Una Cultura Modelo Novela de Pluripotentes Stem Cell Propagación de gelatina en Media Placenta acondicionado

Resumen

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Resumen

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

Introducción

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

Protocolo

Declaración de Ética: El estudio de la placenta humana se realizó de forma prospectiva, con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para la investigación humana de la Universidad de Corea (AN09085-001). Todos los experimentos se llevaron a cabo en un centro de la habitación-Germ gratuito Limpio en el Centro Médico de la Universidad de Corea. El diseño y los procedimientos que utilizan hPSCs experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad del Centro Médico de Corea (AN12277-003).

1. Preparación de instrumentos, medios de cultivo, y platos

1. Escudo todas las placas de cultivo con 0,1% de gelatina. Autoclave solución salina tamponada con fosfato (PBS) y fórceps. Esterilizar tijeras quirúrgicas, tubos de microcentrífuga y gasas a 121 ° C bajo 15 libras psi durante más de 15 min.
2. 0,25% de tripsina de etileno-amina-tetra acético ácido preparado pre-calentado (tripsina-EDTA) y los medios de pre-calentado de cultivo filtrado (DMEM) que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS), 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml streptomycen antes de comenzar los procedimientos.

2. Aislamiento de la célula de placenta humana

1. Obtener tejido placentario, después del parto cesárea, de las mujeres embarazadas sanas someterse aborto normal o terapéutica en 7-32 semanas de gestación después de obtener el consentimiento informado por escrito.
2. Tener el especialista obstétrica placas coriónica placenta humana quirúrgicamente separadas (HPC) de la placenta; incubar estos en 0,25% de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 20 min, y luego se lava con 5 ml de PBS.
3. Aislar vellosidades coriónicas de HPC utilizando tijeras; pelos en las vellosidades y lavarlos tres veces con 1 ml de PBS. Después de picar, colocar las vellosidades coriónicas en un tubo de microcentrífuga utilizando una punta de pipeta; lavar las muestras con 500 l de PBS por pipeteando arriba y abajo, y centrifugar los tubos durante 120 xg durante 3 min. Lavar dos veces con tejidos 500 l de medio de cultivo pre-calentado.
4. Células de cultivo en un medio en placas recubiertas de gelatina a 37 ° C, en 5% de CO ₂ , y en 95% de humedad. Pre-coat todas las placas con gelatina al 0,1% durante 1 hora a 37 ° C. Las colonias de células similares a fibroblastos formarán y crecimiento adherente aproximadamente 5-7 días después de comenzar la cultura en el mismo medio.
5. Intercambiar el medio cada 2-3 días hasta el tercer pasaje. Durante el cultivo, la eliminación de restos de células flotando en el medio de cultivo; crecimiento de fibroblastos placentarios se adjunte a la placa. Cultura de las células similares a fibroblastos derivados de la HPC hasta el ^10º pasaje y luego cosechan para cultivos de células madre después del tratamiento tripsinización y mitomicina C (10 mg / ml).
6. Antes de congelar HPCs como muestras de valores, utilice reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para confirmar que HPCs no están contaminados con patógenos que comúnmente infectan la placenta, incluyendo micoplasma (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginina, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,y M. capricolum) y las especies bacterianas, Ureaplasma urealyticum, mediante el uso de un kit de detección de micoplasma.
   1. Siga las instrucciones del fabricante para realizar RT-PCR, utilice todos los cebadores y mezclas previstas en el kit. Usa los sobrenadantes de las células que han sido cultivadas durante 36 días para la detección de micoplasma. Añadir 3 l de estas muestras a las mezclas de PCR y realice el procedimiento 1 ^st PCR durante 35 ciclos, consistiendo cada uno de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 2 min, y 72 ° C durante 1 min.
   2. Añadir con cuidado 0,5 l de la 1 ^st producto PCR a la mezcla de PCR y realice el procedimiento 2 ^nd PCR durante 30 ciclos utilizando las mismas condiciones que antes. Analizar los productos amplificados por 1% electroforesis en gel de agarosa; aplicar 10 l de cada uno de los 1 y 2 ^de los productos de PCR a los geles.
7. Si se encuentran HPCs estar contaminados con patógenos, eliminar estosutilizando una combinación de antibióticos (BM-Ciclina), siguiendo las instrucciones del fabricante. Escribir un medio que contiene 10 mg / ml de BM-ciclina 1 durante 3 días, y luego tratar las células con 5 mg / ml BM-ciclina 2 durante 4 días. Repita este ciclo dos veces y luego comprobar la contaminación por micoplasma nuevo.

