الآلي وحدات إنتاجية عالية Exopolysaccharide فحص منصة مقرونا حساسة للغاية تحليل الكربوهيدرات بصمات الأصابع

Summary

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Abstract

العديد من الكائنات الدقيقة قادرة على إنتاج وإفراز exopolysaccharides (EPS)، والتي لها آثار هامة في المجالات الطبية وتطبيقات المواد الغذائية أو في استبدال المواد الكيميائية على أساس النفطية. وصفنا منصة التحليلية ليكون آليا على نظام التعامل مع السائل الذي يسمح للتحليل سريع وموثوق بها من نوع ومقدار العائد على السهم تنتجها الكائنات الحية الدقيقة. انها تمكن المستخدم من تحديد رواية المنتجين exopolysaccharide الميكروبي الطبيعي وتحليل بصمة الكربوهيدرات من البوليمرات المقابلة خلال يوم واحد في الإنتاجية العالية (HT). باستخدام هذه المنصة، ومجموعات الضغط وكذلك المكتبات من المتغيرات السلالة التي يمكن الحصول عليها في مناهج الهندسة ويمكن فحص. منصة لديها الإعداد وحدات، والتي تسمح للفصل البروتوكول إلى قسمين رئيسيين. أولا، هناك نظام الفرز الآلي، الذي يجمع بين مختلف وحدات الكشف السكاريد: تحليل شبه كمي لviscositتشكيل ذ عبر خطوة الطرد المركزي، وتحليلا للتشكيل البوليمر عبر هطول الأمطار الكحول وتحديد المحتوى الكلي لمجموع الكربوهيدرات عن طريق التحول الفينول الكبريتيك الحمضية. هنا، فمن الممكن أن يحجب ما يصل الى 384 سلالات في التشغيل. ويقدم الجزء الثاني تحليل أحادي السكاريد مفصل لجميع المنتجين EPS اختيار المحددة في الجزء الأول من خلال الجمع بين اثنين من وحدات أساسية هي: تحليل تكوين مونومر كاملة عن طريق فائقة الأداء اللوني السائل إلى جانب فوق البنفسجية وتأين بالإرذاذ الإلكتروني كشف مصيدة أيون ( UHPLC للأشعة فوق البنفسجية-ESI-MS)، وتحديد البيروفات باعتبارها المستبدلة البوليمر (وجود كيتال البيروفات) عن طريق الأكسدة الأنزيمية أن يقترن إلى تشكيل اللون. جميع الوحدات التحليلية من هذا المنبر الفحص ويمكن الجمع بين بطرق مختلفة ويتم تعديلها لتلبية الاحتياجات الفردية. بالإضافة إلى ذلك، فإنها يمكن أن تكون جميع التعامل معها يدويا أو يؤديها مع نظام التعامل مع السائل. وبالتالي، فإن جيش التحرير الشعبى الصينى فحصtform يتيح مرونة هائلة من أجل تحديد EPS المختلفة.

Introduction

exopolysaccharides الميكروبية (EPS) هي مجموعة متنوعة للغاية من الناحية الهيكلية من البوليمرات التي تلبي الوظائف البيولوجية المختلفة. وعادة ما يتم بناؤها من وحدات تكرار المعقدة، والتي تتميز أنواع مختلفة من أحادية (السكر ومشتقات السكر والأحماض السكر)، والروابط بين هذه مونومرات وبدائل لهم. التنوع الهيكلي من السكريات الميكروبية يمنح خصائص مختلفة وليس لأعضاء هذه الفئة جزيء، والذي يسمح تطبيقها في مختلف المجالات مثل المواد الغذائية ^1، ومستحضرات التجميل ^2،3، بناء الكيمياء ⁴ أو ⁵ لمعالجة المياه. لتوسيع مجال تطبيق هذه البوليمرات الحيوي القائم وهذه المستدامة تحديد السكريات الميكروبية الطبيعية رواية فضلا عن الهندسة من المتغيرات الهيكلية يمثل النهج الواعدة. وفي كلتا الحالتين، لا بد من طريقة فحص سريع بسرعة لمسح عدد كبير من سلالات ميكروبية لtheiص تشكيل السكاريد، وتحليل منتجاتها. لذلك، وقد وضعنا مؤخرا 96-كذلك منصة HT-فحص لتحليل الإنتاج السكاريد الميكروبي من العزلات الطبيعية أو متغيرات سلالة هندسيا يتضمن تحديد تكوين أحادى ^6.

