A Novel Kültür Modeli İnsan Pluripotent için Plasenta klimalı Medyada Jelatin üzerinde hücre çoğalma Kök

Özet

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

Özet

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

Giriş

The goal of this protocol is the propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) including human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (iPSCs) in fully humanized ex vivo feeder-free conditions without requiring additional exogenous supplementation and synthetic substrates. To date, the development of ex vivo hPSC culture models, that enable the introduction of culture products to the clinic, has been a major concern in stem cell research. Specifically, two critical problems need to be addressed. First, a humanized ex vivo culture system for the propagation of hPSCs that obviates the risk of contamination by animal cell products is needed. Second, a feeder-free culture model is needed to facilitate easy and economic mass production of hPSCs. For therapeutic applications of hPSCs, it is necessary to identify the factors that regulate their self-renewal and differentiation.

Since Xu et al. initially reported the feasibility of using conditioned media (CM) derived from mouse embryonic fibroblasts (MEF) to grow hESCs on Matrigel¹, many studies have examined optimal ex vivo propagation methods for hPSCs^2-4. However, an ideal humanized ex vivo feeder-free hPSC propagation system has not been developed because current methods require additional exogenous substrates including bFGF and insulin, well-known hPSC-sustaining factors, in culture media^5-7. Moreover, synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures.

The rationale behind the development and use of this protocol is based on our previous studies showing that human placenta chorion cells excellently support the propagation of hPSCs without bFGF supplementation^8-11. This protocol has a number of advantages including its simplicity with respect to handling and its cost-effectiveness, and it is a near-perfect humanized culture that enables hPSC propagation without exogenous synthetic substrates. The application of human placenta-derived CM (hPCCM) for hPSCs involves 3 steps. First, chorion cells are isolated from the human placenta and cultured. Second, hPCCM is produced from cultured cells. Third, hPSCs are cultured using hPCCM and their characteristics are confirmed.

This protocol will facilitate clinical applications of hPSCs and studies of the mechanisms of hPSC proliferation and attachment. In this paper, the protocol for the successful propagation of hPSCs in hPCCM on a gelatin-coated dish is presented.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Etik bildirimi: İnsan plasenta çalışması Kore Üniversitesi (AN09085-001) insan araştırma için Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı ile, ileriye dönük olarak. Tüm deneyler Kore Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Temiz Germ-Alerjik Oda tesis yapıldı. deneysel tasarım ve hPSCs kullanarak prosedürleri Kore Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (AN12277-003) tarafından onaylanmıştır.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

1. % 0.1 jelatin ile kaplayın tüm kültür yemekleri. Otoklav fosfat tamponlu tuz (PBS) ve forseps. Birden fazla 15 dakika £ 15 psi altında 121 ° C 'de, cerrahi makas, mikrosantrifüj tüpleri, gazlı bez sterilize edin.
2. Hazırlanan önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-etilen amin tetra-asetik asit (tripsin-EDTA) ve önceden ısıtılmış, süzülmüş kültür ortamı (DMEM)% 20 fetal sığır serumu (FBS), 100 U / ml penisilin içeren ve 100 ug / ml streptomycprosedürleri başlamadan önce.