3. Las células derivadas de la placenta humana cosecha acondicionado Medio (hPCCM)

1. Después de excluir la contaminación, el tratamiento de las células unidas (85-90% de confluencia, (1,5 × 10 ⁷ células / frasco) con mitomicina C (10 mg / ml) durante 2 horas y 30 minutos, y se lavaron las células tres veces con 10 ml PBS. Se incuban las células con medio precalentado sin mitomicina-C durante 24 horas.
2. Un día después del tratamiento, se incuban las células en 10 ml de medio (DMEM-F12 suplementado con 20% Knock-Out suero sustitución [KOSR], 0,1 mM β-mercaptoetanol, 1% NEAA, y 1% de penicilina-estreptomicina). Después de 24 h de incubación, la cosecha CM en un tubo cónico de 15 ml y sefiltrado del CM usando un filtro de jeringa de 0,22 micras.
3. Añadir otros 10 ml de nuevo medio y la incubación. Recoge todos los sobrenadantes de los cultivos de cada día durante 1 semana y congelar el medio cosechado a -80 ° C. Evite los ciclos de congelación y descongelación repetidas.

4. Las células Cultura de madre embrionarias humanas (hESCs) y la inducción de las células madre pluripotentes (iPSCs)

1. Obtener líneas de células madre embrionarias humanas, células H1 y H9 (enumerados en el registro NIH células madre bajo el nombre WA01 y WA09, respectivamente) y-pluripotentes inducidas de células madre IPSC-1: iPS (prepucio) -1 y IPSC-2 (IISH1i- BM), del Instituto de Investigación WiCell (Madison, WI, EE.UU.). Las células deben ser descongelados y cultivadas siguiendo las instrucciones del fabricante.
2. Para el grupo de control, células de cultivo en placas revestidas-Matrix Membrana Basal en medio de cultivo definido-alimentador libre de suero y libre ampliamente utilizado a 37 ° C y en 5% de CO _2. Inicialmente, sembrar matas de 80-100 hPSCs in platos de 35 mm. Crecer células en estos platos hasta el 70-80% de confluencia y rutinariamente células de paso para sub-cultivo una vez cada 5-6 días, utilizando métodos mecánicos o enzimáticos (Dispasa). Lavar las células dos veces con medio y la placa ellos en una proporción de 1: 4. Sustituya el medio con medio fresco cada día.
3. Para los grupos experimentales, células de cultivo en hPCCM en los platos pre-recubiertas con gelatina al 0,1% y realizar pases de rutina una vez cada 5 días, ya sea mecánicamente o enzimáticamente. Células de la placa en relaciones en el intervalo de 1: 6-1: 10. hPSCs unen a la gelatina plazo de 2 días después de la transferencia. Sustituya el medio con medio fresco todos los días.

5. Caracterización de las células madre pluripotentes Humanos

NOTA: Caracterizar hPSCs utilizando varios métodos, tales como la tinción de fosfatasa alcalina, inmunocitoquímica, en tiempo real PCR cuantitativa (QRT-PCR), y el Western Blot.