تطبيق هذا النظام الأساسي لجولة الفحص الأولى من ~ 500 العزلات الطبيعية يسمح لنا بتحديد فقط حوالي 10 إلى 20٪ من سلالات معزولة عن كونه قادرا على إنتاج EPS (لا تظهر البيانات). وهذا يعني أن 80-90٪ من سلالات تحليلها لم تسفر EPS وفقا للشروط تطبيقها، وبالتالي، كان مزيد من التحليل للبصمة مفصلة الكربوهيدرات ليست ضرورية. وبما أن هذا التعريف متطورة للغاية في تكوين أحادى هي عملية تستغرق وقتا طويلا، وخاصة لتحليل البيانات، سريع طريقة الفرز المسبق لتحديد السلالات إيجابية في إنتاج EPS، من شأنه أن يزيد بشكل كبير من كفاءة. وعلاوة على ذلك، الكواشف،وسوف يخفض المواد الاستهلاكية وقياس الوقت في UHPLC للأشعة فوق البنفسجية-ESI-MS. بالإضافة إلى ذلك، وحدات تحليلية مختلفة، في حين من جهة جعل طريقة موثوق بها للغاية، هي من ناحية أخرى يعقد المناولة اليدوية لأكثر من اثنين من لوحات 96-جيدا في موازاة ذلك، وعلى هذا النحو تقييد القدرة الكاملة للطريقة. لهذه الأسباب، قررنا تطوير منصة الفرز الآلي. ولذلك، فإننا الجمع بين شكل وحدات من تقنية الكربوهيدرات بصمة القائمة مع طريقة كشف سريع مؤتمتة بالكامل من المحتوى الكلي السكر، على أساس قياس الامتصاصية.

طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية لا تزال تمثل الطريقة المفضلة لتحديد سريع من إجمالي محتوى الكربوهيدرات من البكتريا والنبات السكريات ^7،8. وقد وصفت هذه الطريقة لأول مرة دوبوا وآخرون. ⁽⁹⁾ وتكييفها لمختلف التطبيقات وأحجام العينات، وحتى على نطاق صغير في لوحات 96-جيدا ^10،11. وPHEيقيس طريقة نول-الكبريتيك الحمضية محتوى الكربوهيدرات الكلي من حيث القيمة واحد، summating كل أحادى، بلازميدة قليلة القسيمات والكربوهيدرات البوليمرية من العينات.

أخذ هذه الجوانب في الاعتبار، واختيار وسيلة مناسبة زراعة ضروري لتطبيق هذا الأسلوب. وسائل الإعلام المعقدة التي تحتوي على بلازميدة قليلة القسيمات أو مركبات الكربوهيدرات البوليمرية مثل خلاصة الخميرة قد يؤدي إلى محتوى البوليمر تغيير، وبالتالي، يجب بدقة تجنبها. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام كميات عالية من السكريات مثل C-مصدر لزراعة السلالات. مستويات عالية من الكربوهيدرات المتبقية من عملية زراعة قد تتدخل سلبا مع قياس محتوى EPS.

لذلك، ينصح استخدام السكريات محددة ونقية. في تجاربنا كنا الجلوكوز لزراعة الخلايا. تم تخفيض مستوى السكر المتبقية بعد زراعة عن طريق هلام الترشيح وتحديد طريق الجلوكوز الفحص. وأخيرا، أي ما يعادل نسبة الجلوكوزوحسبت الصورة من السكريات عن طريق طرح الجلوكوز المتبقية بعد هلام الترشيح من المحتوى الكلي لمجموع الكربوهيدرات التي تم الكشف عنها باستخدام طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية. هلام الترشيح والجلوكوز فحص في تركيبة مع طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية ضمان نتائج يمكن الاعتماد عليها وتكون قادرة على أن تكون الأولى، ونظام الكشف لدينا مؤتمتة بالكامل.

