которые обычно инфицируют через плаценту, в том числе микоплазмы (M. fermentans, М. М. hyorhinis, аргинина, м . Orale, М. salivarium, М. Hominis, М. pulmonis, М. arthritidis, М. neurolyticum, М. hyopneumoniae,и "М. capricolum) и видов бактерий, Ureaplasma urealyticum, с помощью набора определения микоплазмы.
   1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы выполнить RT-PCR, использовать все праймеры и смесей, предусмотренные в комплекте. Используйте супернатантов клеток, которые были выращены в течение 36 дней для обнаружения микоплазм. Добавить 3 мкл этих образцов к ПЦР смеси и выполнять процедуру ^1-й ПЦР в течение 35 циклов, каждый из которых состоит из 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° С в течение 2 мин и 72 ° С в течение 1 мин.
   2. Осторожно добавляют 0,5 мкл ^1-го продукта ПЦР с ПЦР-смеси и выполнить процедуру ^2-й ПЦР в течение 30 циклов с использованием тех же условий, как и раньше. Анализ амплифицированных продуктов электрофорезом в 1% агарозном геле; применяют по 10 мкл каждого из ^1-й и ^2-й ПЦР-продуктов в гелях.
7. Если HPCS находят, загрязнены патогенами, устранить ихиспользуя комбинацию антибиотиков (БМ-циклин), следуя инструкциям изготовителя. Добавить среде, содержащей 10 мкг / мл BM-циклин 1 в течение 3 дней, а затем обработать клетки с 5 мкг / мл БМ-циклин 2 в течение еще 4 дней. Повторите этот цикл в два раза, а затем проверить на загрязнение микоплазмой снова.

3. Сбор плаценты человека клеток, полученных кондиционированной среды (hPCCM)

1. После исключения загрязнения, лечить прикрепленные клетки (85-90% слияния (1,5 × 10 ⁷ клеток / колба) митомицином-C (10 мкг / мл) в течение 2 ч и 30 мин и промывают клеткам три раза с 10 мл PBS. Инкубируйте клетки с подогретого среде без митомицина-С в течение 24 ч.
2. Через день после обработки, инкубировать клеток в 10 мл среды (DMEM-F12 с добавлением 20% нокаут-Serum Replacement [KOSR], 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 1% NEAA и 1% пенициллина-стрептомицина). После 24 часов инкубации, урожай см в 15-мл коническую пробирку ифильтровать см с помощью шприца 0,22 мкм фильтр.
3. Добавить еще 10 мл новой среды и инкубации. Собирают все супернатантов из культур каждый день в течение 1 недели и заморозить собранного среду при -80 ° С. Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания.

4. Культура эмбриональных стволовых клеток человека (ЭСК) и индукции плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

1. Получить линий эмбриональных стволовых клеток человека, H1 и H9 клеток (перечисленные в реестре НИЗ чЭСК под названием WA01 WA09 и, соответственно) и индуцированной плюрипотентных стволовых клеток IPSC-1: IPS (крайняя плоть) -1 и IPSC-2 (IISH1i- БМ) из научно-исследовательского института WiCell (Madison, WI, USA). Клетки должны быть разморожены и культивируют в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. В контрольной группе, культуры клеток на базальной мембране Матрица покрытием блюд широко используется в питатель-свободным и бессывороточной культуральной среде определяется при 37 ° С и в 5% СО _2. Первоначально семян 80-100 скопления hPSCs яN 35-мм блюда. не расти клетки в этих блюд до 70-80% слияния и регулярно прохождения клеток к югу от культивирования раз в 5-6 дней, с использованием механических или ферментативные методы (диспазу). Промыть клетки дважды среды и пластины их в соотношении 1: 4. Заменить среду свежей средой каждый день.
3. Для экспериментальных групп, культуры клеток в hPCCM на чашки, предварительно покрытые 0,1% желатином и рутинного пассирования раз в 5 дней, либо механически, либо ферментативно. Пластина клеток в соотношении в диапазоне от 1: 6-1: 10. hPSCs приложить к желатина в течение 2 дней после передачи. Ежедневно заменить среду свежей средой.

5. Характеристика человека плюрипотентных стволовых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Охарактеризуйте hPSCs используя несколько методов, таких как щелочной фосфатазы окрашивания, иммуногистохимии, количественный ПЦР в реальном времени (ПЦР-Qrt), и вестерн-блоттинга.