Insan plasentasından 2. Hücre İzolasyonu

1. Yazılı onam alındıktan sonra gebelik 7-32 haftalık normal veya terapötik kürtaj geçiren sağlıklı gebe kadınların sezaryen doğumdan sonra plasenta dokusu, edinin.
2. Plasenta obstetrik uzman cerrahi ayrı insan plasenta koryonik plakaları (HPC) var; 20 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA, bu inkübe, ve daha sonra 5 ml PBS ile yıkayın.
3. Makas kullanarak HPC gelen koryonik villus izole edin; villus kıyma ve 1ml PBS ile onları üç kez yıkayın. Ufalamadan sonra bir pipet kullanarak bir mikrofüj tüpü içine koryonik villi yer; aşağı yukarı pipetleme ve 500 ul PBS ile numuneler yıkayın ve 3 dakika boyunca 120 xg için tüpler santrifüj. Önceden ısıtılmış kültür ortamında 500 ul iki kez dokuları yıkayın.
4. 37 ° C 'de, jelatin-kaplanmış plakalar üzerinde ortam içinde kültür hücreleri,% 5 _CO2 içinde ve% 95 altında nem. Ön kaplama, 37 ° C'de 1 saat süre ile,% 0.1 jelatin ile, tüm plakalar. Fibroblast-benzeri hücrelerin koloniler oluşturur ve yaklaşık 5-7 gün, aynı ortam içinde kültür başladıktan sonra yapışkan bir büyüme olur.
5. Üçüncü pasaj kadar her 2-3 günde bir orta değiştirin. Kültür sırasında, kültür ortamı içinde yüzen hücre birikintilerinin ayrılmasıyla; büyüyen plasental fibroblastlar plaka eklenecektir. Kültür daha sonra ^10. geçide HPC kadar elde edilen ve fibroblast-benzeri hücreler tripsinizasyon ve mitomisin-C (10 ug / ml) tedavi sonrası HESC kültürleri için hasat.
6. Hisse senedi örnekleri olarak HPC dondurmadan önce, HPC genellikle (M. fermentans, M. hyorhinis, M. Arginin, M mikoplazma dahil plasentayı, enfekte patojenler ile kontamine olmadığını teyit etmek için ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanımı . Orale, M. salivarium, M. hominis, M. pulmonis, M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyopneumoniae,ve M. capricolum) ve bakteriyel türler, Ureaplasma urealyticum, bir mikoplazma belirleme kiti kullanılarak.
   1. RT-PCR gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun kitte sağlanan tüm primerler ve karışımları kullanmak. Mycoplasma tespiti için 36 gün süre ile kültive edilmiştir hücre süpernatantlar kullanın. PCR karışımı, bu örneklerin 3 ul ekleyin ve 30 saniye, 2 dakika için 55 ° C ve 1 dakika süre ile 72 ° C'de her biri 94 ° C kapsayan 35 çevrim için 1 ^st PCR prosedürü uygulayın.
   2. Dikkatle PCR karışımı 1 ^st PCR ürünü, 0.5 ul ve daha önce olduğu gibi aynı şartlar kullanılarak 30 çevrim için ^2. PCR prosedürü uygulayın. % 1 agaroz jel elektroforez işlemi aracılığı ile amplifiye ürünlerin analiz; jeller 1 ^{ve 2.} PCR ürünlerinin her birinin 10 ul geçerlidir.
7. HPC patojenler ile kontamine olduğu tespit edilmiştir, bu ortadan kaldırmaküreticinin talimatlarına göre, bir antibiyotik kombinasyonu (BM-siklin) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 3 gün BM-siklin 1 10 ug / ml ihtiva eden yeni ortam ekleyin ve daha sonra başka bir 4 gün için 5 | ig / ml BM-siklin 2 ile hücreleri tedavi. Iki kez bu döngüyü tekrarlayın ve sonra tekrar Mycoplasma kirlenme kontrol edin.

3. Hasat İnsan Plasenta türetilmiş hücreler Orta (hPCCM) Klima

1. Kirlenme hariç sonra, bağlanmış hücreler (85-90% konfluansa tedavi (1.5 x 10 ⁷ hücre / 2 saat ve 30 dakika boyunca mitomisin-C (10 ug / mi) ile bir şişe) ve 10 ml hücreler üç kez yıkandı PBS ile yıkandı. 24 saat, mitomisin-C olmayan önceden ısıtılmış ortam ile inkübe hücreleri.
2. Bir gün tedaviden sonra, 10 mi ortam içinde hücrelerin inkübe (DMEM-F12,% 20 nakavt serum Değiştirilmesi [KOSR] ile takviye edilmiş, 0.1 mM β-merkaptoetanol,% 1 NEAA ve% 1 penisilin-streptomisin). 15 ml konik bir tüp içinde 24 saat inkübasyon, hasat CM sonra ve0.22 um şırınga filtresi kullanılarak cm filtre.
3. Yeni orta ve inkübasyon bir 10 ml ekleyin. 1 hafta boyunca her gün kültürlerden tüm süpernatantlar toplayın ve -80 ° C'de hasat aracı madde dondurularak. Tekrarlanan donma-erime döngülerinden kaçınmak.