وأدرجت اثنين من وحدات تحليلية جديدة في منصة الفرز الآلي لزيادة كمية المعلومات من نظام EPS-كشف: هطول الأمطار ومراقبة زيادة اللزوجة.

العديد من EPS مختلفة - على سبيل المثال succinoglycan، زنتان والقولون حمض ¹² - تشير التقارير إلى أن يتم تعديل مع غير الكربوهيدرات البيروفات كيتال على مواقع السكر C4 و C6. تلك ketals البيروفات (تماما كما استرات succinyl نصف والأحماض uronic) المساهمة في طبيعة polyanionic وبالتالي، إلى prope البدنيrties من البوليمر من خلال التفاعل عبر الجسور ثنائي التكافؤ الموجبة ^13. من أجل تحديد تلك البوليمرات خاصة تأسست تحديد البيروفات كما وحدة تحليلية إضافية أخرى. وهذا يزيد من المعلومات حول بدائل السكاريد والخصائص العيانية المحتملة.

الجمع بين جميع الوحدات تمكن من تحديد EPS مختلفة فضلا عن تقرير سريع وفعال من المنتجين EPS. من خلال هذا النهج على منصة الفحص يمكن تقسيمها إلى قسمين رئيسيين (الشكل 1). ضمن الفرز الآلي (الجزء الأول) سير العمل يحدث مؤتمتة بالكامل (الجدول 1) إلى تحديد مسبق بسرعة EPS إنتاج السلالات. تحليل الكربوهيدرات بصمة (الجزء الثاني) تحدد كميا تكوين مونومر من EPS التي تنتجها سلالات انتقاؤه. وبالتالي، تم تصغير تحليل البيانات من أجل تحسين فحص مجموعات سلالة كبيرة. هذاتوفر إمكانية تحليل 384 سلالات في واحدة المدى الفرز الآلي ومع اثنان أشواط التي من الممكن يوميا من 768 سلالات يوميا. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل الكربوهيدرات بصمة يعطي أكثر تفصيلا لمحة عامة عن كل EPS التي تم تحديدها. وهذا يتيح للتحليل وجهت وتحديد فقط مختلفة قليلا المتغيرات EPS أو جديدة تماما بالمقارنة مع الهياكل الكيميائية التي سبق وصفها من EPS.

Protocol

1. فحص الآلي

ملاحظة: تتم جميع الخطوات مناولة السائل مع نظام مناولة السائل الروبوتية. يتم تقديم تشكيلة المنضدة الروبوت في الشكل 2. يتم تخزين كافة المواد الاستهلاكية في دائري التخزين، مالم يذكر غير ذلك. لجميع الفرز الآلي الخطوات تتلاعب الروبوتية (RM) ينقل المواد الاستهلاكية، (بئر عميقة لوحة (برنامج عمل الدوحة)؛ الجزئي لوحة عيار (MTP)؛ البلمرة لوحة سلسلة من ردود الفعل (PCR لوحة) وهلم جرا) بين المواقف دائري (CP ) ومواقف المنضدة (الرغبة في الدفع). يتم تنفيذ كافة الخطوات ماصة مع 96 قناة ماصة الذراع، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. مبرمجة جميع الخطوات ويتم تنفيذ تلقائيا في شكل 96-جيدا.

