소설 문화 모델은 인간 다 능성에 대한 태반 에어컨 미디어에서 젤라틴에 세포 전파 줄기

요약

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

초록

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

서문

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

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프로토콜

윤리 문 : 인간의 태반 연구는 고려 대학교 (AN09085-001)의 인간 연구를위한 임상 시험 심사위원회의 승인을 전향 적으로 실시 하였다. 모든 실험은 한국 대학 의료 센터에서 클린 무균 룸 시설에서 수행 하였다. 실험 설계 및 hPSCs를 사용 절차는 고려 대학교 병원의 임상 시험 심사위원회 (AN12277-003)에 의해 승인되었다.

악기, 문화 미디어, 그리고 요리 1. 준비

1. 0.1 % 젤라틴과 코트의 모든 문화 요리. 오토 클레이브 인산염 완충 식염수 (PBS)와 집게. 이상 15 분 동안 15파운드의 PSI 하에서 121 ° C에서 수술 가위, 마이크로 원심 튜브, 멸균 거즈.
2. 준비된 미리 예열 0.25 % 트립신 에틸렌 아민 테트라 아세트산 (트립신 EDTA) 및 미리 예열 여과 배양 배지 (DMEM) 20 % 소 태아 혈청 (FBS), 100 U / ㎖ 페니실린을 함유하는, 100 ㎍ / ㎖ streptomyc절차를 시작하기 전에에서.

인간 태반 2. 세포 격리

1. 서면 동의서를 얻은 후 임신 7-32주에서 정상 또는 치료 낙태를 받고 건강한 임신 한 여성에서 제왕 절개 배달 후 태반 조직을 얻습니다.
2. 태반에서 산부인과 전문의 수술 별도의 인간 태반 융모 판 (HPC의)가; 20 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신 EDTA에이를 배양 한 다음 5 ml의 PBS로 씻는다.
3. 가위를 사용하여 HPC의에서 융모막 융모를 분리; 융모를 말하다 및 1 ㎖의 PBS로 세 번 씻는다. 닦지 후, 피펫 팁을 사용하여 미세 원심 분리 튜브에 융모막 융모를 배치; 아래로 pipetting 및 500 μL PBS로 샘플을 씻어, 3 분 동안 120 XG의 튜브를 원심 분리기. 미리 예열 문화 매체의 500 μL로 두 번 조직을 씻으십시오.
4. 37 ° C에서 젤라틴 코팅 접시에 배지에서 배양 세포, 5 % CO ₂ , 95 % 미만 습도. 사전 코트 37 ° C에서 1 시간 동안 0.1 % 젤라틴 모든 판. 섬유 아세포와 같은 세포의 콜로니 형성과 약 5-7일 같은 매체에 문화를 개시 한 후 부착 성장합니다.
5. 제 3 통로까지 2-3 일마다 매체를 교환하십시오. 배양 동안에, 배지에 떠있는 세포 파편을 제거하는 단계; 성장하는 태반의 섬유 아세포는 판에 연결됩니다. 문화 후 10 ^{일 통로로} HPC부터 유래 섬유 아세포와 같은 세포는 트립신과 마이 토마 이신 -C (10 μg의 / ㎖) 처리 후 hESC의 배양을 위해 그들을 수확.
6. 스톡 시료로서 HPC의 동결 전에, HPC의 일반적 (M.의 fermentans, M.의 hyorhinis, M. 아르기닌, M을 미코 플라스마 포함 태반, 감염 병원체에 오염되지 않은 것을 확인 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 . orale, 엠의 salivarium, M. hominis가, M.의 pulmonis, 엠의 arthritidis, 엠의 neurolyticum, M. hyopneumoniae,그리고 M. capricolum) 및 박테리아 종 Ureaplasma urealyticum의, 마이코 플라스마 검출 키트를 사용하여.
   1. , RT-PCR을 수행하기 위해 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 모든 프라이머 및 이들의 혼합물을 사용합니다. 마이코 플라즈마 검출 36 일 동안 배양 된 세포의 상층 액을 사용합니다. PCR 혼합물에이 샘플의 3 μl를 추가하고 30 초, 2 분 동안 55 ℃, 1 분 동안 72 ℃에서 각 94 ° C로 구성된 35주기 위해 ¹ 차 PCR의 절차를 수행합니다.
   2. 조심스럽게 PCR 혼합물에 ¹ 차 PCR 산물의 0.5 μL를 추가하고 이전과 동일한 조건을 이용하여 30 사이클 동안 2 ^차 PCR 절차를 수행한다. 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의한 증폭 산물을 분석; 젤에 ¹ 차 및 2 ^차 PCR 산물을 각각 10 μL를 적용합니다.
7. HPC의 병원체가 오염 된 것으로 발견되면, 이러한 제거제조업체의 지침에 따라 항생제의 조합 (BM-사이클린)를 사용. 3 일 BM-사이클린 (1) 10 ㎍ / ㎖의를 포함하는 새로운 매체를 추가하고 또 다른 4 일 동안 5 μg의 / ㎖ BM-사이클린 2 세포를 취급합니다. 두 번이 사이클을 반복 한 후 다시 마이코 플라스마 오염 확인합니다.