4. Kültür İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) ve Pluripotent Kök Hücre İndüksiyon (iPSCs)

1. İnsan embriyonik kök hücre hatları elde etmek, (sırasıyla, isim WA01 ve WA09 altında NIH HESC kayıt defterinde listelenen) H1 ve H9 hücreleri ve uyarılmış pluripotent kök hücre-iPSC-1: iPS (sünnet derisi) -1 ve iPSC-2 (IISH1i- WiCell Araştırma Enstitüsü (Madison, WI, ABD) BM). Hücreler, üreticinin talimatları izlenerek çözündürüldükten ve kültüre olmalıdır.
2. Kontrol grubu için, 37 ° C 'de yaygın olarak kullanılan besleyici içermeyen ve serum içermeyen tanımlanmış bir kültür ortamı içinde Bazal Membran Matrisi-kaplı kaplar üzerinde ve% 5 _CO2 kültür hücreleri. Başlangıçta, hPSCs 80-100 kümeleri tohum in 35 mm yemekleri. 70-80% izdiham ve rutin geçiş hücreleri kadar bu yemekleri hücreleri büyümek alt kültüre, her 5-6 günde bir, mekanik veya enzimatik yöntemler (Dispase) kullanarak. Ortam ile hücreler iki kez yıkanır ve 1 arasında bir oranda bunların plaka: 4 arasındadır. Her gün taze ortam ile orta değiştirin.
3. Deney grupları için, yemekler hPCCM kültür hücreleri ya mekanik ya da enzimatik olarak,% 0.1 jelatin ile ön-kaplanmış ve bir kez 5 günde, rutin ile gerçekleşen pasajlanmasını da yerine getirir. 6-1: 10: 1 aralığı içinde oranlarında plakası hücreleri. hPSCs transferden sonra 2 gün içinde jelatin ekleyin. Günlük taze ortam ile orta değiştirin.

İnsan Pluripotent Kök Hücre 5. Karakterizasyonu

Not: alkalin fosfataz boyama, İmmünositokimya, kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve western blotting gibi çeşitli yöntemler kullanılarak hPSCs karakterize eder.