1. سلالة زراعة (المهمة 1 في الشكل 1)
   ملاحظة: التعامل مع التلقيح من EPS المفترضة إنتاج سلالات وختم لوحات زراعة تحت ظروف معقمة (تدفق الصفحي). والآليفحص سريع يمكن التعامل مع أربعة لوحات 96-جيدا في التشغيل. تم اختبار سلالات مختلفة من عدة أجناس بالفعل ^6.
   1. تطعيم يدويا قبل ثقافة (1 مل EPS وسائل الإعلام في برنامج عمل الدوحة) مع المكرر 96-دبوس من 96-جيدا لوحة الأسهم الجلسرين. تغطية لوحة مع فيلم الختم تنفس لتجنب التبخر والسماح للتهوية. احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على 1000 دورة في الدقيقة على الخطة متوسطة المدى شاكر.
   2. تحصين الثقافة الرئيسية (990 ميكرولتر EPS وسائل الإعلام في برنامج عمل الدوحة) عن طريق نقل 10 ميكرولتر من قبل ثقافة باستخدام 50 ميكرولتر من 12 قناة متعددة ماصة واحتضان تحت نفس الشروط التي قبل الثقافة. تأخذ علما بجميع السلالات التي لا تنمو.
2. إعداد روبوت المنضدة وكاروسيل التخزين
   1. توفير جميع المواد الاستهلاكية الواردة في المواد والمعدات إلى الموضع الصحيح في دائري التخزين. إضافة 990 ميكرولتر من الماء المقطر مزدوجة ([ده ₂ O) في كل بئر من برنامج عمل الدوحة لل1: 100 التخفيفات لعشرالبريد الجلوكوز فحص (دائري موقف 4-1 إلى 4-4).
   2. ترتيب الحوض الصغير 250 مل تحتوي على 150 مل من ده ₂ O في موقف المنضدة (WTP) 11.
   3. إيداع الحوض الصغير 250 مل تحتوي على 50 مل الجلوكوز الفحص الكاشف مزيج (4 مل 500 ملي فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 5.7)، 1.5 مل 50 ملي 2.2 azinobis- (3ethylbenzthiazoline) حامض السلفونيك -6-2 مل 100 U الجلوكوز أوكسيديز، 10 ميكرولتر 1000 U الفجل البيروكسيديز و42.49 مل ده ₂ O) في موقف الرغبة في الدفع 1-2.
   4. وضع اثنين من الخطط متوسطة الأجل F-القاع وهمية فارغة في موقف الرغبة في الدفع 3-1 و3-2.
   5. إزالة فيلم الختم للتنفس، وتخصيص الثقافات الرئيسية في مواقف دائري (CP) 1-1 إلى 1-4 وبدء برنامج الروبوت الآلي.
3. موازنة لوحات جل الترشيح
   ملاحظة: لوحات الترشيح هلام التي يتم استخدامها أثناء هذا الفحص يمكن إعادة استخدامها. لهذا، وغسل وأجهزة الطرد المركزي ثلاث مرات كل 150 ميكرولتر من ده ₂ O في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية. بعد ذلك، تخزين عند 4° C مع 75 ميكرولتر من 20٪ من الإيثانول، وتغطي مع حصيرة غطاء السيليكون.
   1. نقل 250 مل الحوض الصغير (CP 5-7) مع 5 ملي العازلة خلات الأمونيوم (درجة الحموضة 5.6) إلى الرغبة في الدفع 3-3.
   2. نقل لوحات هلام الترشيح (CP 1-6 و1-7 و2-6 و2-7) من دائري إلى WTPs 4-1 إلى 4-4.
   3. نضح 150 ميكرولتر من العازلة خلات الأمونيوم باستخدام 200 نصائح ميكرولتر والاستغناء في مركز كل لوحات هلام الترشيح للموازنة.
   4. نقل لوحات هلام الترشيح في أجهزة الطرد المركزي (2000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية).
   5. نقل لوحات إلى المنضدة، كرر الخطوات 1.3.3، 1.3.4 و 1.3.3. لا كرر الخطوة الطرد المركزي لتجنب الجفاف لوحات هلام الترشيح. تخزين لوحات هلام الترشيح معايرتها مرة أخرى إلى داخل دائري.
4. إزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي (المهمة 1 في الشكل 1)
   ملاحظة: من أجل ضمان خلفية منخفضة في إطار نهج فحص وتحليل الخلية الحرةEPS تحتوي على supernatants فقط وإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي بعد زراعة.
   1. نقل الثقافة الرئيسية برنامج عمل الدوحة من دائري (1-1 إلى 1-4) في أجهزة الطرد المركزي (4300 x ج لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية).
   2. إعداد المنضدة عبر RM لمعالجة ثقافة الرئيسية.
      ملاحظة: للحصول على خطوات 1.4.2 إلى 1.4.3.5 نظام يعالج دائما صفيحتين بالتوازي ثم تكرار جميع الخطوات مع لوحات المقبلين.
      1. لهطول الأمطار قبل الترشيح نقل الخطة المتوسطة الأجل من CP 6-1 و6-2 لالرغبة في الدفع 4-1 و5-1. نقل الخطط متوسطة الأجل درجة الحموضة مؤشر من CP 7-1 و7-2 على الرغبة في الدفع 4-2 و5-2.
      2. نقل لوحة الترشيح جنبا إلى جنب مع لوحة جامع من CP 2-1 و2-2 على الرغبة في الدفع 4-3 و5-3. انتقال إلى ثقافة الرئيسية برنامج عمل الدوحة 1-1 و 1-2 من أجهزة الطرد المركزي إلى الرغبة في الدفع 4-4 و5-4.
      3. إعداد وحدات تحليلية.
         ملاحظة: خذ 200 نصائح ميكرولتر من تخزين معلومات سرية (موقف 2-1 إلى 2-4). من أجل الحد من المواد الاستهلاكية، واستخدام نفس بلاغ مجموعة لخطوة 1.4.3.1.
         1. نقل 180 ميكرولتر من طاف الثقافة الرئيسية لوحة الترشيح. نضح 150 ميكرولتر من طاف الثقافة الرئيسية والاستغناء عن 50 ميكرولتر في الخطة المتوسطة الأجل للهطول قبل الترشيح و 100 ميكرولتر إلى لوحة درجة الحموضة مؤشر.
            ملاحظة: حق تقرير درجة الحموضة ليست ضرورية. ومع ذلك، بعد إضافة 12.5 مل الميثيل المؤشر الأحمر (50 ملغ في 50 مل ايثانول) في كل بئر مع ماصة ذات المراحل المتعددة التي يشير السلالات المنتجة للحمض عالية. يمكن أن تكون هذه المعلومات مفيدة لتجنب تثبيط النمو (في انخفاض الرقم الهيدروجيني) لمزيد من الزراعات، على سبيل المثال لفحص الثاني مع تركيز عازلة العالي. وعلاوة على ذلك، قد منخفضة الحموضة أيضا تحفز إنتاج EPS من أجل حماية الخلية ضد البيئة الحمضية.
         2. كرر الخطوة 1.4.3.1 لوحة الثقافة الرئيسية الثانية. استخدام الطازجة بلاغ مجموعة.
         3. نقل لوحات الترشيح لأجهزة الطرد المركزي وإزالة جميع لوحات أخرى من المنضدة إلى مواقف وطنهم في carousايل.
         4. كرر 1.4.2.1 خطوات ل1.4.3.3 لوحة الثقافة الرئيسية الثالثة والرابعة.
         5. تأخذ علما بهذه المرق التخمير، والتي انخفض عرض الترسيب بعد الطرد المركزي لوحات ثقافة الرئيسية، عندما يتم نقلها إلى (مراقبة اللزوجة) دائري.
5. 96-جيدا الترشيح لإزالة خلية كاملة (المهام 2 في الشكل 1)
   ملاحظة: لضمان إزالة الخلايا من مرق التخمير لزج يتم تضمين خطوة الترشيح في الفرز.
   1. أجهزة الطرد المركزي لوحات الترشيح في 3000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 20 درجة مئوية واعادتهم الى موقف البيت دائري بهم.
   2. إعداد لوحات هلام الترشيح.
