A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

Résumé

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Résumé

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

Introduction

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

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Protocole

Déclaration éthique: L'étude de placenta humain a été réalisée de manière prospective, avec l'approbation de l'Institutional Review Board pour la recherche humaine de l'Université de Corée (AN09085-001). Toutes les expériences ont été réalisées dans une salle blanche Germ-gratuit au Centre médical de l'Université de Corée. La conception et les procédures utilisant hPSCs expérimentale ont été approuvés par l'Institutional Review Board de l'University Medical Center Corée (AN12277-003).

1. Préparation des Instruments, Culture Media, et Plats

1. Manteau de toutes les boîtes de culture avec 0,1% de gélatine. Autoclave une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et une pince. Stériliser ciseaux chirurgicaux, des microtubes, et de la gaze à 121 ° C sous £ 15 psi pendant plus de 15 min.
2. 0,25% de trypsine-éthylène amine tétra-acétique, préparé préchauffé (trypsine-EDTA) et support préchauffé culture filtré (DMEM) contenant 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml streptomycavant de commencer les procédures.

2. Isolement cellulaire à partir de placenta humain

1. Obtenir le tissu placentaire, après la livraison de césarienne, de femmes enceintes en bonne santé qui subissent un avortement thérapeutique normal ou au 7-32 semaines de gestation après l'obtention du consentement éclairé écrit.
2. Avoir le spécialiste obstétriques placenta humain plaques choriales chirurgicalement séparées (CAH) du placenta; incuber dans ces 0,25% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 20 min, puis laver avec 5 ml de PBS.
3. Isoler villosités choriales du CAH l'aide de ciseaux; émincer les villosités et les laver trois fois avec 1 ml de PBS. Après hachage, placer les villosités choriales dans un tube de centrifugeuse en utilisant une pointe de pipette; laver les échantillons avec 500 pi de PBS par pipetage de haut en bas, et centrifuger les tubes pour 120 g pendant 3 min. Laver deux fois les tissus avec 500 ul de milieu de culture préchauffé.
4. les cellules dans du milieu de culture sur des plaques revêtues de gélatine à 37 ° C, dans 5% de CO ₂ et sous 95% d'humidité. Pré-manteau toutes les plaques avec 0,1% de gélatine pendant 1 heure à 37 ° C. Les colonies de cellules de fibroblastes se formeront et la croissance adhérente environ 5-7 jours après le début de la culture dans le même milieu.
5. Remplacez le milieu tous les 2-3 jours jusqu'à ce que le troisième passage. Au cours de la culture, l'enlèvement des débris de cellules flottant dans le milieu de culture; fibroblastes placentaires croissance vont attacher à la plaque. Culture des cellules de fibroblastes provenant de l'HPC à la 10 ^ème passage, puis les récolter pour les cultures de CSEh après trypsinisation et la mitomycine-C (10 pg / ml) de traitement.
6. Avant la congélation CAH que des échantillons d'achat d'actions, utiliser transcription inverse-réaction de polymérisation en chaîne (RT-PCR) pour confirmer que BHP ne sont pas contaminés par des agents pathogènes qui infectent couramment le placenta, y compris les mycoplasmes (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginine, M . orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,et M. capricolum) et les espèces bactériennes, Ureaplasma urealyticum, en utilisant un kit de détection de mycoplasme.
   1. Suivez les instructions du fabricant pour effectuer RT-PCR, utiliser toutes les amorces et des mélanges fournis dans le kit. Utilisez les surnageants des cellules qui ont été cultivées pendant 36 jours pour la détection des mycoplasmes. Ajouter 3 ul de ces échantillons pour les mélanges de PCR et effectuer la procédure 1 ^er PCR pendant 35 cycles, chacun consistant en 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 2 min, et 72 ° C pendant 1 min.
   2. Ajouter avec précaution 0,5 ul du produit de PCR 1 ^er au mélange PCR et effectuer la procédure 2 ^ème PCR pendant 30 cycles en utilisant les mêmes conditions que précédemment. Analyser les produits amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1%; appliquer 10 pi de chacun des 1 ^er et 2 ^ème produits PCR pour les gels.
7. Si CAH sont trouvés d'être contaminés par des agents pathogènes, les élimineren utilisant une combinaison d'antibiotiques (BM-cycline), en suivant les instructions du fabricant. Ajouter un nouveau milieu contenant 10 pg / ml de BM-cycline 1 pendant 3 jours, puis traiter les cellules avec 5 ug / ml BM-cycline 2 pendant 4 jours. Répétez ce cycle deux fois, puis vérifier la contamination par des mycoplasmes nouveau.