3. 수확 인간 태반 유래 세포 중간 (hPCCM), 금연실

1. 오염을 제외한 후, 부착 세포 (85~90% 합류 치료; (1.5 × ¹⁰⁷ 세포 / 2 시간 30 분 동안 미토 마이신 C (10 μg의 / ㎖)와 함께 플라스크) 및 10 ml의 세포를 3 회 세척 PBS는. 24 시간 동안 마이 토마 이신 C-없이 사전 예열 매체와 세포를 품어.
2. 어느 날 치료 후, 10 ml의 배지에서 세포를 배양 (DMEM-F12 20 % 노크 아웃 혈청 교체 [KOSR] 보충, 0.1 MM의 β - 머 캅토 에탄올, 1 % NEAA, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신). 15 ML 원뿔 관에서 24 시간 배양, 수확 후 CM과0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 필터링 CM.
3. 새로운 매체 및 배양의 또 다른 10 ML을 추가합니다. 1 주간 매일 문화에서 모든 상층 액을 수집하고 -80 ° C에서 수확 한 매체를 동결. 반복 동결 - 해동 사이클을 피하십시오.

4. 문화 인간의 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포) 및 다 능성 줄기 세포의 유도 (iPSCs)

1. 인간 배아 줄기 세포주를 확보, (각각 이름 WA01 및 WA09에서 NIH hESC의 레지스트리에 나열된) (H1)과 H9 세포와 유도 만능 줄기 세포 IPSC-1 : 만능 줄기 (포피) -1 IPSC-2 (IISH1i- WiCell 연구소 (매디슨, 위스콘신, 미국)에서 BM). 전지는 제조업체의 지침에 따라 해동 배양해야한다.
2. 대조군, 37 ° C에서 널리 사용되는 피더없고 정의 된 무 혈청 배지에서 기저막 매트릭스 코팅 접시에 5 % CO _2에서 배양 세포. 처음 hPSCs의 80-100 덩어리 씨앗 나는N 35-MM 요리. 70-80 %의 합류와 정기적 통로 세포까지이 요리에 세포를 성장 서브 배양, 모든 5-6일 한 번 기계적 또는 효소 적 방법 (스파 아제 (Dispase))를 사용하여. 매체로 두 번 세포를 씻으 1의 비율을 판 : 4. 매일 신선한 매체와 매체를 교체합니다.
3. 실험 그룹의 경우, 요리에 hPCCM에서 배양 세포를 기계적으로 또는 효소, 0.1 % 젤라틴으로 미리 코팅 한 번 5 일마다 계대 루틴을 수행합니다. 6-1 : 10 (1)의 범위의 비율로 플레이트 세포. hPSCs는 전송 후 이일 내 젤라틴에 연결합니다. 매일 신선한 매체와 매체를 교체합니다.

인간 만능 줄기 세포의 특성 (5)

참고 : 알칼리 포스 파타 아제 염색, 면역 세포, 정량 실시간 PCR (QRT-PCR), 서부 블로 팅 등의 여러 가지 방법을 사용 hPSCs을 특성화.