      1. نقل معايرتها لوحات هلام الترشيح من دائري لأجهزة الطرد المركزي وتدور في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
      2. نقل لوحات هلام الترشيح من أجهزة الطرد المركزي إلى الرغبة في الدفع 01/04 إلى 44.
      3. نقل هلام جديدةلوحات -filtration جامع من CP (3-1 إلى 3-4) إلى الرغبة في الدفع (5-1 إلى 5-4).
      4. نقل لوحات هلام الترشيح معايرتها (الرغبة في الدفع 4-1 إلى 4-4) لوحات جامع الطازجة (5-1 إلى 5-4).
      5. تنظيف المنضدة باستثناء مواقف 5-1 و5-2 و5-1 تحريك الموقف إلى موقف 4-1.
   3. إعداد المنضدة عبر RM لمعالجة الرواشح.
      ملاحظة: للحصول على خطوات 1.5.3 إلى 1.6.3.5 النظام يتعامل مع اثنين من لوحات بالتوازي ويكرر كل الخطوات مع لوحات المقبلين.
      1. نقل 50 نصائح ميكرولتر من دائري (4-6 و4-7) إلى الرغبة في الدفع 3-3 و3-4.
      2. نقل لوحات الترشيح من CP 3-1 إلى 3-2 على المنضدة (4-4 و5-4).
      3. نقل برنامج عمل الدوحة (1: 100 تمييع) للكشف عن استهلاك الجلوكوز من CP 4-1 و4-2 على الرغبة في الدفع 4-2 و5-1.
      4. نقل الخطة المتوسطة الأجل للهطول الثاني بعد الترشيح من CP 8-1 و8-2 على الرغبة في الدفع 4-3 و5-3.
      5. رفع لوحات الترشيح من لوحة جامعالصورة (الرغبة في الدفع 4-4 و5-4)، ونقلها إلى WTP 3-1 و3-2.
   4. إعداد وحدات تحليلية بعد الترشيح. من أجل الحد من المواد الاستهلاكية، واستخدام نفس بلاغ مجموعة لاتخاذ خطوات 1.5.4.1 و1.5.4.3.
      1. خذ 50 نصائح ميكرولتر وماصة قسامة 10 ميكرولتر من الترشيح لبرنامج عمل الدوحة (1: 100 تمييع) لالجلوكوز فحص (استهلاك الجلوكوز).
      2. ماصة 35 ميكرولتر من الترشيح لمركز لوحة هلام الترشيح معايرتها و 50 ميكرولتر من الخطة المتوسطة الأجل التي يتم استخدامها لهطول الأمطار.
      3. كرر الخطوات من 1.5.4.1 إلى 1.5.4.2 لوحة الترشيح الثانية.
      4. نقل لوحات هلام الترشيح لأجهزة الطرد المركزي ونقل جميع لوحات أخرى من المنضدة إلى مواقف منزل في دائري.
      5. كرر الخطوات من 1.5.3.1 إلى 1.5.4.4 لوحة الترشيح الثالث والرابع.
      6. بعد تخزين جميع لوحات ظهر في في دائري يحيط علما supernatants لزجة جدا، كما يتضح من المخلفات في لوحة تصفية (ت عاليةالسيطرة iscosity بعد خطوة الترشيح). وعدم وجود الترشيح يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة في الوحدات التحليلية التالية.
6. إزالة الجلوكوز عبر 96-جيدا جل الترشيح (المهمة 3 في الشكل 1)
   1. أجهزة الطرد المركزي لوحات هلام الترشيح في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية.
   2. إعداد المنضدة عبر مناور الروبوتية لمعالجة هلام الرواشح.
      1. توفير 50 ​​نصائح ميكرولتر من دائري (5-3 و5-4) إلى الرغبة في الدفع 3-3 و3-4.
      2. لتحديد مستوى السكر المتبقية بعد هلام الترشيح نقل اثنين من الخطط متوسطة الأجل من CP 9-1 و9-2 على الرغبة في الدفع 4-1 و5-1.
      3. للتعرف على طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية نقل اثنين من الخطط متوسطة الأجل من CP 8-5 و8-6 على الرغبة في الدفع 4-2 و5-2.