3. Les cellules de placenta humain récolte dérivés milieu conditionné (hPCCM)

1. Après l'exclusion de la contamination, de traiter les cellules attachées (85-90% de confluence; (1,5 × 10 ⁷ cellules / fiole) avec de la mitomycine-C (10 ug / ml) pendant 2 heures et 30 min, et lavé les cellules trois fois avec 10 ml PBS. incuber les cellules avec un milieu préchauffé sans mitomycine-C pendant 24 heures.
2. Un jour après le traitement, incuber les cellules dans 10 ml de milieu (DMEM-F12 supplémenté avec 20% de sérum knock-out remplacement [KOSR], 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, 1% de NEAA et 1% de pénicilline-streptomycine). Après 24 heures d'incubation, la récolte CM dans un tube conique de 15 ml etfiltrage du CM à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um.
3. Ajouter encore 10 ml de nouveau milieu et l'incubation. Collecter toutes les surnageants des cultures chaque jour pendant 1 semaine et geler le milieu récolté à -80 ° C. D'éviter les cycles de gel-dégel.

4. culture des droits de cellules souches embryonnaires (CSEh) et l'induction de cellules souches pluripotentes (CISP)

1. Obtenir des lignées de cellules souches embryonnaires humaines, les cellules H1 et H9 (énumérés dans le registre NIH CSEh sous le nom WA01 et WA09, respectivement) et induit-pluripotentes cellules souches iPSC-1: iPS (prépuce) -1 et iPSC-2 (IISH1i- BM) de l'Institut de recherche WiCell (Madison, WI, USA). Les cellules doivent être décongelés et mis en culture selon les instructions du fabricant.
2. Pour le groupe de contrôle, des cellules de culture sur la vaisselle membrane basale Matrix-revêtus largement utilisé dans le milieu de culture défini sans sérum sans chargeur et à 37 ° C et à 5% de CO _2. Initialement, semences 80-100 touffes de hPSCs in 35 mm plats. Cultiver les cellules dans ces plats jusqu'à 70-80% de cellules de passage de confluence et de routine sous-culture une fois tous les 5-6 jours, en utilisant des méthodes mécaniques ou enzymatiques (Dispase). Laver les cellules deux fois avec du milieu de pré eux dans un rapport de 1: 4. Remplacez le milieu avec un milieu frais tous les jours.
3. Pour les groupes expérimentaux, des cellules en culture dans hPCCM sur des plats pré-revêtues avec 0,1% de gélatine et d'effectuer des passages de routine une fois tous les 5 jours, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique. cellules de la plaque à des rapports dans la plage de 1: 6-1: 10. hPSCs attachent à la gélatine dans les 2 jours après le transfert. Remplacez le support avec un milieu frais tous les jours.

5. Caractérisation des pluripotentes humaines Cellules souches

NOTE: Caractériser hPSCs utilisant plusieurs méthodes, telles que alcaline phosphatase coloration, immunocytochimie, quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR) et Western blot.