1. 면역 형광 염색법
   1. immunofluorescenc 들어E 염색, 문화 hPSCs 4 % 10 분 동안 (W / V) 파라 포름 알데히드와 8 웰 슬라이드 챔버에서 세포를 수정; 그리고, (v / v)의 트리톤 X100 15 분 동안 0.1 %를 함유하는 PBS에서 3 % (v / v)의 정상 말 혈청과 함께 1 시간 동안 세포를 차단 (v / v)의 0.1 %로 세포 투과성이 Tween- (20). 각 단계 사이에 5 분 동안 두 번 PBS를 씻으십시오.
   2. 4 ° C에서 이차 항체와 O / N : 차 항체 (1,000 일의 10월-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, 희석)와 세포를 품어.
   3. 장착 전에, 어두운 곳에서 5 분 동안 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)로 세포를 배양한다. 세척 세포 엄격에게 어둠 속에서 각각의 건전지 완전히 5 분 3 회. 형광 장착 배지에서 세포를 유지하고, 형광 현미경 하에서이를 관찰한다.
2. QRT-PCR
   1. 제조 회사의 사양에 따라 분리하고, RNeasy 미니 키트를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 분리하고 나노 드롭 분광 광도계를 사용하여 추출한 RNA를 정량화.
   2. 20 ㎕의 반응 혼합물을 함유하는 올리고으로 총 2 μg의 RNA를 첨가하여 cDNA를 합성 (DT) 프라이머 및 슈퍼 스크립트 II 역전사 효소는; 이 과정에서 제조업체의 지침을 따르십시오.
   3. iQ를 SYBR 그린 qPCR의 매스터 믹스와 기업 S1 표에 기재된 프라이머 서열을 이용하여, 바이오 래드 iCycler IQ 시스템으로 합성 된 cDNA를 증폭. 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)들에 관심 유전자의 사이클 임계 값들을 정규화.
3. 알카라인 포스파타제 (AP) 염색
   1. 제조사의 프로토콜에 따라, ES 세포 특성 분석 키트를 사용하여 AP의 활동을 감지.
   2. 5 일에서 미디어를 대기음 12 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 hPSCs를 해결. overfix하지 마십시오 이상 2 분 동안 세포를 고정하는 알칼리 포스 파타 아제의 비활성화가 발생합니다. 정착액을 기음과 1X 린스 버퍼 씻어. 하지 마라우물 단계 사이에 건조 할 수 있습니다.
   3. 각 웰 (35mm 접시 잘 당 1 ㎖)에 충분한 염색 액을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트.
   4. 배양 후, 1X 린스 버퍼과 설거지. 1X PBS와 표지 세포의 건조를 방지하고 올림푸스 현미경을 사용하여 염색 된 세포를 조사하고 이미지.
4. 서쪽 오점
   1. 이전에 ^9에 설명 된대로 웨스턴 블롯 분석을 수행합니다. 간략하게, 세포 용 해물에서의 단백질 농도를 결정한다. 소듐 도데 실 설페이트 - 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 겔상의 단백질의 동량을 해결하고, 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 막에 단백질을 옮긴다.
   2. 오점을 차단하고 4 ° C에서 다른 1 차 항체 / O, N 그것을 조사; 이후 1 시간 동안 HRP - 복합 이차 항체와 얼룩을 품어. 10 분 배양 사이의 때마다 막 세 번 씻으십시오. ECL 시약을 이용하여 신호를 검출.
5. 짧은 탠덤 반복 (STR) 분석
   1. hPSCs는 같은 통로에서 제어 및 실험 그룹에서 수확했다. 게놈 DNA는 제조자의 지시에 따라서, DNA 마이크로 키트를 사용하여 추출 하였다.
   2. 제조자의 명세 및 모세관 전기 영동에있어서, AmpF / STR PCR 증폭 키트를 사용하여 16 개의 서로 다른 유전자좌에 대한 게놈 DNA를 증폭하는 유전 분석기를 사용하여 수행 하였다.

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결과

이 hPSC 전파 방법의 이점은 인간 세포로부터 분비 된 요소를 사용한다는 것이다. 프로토콜에서 가장 ciritical 단계는 인간 태반 유래 세포의 분리 및 문화입니다. 이 요구 및 HPC 판 융모의 정확한 부분에서 정확한 해부. 한 인간 태반 유래 세포의 분리를위한 절차를 보여줍니다. 이 과정은 간단하고 세포의 분리를위한 편리하고 용이하게 1 시간 내에 수행 될 수있다. ?...

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토론

이 모델은, 예컨대의 bFGF 또는 인슐린과 같은 외인성 재조합 성장 인자 첨가없이 인간화 피더가없는 배양 조건에서의 특성을 유지 인간화 미세 환경에서 hPSCs의 조작을 가능하게하면서 성공적 hPSCs를 전파하기 위해 개발되었다. 외인성 bFGF를 보충 일반적입니다 및 마트 리겔 또는 라미닌 등 하층의 응용 프로그램은 hPSCs ^(14)의 공급이없는 배양을 위해 필수적이다.

이 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.