1. Окрашивание Иммунофлуоресценции
   1. Для immunofluorescencе окрашивания, культура hPSCs и фиксации клеток в камерах слайд 8-луночных с 4% (вес / объем) параформальдегида в течение 10 мин; Затем, проницаемыми клеток с 0,1% (об / об) Тритон-X100 в течение 15 мин, и блокировать клетки в течение 1 ч с 3% (объем / объем) нормального лошадиной сыворотки в PBS, содержащем 0,1% (об / об) Tween- 20. Вымойте PBS в два раза в течение 5 мин между каждым шагом.
   2. Инкубируйте клетки с первичными антителами (ОКТ-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, разведении 1: 1000) O / N при 4 ° С и с вторичным антителом.
   3. Перед установкой, инкубировать клетки 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в течение 5 мин в темноте. Вымойте клетки строго три раза в течение 5 мин каждый и сухие клетки полностью, в темноте. Сохранение клеток в среде флуоресценции монтажа и наблюдать их под флуоресцентным микроскопом.
2. Qrt-ПЦР
   1. Изолировать общей РНК из клеток с использованием RNeasy мини комплект в соответствии с требованиями завода-изготовителя и количественно извлеченный РНК, используя Nano падения спектрофотометра.
   2. Синтезируют кДНК добавлением 2 мкг суммарной РНК с 20-мкл реакционной смеси, содержащей олиго (дТ) праймеры и Верхний II обратной транскриптазы; следуйте инструкциям изготовителя в этой процедуре.
   3. Amplify синтезированной кДНК с системой IQ Bio-Rad прибора Icycler, используя IQ SYBR Green КПЦР мастер смеси и грунтовки последовательности, описанные в таблице S1 Дополнительному. Нормализовать пороговые значения цикла генов, представляющих интерес для тех, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH).
3. Щелочная фосфатаза окрашивание (AP)
   1. Обнаружение AP деятельность, используя ES Cell характеристика комплект, в соответствии с протоколом производителя.
   2. На 5-й день, аспирация СМИ и исправить hPSCs с 4% параформальдегидом в PBS в течение 12 мин. Не overfix; фиксации клеток в течение более 2 мин приведет к инактивации щелочной фосфатазы. Аспирируйте фиксатор и промыть 1x промывки буфером. Непозволяют скважин высохнуть между шагами.
   3. Добавьте достаточно окрашивания решение для покрытия каждую лунку (1 мл на лунку 35 мм блюдо). Планшеты инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
   4. После инкубации, мыть посуду с 1x промывки буфером. Обложка клетки с 1x PBS, чтобы предотвратить высыхание и изучить и изображения окрашенных клеток с использованием микроскопа Olympus.
4. Вестерн-блот
   1. Выполнение Вестерн-блоттинга, как описано выше в ^9. Вкратце, определения концентрации белка в клеточных лизатах. Решение равные количества белка на додецилсульфата натрия гель-электрофореза в полиакриламидном сульфат (SDS-PAGE) геля и передать на белки в поливинилиденфторид (ПВДФ) мембраны.
   2. Блок блот и исследовать его O / N с различными первичными антителами при 4 ° С; затем инкубируют блот с HRP-конъюгированные вторичные антитела в течение 1 часа. Вымойте мембраны три раза в течение 10 мин каждый раз между инкубации. Обнаружение сигналов с использованием реагента ECL.
5. Краткое Повторите Тандем (STR) Анализ
   1. hPSCs собирали из контрольной и экспериментальной групп на том же отрывке. Геномную ДНК экстрагировали с помощью набора ДНК Micro, в соответствии с инструкциями изготовителя.
   2. Amplify геномной ДНК для 16 различных генетических локусов, используя набор AMPF / STR ПЦР-амплификации, в соответствии с требованиями завода-изготовителя и капиллярного электрофореза проводили, используя генетический анализатор.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Одним из преимуществ этого метода распространения HPSC, что он использует компоненты, секретируемые из клеток человека. Наиболее ciritical шаг в протоколе является изоляция и культуры плацента-клеток, полученных человека. Это требует и точной рассечение от точного часть HPC пластины ворсинок...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Эта модель была разработана, успешно распространяться hPSCs, сохраняя их характеристики, в гуманизированных фидерных свободных условиях культивирования без добавления экзогенных рекомбинантных факторов роста, таких как оФРФ или инсулина, что позволяет манипулировать hPSCs в гуманизиров...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.