1. Immunofluorescence
   1. Pour immunofluorescence coloration, hPSCs de culture et fixer les cellules dans 8 puits chambres de diapositives avec 4% (p / v) de paraformaldehyde pendant 10 min; ensuite, les cellules perméabilisées avec 0,1% (v / v) de Triton-X100 pendant 15 min, et de bloquer les cellules pendant 1 heure avec 3% (v / v) de sérum de cheval normal dans du PBS contenant 0,1% (v / v) de Tween 20. Laver PBS deux fois pendant 5 min entre chaque étape.
   2. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire (OCT-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, dilution de 1: 1000) O / N à 4 ° C et avec l'anticorps secondaire.
   3. Avant le montage, incuber les cellules avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes dans l'obscurité. Laver les cellules rigoureusement trois fois pendant 5 min chacun et secs cellules complètement, dans l'obscurité. Préserver les cellules de la fluorescence milieu de montage et de les observer sous un microscope à fluorescence.
2. qRT-PCR
   1. Isoler l'ARN total à partir de cellules en utilisant un kit RNeasy selon les spécifications du fabricant et de quantifier l'ARN extrait à l'aide d'un spectrophotomètre Goutte Nano.
   2. La synthèse d'ADNc par addition de 2 pg de l'ARN total à un oligonucléotide contenant 20 ul de mélange réactionnel (dT) et des amorces de transcriptase inverse Superscript II; suivre les instructions du fabricant dans cette procédure.
   3. Amplifier l'ADNc synthétisé avec un système de iQ iCycler Bio-Rad, en utilisant iQ qPCR SYBR Green Master Mix et les séquences d'amorces décrites dans le tableau supplémentaire S1. Normaliser les valeurs de seuil de cycle des gènes d'intérêt à ceux de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).
3. Phosphatase alcaline (AP) coloration
   1. Détecter l'activité AP en utilisant la caractérisation de cellules ES Kit, selon le protocole du fabricant.
   2. Au jour 5, aspirer les médias et fixer les hPSCs avec 4% de paraformaldehyde dans PBS pendant 12 min. Ne pas overfix; fixation des cellules pendant plus de 2 min donnera lieu à l'inactivation de la phosphatase alcaline. Aspirer le fixateur et rincer à l'1x Rinse Buffer. Ne paslaisser sécher les puits entre les étapes.
   3. Ajouter une solution de coloration assez pour couvrir chaque puits (1 ml par puits d'une boîte de 35 mm). Incuber les plaques dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 min.
   4. Après incubation, laver la vaisselle avec 1x Rinse Buffer. cellules de couverture avec 1x PBS pour éviter le dessèchement et examinent et l'image les cellules colorées en utilisant un microscope Olympus.
4. Western Blot
   1. Effectuer une analyse western blot comme décrit précédemment dans ^9. En bref, déterminer les concentrations protéiques dans les lysats cellulaires. Résoudre des quantités égales de protéine à une électrophorèse sur gel de sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) de gel de dodécylsulfate de sodium et le transfert des protéines sur un polyfluorure de vinylidène (PVDF).
   2. Bloquer le transfert et sonder O / N avec des anticorps primaires différentes à 4 ° C; incuber ensuite l'blot avec des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 heure. Laver la membrane trois fois pendant 10 min à chaque fois entre les incubations. Détecter des signaux à l'aide d'un réactif ECL.
5. Court Répétez Tandem (STR) Analyse
   1. hPSCs ont été récoltées dans les groupes témoins et expérimentaux dans le même passage. L'ADN génomique a été extrait en utilisant un kit Micro ADN, selon les instructions du fabricant.
   2. Amplifier l'ADN génomique pour 16 loci génétiques différents en utilisant le kit d'amplification PCR ampf / STR, selon les spécifications du fabricant et électrophorèse capillaire a été réalisée en utilisant un analyseur génétique.

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Résultats

Un avantage de cette méthode de propagation de HPSC est qu'elle utilise des composants sécrétées à partir de cellules humaines. Une étape la plus ciritical dans le protocole est l'isolement et la culture de cellules placentaires humaines dérivées. Cela exige et la dissection précise d'une partie précise de HPC plaque villosités. La figure 1 montre la procédure pour l'isolement cellulaire dérivée du placenta humain. Ce procédé est simple et commode pour l'isolement de ...

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Discussion

Ce modèle a été mis au point pour se propager avec succès hPSCs, tout en conservant leurs caractéristiques, dans des conditions de culture sans cellules nourricières humanisés sans l'addition de facteurs de croissance recombinants exogènes tels que bFGF ou de l'insuline, ce qui permet la manipulation de hPSCs dans un micro-environnement humanisé. Exogène supplémentation bFGF est commun et l'application de substrats tels que Matrigel ou laminine est essentiel pour la culture libre-chargeur de hPSCs...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.