1. İmmünfloresan boyama
   1. Immunofluorescenc içinE boyama, kültür hPSCs% 4, 10 dakika boyunca (ağırlık / hacim) paraformaldehid ile 8 oyuklu kayıcı odaları hücreleri gidermek; Daha sonra, (v / v) Triton-X100, 15 dakika boyunca, ve% 0.1 içeren PBS içinde% 3 (h / h), normal at serumu ile 1 saat boyunca bloke edilir (h / h),% 0.1 ile hücrelerin geçirgen Tween 20. Her adım arasında 5 dakika boyunca iki kez PBS yıkayın.
   2. 4 ° C 'de ve sekonder antikor ile O / N: Primer antikor (1000 1 Ekim-4, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60 seyreltme) ile inkübe hücreleri.
   3. Montaj önce, karanlık bir ortamda 5 dakika boyunca 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile hücrelerin inkübe edin. Yıkama hücresi sıkı karanlıkta her kuru hücrelerin tamamen 5 dakika için üç kez. Floresan montaj ortamına hücreleri korumak ve flöresanlı bir mikroskop altında gözleyin.
2. Mah-PCR
   1. Üreticinin talimatlarına göre bir RNeasy Mini kiti kullanılarak hücrelerden toplam RNA izole ve Nano Bırak Spektrofotometre kullanılarak ekstre RNA ölçmek.
   2. 20 ul reaksiyon karışımı ihtiva eden oligo toplam RNA 2 ug ekleyerek cDNA sentez (dT) primerleri ve Superscript II ters transkriptaz; Bu prosedürde üreticinin talimatlarına uyun.
   3. IQ SYBR Green qPCR Master Mix ve Ek Tablo S1 tarif edilen primer sekanslar kullanılarak, bir Bio-Rad iCycler iQ sistemi ile sentezlenen cDNA yı çoğaltmak. Gliseraldehid-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) kişilerce ilgi genlerinin döngüsü eşik değerlerini normalize.
3. Alkalen fosfataz (AP) boyama
   1. Üreticinin protokolüne uygun olarak, ES hücre Karakterizasyonu Kiti kullanılarak AP aktivitesi algılar.
   2. 5. günde, ortam aspire ve 12 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehit ile hPSCs düzeltin. Overfix etmeyin; daha uzun bir süre, 2 dakika için hücrelerin sabitlenmesi alkalin fosfataz inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır. Fiksatif aspire ve 1x Durulama Tampon ile durulayın. Yapamazkuyu adımları arasında kurumasını bekleyin.
   3. Her çukurun (35 mm çanak oyuk başına 1 mi) karşılamak için yeterli boyama solüsyonu ekleyin. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin.
   4. İnkübasyondan sonra, 1x Durulama Tamponu ile bulaşıkları yıkama. 1x PBS ile Kapak hücreleri kurumasını önlemek ve Olympus mikroskop kullanılarak boyanan hücrelerin incelenmesi ve görüntü için.
4. Western Blot
   1. Daha önce ^9'da tarif edildiği gibi Western blot analizi yapın. Kısaca, hücre lizatları içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi. Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel ile ilgili protein eşit miktarlarda gidermek ve poliviniliden flüorür (PVDF) membran üzerine proteinleri aktarın.
   2. Leke Blok ve 4 ° C'de farklı primer antikorlar ile G / Ç N o prob; Daha sonra 1 saat HRP-konjuge sekonder antikor ile leke inkübe edin. 10 dakika inkubasyon arasındaki her zaman için membranı üç kez yıkayın. Bir ECL reaktifi kullanılarak sinyalleri algılar.
5. Kısa tekrar dizisi (STR) analizi
   1. hPSCs aynı pasajda de deney ve kontrol grupları toplandı. Genomik DNA üreticinin talimatlarına göre, bir DNA Mikro kiti kullanılarak ekstre edilmiştir.
   2. Üreticinin talimatlarına ve kapiler elektroforez göre AmpF / STR PCR Amplifikasyonu kiti kullanılarak 16 farklı genetik lokus için genomik DNA'yı büyütmek Genetik Analiz cihazı kullanılarak gerçekleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu hPSC yayılım yöntemin bir avantajı insan hücrelerinden salgılanan bileşenleri kullanmasıdır. Protokolde en çok ciritical aşama insan plasentası türetilen hücrelerin izolasyonu ve kültürü. Bu gerektirir ve HPC plaka villus kesin bir kısmından doğru diseksiyon. 1 insan plasenta kaynaklı hücre izolasyonu için prosedürü göstermektedir. Bu işlem, basit ve hücrelerin izolasyonu için uygun olan ve kolay 1 saat içerisinde gerçekleştirilebilir. Şekil 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu model, örneğin bFGF veya insülin gibi eksojen rekombinant büyüme faktörlerinin ilavesi olmadan insanlaştınlmış besleyici içermeyen kültür koşullarında özelliklerini muhafaza eden bir insanlaştırılmış mikroçevresinin hPSCs manipülasyonu sağlarken başarıyla hPSCs yaymak için geliştirilmiştir. Ekzojen bFGF takviyesi yaygındır ve Matrigel veya laminin gibi alt tabakalarının uygulanması hPSCs ¹⁴ besleyici içermeyen kültür için gereklidir.

Bu pro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mitomycin-C	Sigma-Aldrich Corporation	M4287	10 μg/ml
Mycoplasma detection kit	TaKaRa Bio Inc.	#6601
Matrigel	BD Biosciences	#354277
mTeSR1	STEMCELL Technologies Inc.	#05850
Dispase	Worthington Biochemical Corporation	LS02100	1 mg/ml
Gelatin	Sigma-Aldrich Corporation	G2500	0.10%
BM-Cyclin	Roche	799 050	10 μg/ml
RNeasy mini kit	Qiagen	74104
Nano Drop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific Inc
iQ SYBR Green qPCR Master Mix	Bio-Rad Laboratories	#170-8882AP
ES Cell Characterization kit	Chemicon International, Inc.,	SCR001
Power cDNA Synthesis Kit	iNtRON Biotechnology	25011
QIAamp® DNA Micro kit	Qiagen	56304
AmpF/STR® Identifiler® PCR Amplification kit	Applied Biosystems Inc.	4322288
Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems Inc.