1. La tinción de inmunofluorescencia
   1. Para immunofluorescence tinción, hPSCs de cultivo y fijar las células en 8 pocillos cámaras de diapositivas con 4% (w / v) de paraformaldehído durante 10 min; a continuación, las células se permeabilizaron con 0,1% (v / v) de Triton-X100 durante 15 min, y bloquear las células durante 1 hora con 3% (v / v) de suero de caballo normal en PBS que contenía 0,1% (v / v) Tween- 20. Lave PBS dos veces durante 5 minutos entre cada paso.
   2. Se incuban las células con el anticuerpo primario (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, la dilución de 1: 1000) O / N a 4 ° C y con el anticuerpo secundario.
   3. Antes del montaje, incubar las células con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 min en la oscuridad. Lavar las células rigurosamente tres veces durante 5 minutos cada uno y secos células completamente, en la oscuridad. Preservar las células en medio de montaje de fluorescencia y observarlas bajo un microscopio de fluorescencia.
2. QRT-PCR
   1. Aislar el ARN total a partir de células utilizando un kit RNeasy Mini de acuerdo con las especificaciones del fabricante y cuantificar el ARN extraído usando un espectrofotómetro Nano gota.
   2. Sintetizar cDNA mediante la adición de 2 g de ARN total a un 20-l mezcla de reacción que contiene oligo (dT) cebadores y Superscript II transcriptasa inversa; siga las instrucciones del fabricante en este procedimiento.
   3. Amplificar el cDNA sintetizado con un sistema iQ Bio-Rad iCycler, utilizando iQ SYBR Green qPCR Master Mix y las secuencias de los cebadores descritos en el Adicional cuadro S1. Normalizar los valores de umbral de ciclo de los genes de interés a los de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH).
3. La fosfatasa alcalina (AP) tinción
   1. Detectar la actividad de AP usando la célula ES Caracterización Kit, de acuerdo con el protocolo del fabricante.
   2. El día 5, aspirar los medios de comunicación y corregir los hPSCs con paraformaldehído al 4% en PBS durante 12 min. No overfix; fijar las células durante más de 2 min dará lugar a la inactivación de la fosfatasa alcalina. Aspirar el fijador y enjuague con 1x Enjuague Buffer. Nopermiten que los pozos se sequen entre los pasos.
   3. Añadir solución de tinción suficiente para cubrir cada pocillo (1 ml por pocillo de una placa de 35 mm). Incubar las placas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
   4. Después de la incubación, lavar los platos con 1x Enjuague Buffer. Las células de la cubierta con 1x PBS para prevenir el secado y examinan e imagen las células teñidas utilizando un microscopio Olympus.
4. Western Blot
   1. Realizar análisis de transferencia Western según lo descrito anteriormente en ^9. Brevemente, determinar las concentraciones de proteína en los lisados ​​celulares. Resolver cantidades iguales de proteína en una electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) gel de dodecil de sodio y transferir las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).
   2. Bloquee la mancha y la sonda se O / N con diferentes anticuerpos primarios a 4 ° C; posteriormente se incuba la blot con anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 h. Se lava la membrana tres veces durante 10 min cada vez, entre incubaciones. Detectar señales usando un reactivo ECL.
5. Short Tandem Repeat (STR) Análisis
   1. hPSCs se recogieron de los grupos control y experimental en el mismo pasaje. ADN genómico fue extraído utilizando un kit de ADN Micro, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   2. Amplificar el ADN genómico de 16 loci genético diferente usando el Kit AmpF / STR Amplificación por PCR, de acuerdo con las especificaciones del fabricante y electroforesis capilar se realizó utilizando un analizador genético.

Resultados

Una ventaja de este método de propagación HPSC es que utiliza componentes secretados a partir de células humanas. Un paso más ciritical en el protocolo es el aislamiento y cultivo de células de la placenta humanos derivados. Esto requiere la disección precisa y de una parte precisa de HPC placa vellosidades. La Figura 1 muestra el procedimiento para el aislamiento de células derivada de placenta humana. Este proceso es simple y conveniente para el aislamiento de células, y se puede realizar fác...

Discusión

Este modelo fue desarrollado para propagar con éxito hPSCs, mientras que el mantenimiento de sus características, en condiciones de cultivo libres de alimentador humanizados sin la adición de factores de crecimiento recombinantes exógenas tales como bFGF o insulina, lo que permite la manipulación de hPSCs en un microambiente humanizado. Suplementación bFGF exógeno es común y la aplicación de sustratos tales como Matrigel o laminina es esencial para el cultivo libre de alimentador de hPSCs ^14.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.