      4. نقل اثنين من لوحات هلام الترشيح من أجهزة الطرد المركزي إلى الرغبة في الدفع (4-3 و5-3).
      5. رفع لوحات هلام الترشيح من لوحة جامع (4-3 و5-3)، ونقلها إلى الاستعداد للدفع 3-1 و3-2.
   3. إعداد المنضدة عبر مناور الروبوتية لمعالجة هلام الرواشح.
      ملاحظة: من أجل الحد من المواد الاستهلاكية، واستخدام نفس الخطوات ل1.6.3.1 و1.6.3.2 بين مجموعة الحافة.
      1. للكشف عن مستوى السكر المتبقية بعد هلام الترشيح (01:10 تمييع) تأخذ 50 نصائح ميكرولتر ونقل 25 ميكرولتر من ده ₂ O (الرغبة في الدفع 1-1) إلى الخطة المتوسطة الأجل جديدة. نضح 20 ميكرولتر من ده ₂ O (الرغبة في الدفع 1-1)، 5 ميكرولتر من الهواء و 5 ميكرولتر من هلام الترشيح والاستغناء في نفس اللوحة.
      2. لماصة الفينول الكبريتيك، وحامض طريقة 20 ميكرولتر من هلام الترشيح إلى الخطة المتوسطة الأجل.
      3. كرر الخطوات 1.6.3.1 و1.6.3.2 لوحة هلام الترشيح الثانية.
      4. نقل جميع لوحات من المنضدة إلى مناصب المنزل في شكل دائري بهم.
      5. كرر 1.6.2.1 خطوات ل1.6.3.4 لوحة هلام الترشيح الثالث والرابع.
7. وحدات الجلوكوز فحص
   1. إعداد المنضدة عبر مناور الروبوتية لأداء الجلوكوز كماقل.
      1. نقل برنامج عمل الدوحة (1: 100 التخفيف) من CP 4-1 و4-4 على الرغبة في الدفع 5-1 و5-4.
      2. نقل كافة الخطط متوسطة الأجل من CP 9-5 و9-8 على الرغبة في الدفع 4-1 و4-4.
      3. خذ 200 نصائح ميكرولتر وتخلط التخفيف بواسطة الشفط والاستغناء عن عشرة أضعاف حجم 180 ميكرولتر. ثم ماصة قسامة 50 ميكرولتر من الخطة المتوسطة الأجل.
      4. كرر الخطوات 1.7.1.2 و1.7.1.3 لجميع DWPs أربعة (1: 100 تمييع).
      5. إزالة جميع DWPs (5-1 إلى 5-4) من المنضدة.
   2. إعداد المنضدة لبدء الجلوكوز الفحص.
      1. لتحديد مستوى السكر المتبقية بعد نقل هلام الترشيح جميع الخطط متوسطة الأجل من CP (9-1 إلى 9-4) إلى الرغبة في الدفع (5-1 إلى 5-4).
      2. نقل لوحة المعايرة الجلوكوز فحص - تحتوي على ثلاث مرات 50 ميكرولتر من التركيزات التالية الجلوكوز (90، 45، 18، 9، 4.5، 1.8، 0.9، 0.45 و 0 ملغم / لتر) - من CP 9-9 إلى الرغبة في الدفع 3- 3.
      3. خذ 200 نصائح ميكرولتر ونضح 50 ميكرولتر من الجلوكوز الفحص الكاشف مزيج من WTP 1-2، لبدء الفحص الأول. نقل الخطط متوسطة الأجل في حاضنة (30 درجة مئوية في 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة).
      4. تعيين جدول زمني لبدء البرنامج مع 5 تأخير دقيقة في بين لوحات.
      5. بعد 30 دقيقة من الحضانة نقل لوحات من الحاضنة إلى الخطة المتوسطة الأجل للقارئ وسجل الامتصاصية في 418 و 480 نانومتر.
      6. بعد قياس نقل لوحات لموقف وطنهم في دائري.
8. إعداد الهطول
   ملاحظة: من أجل تقييم إنتاج EPS إجراء هطول الأمطار من طاف مع 2-بروبانول قبل وبعد خطوة الترشيح الأولى. وعلاوة على ذلك، وتقييم امتصاص البوليمر على غشاء فلتر عن طريق الملاحظة من الألياف ورقائق في البداية، ولكن ليس في هطول الثاني.
   تحذير: المؤشر 2-بروبانول باعتباره سائل قابل للاشتعال بشكل صارم تحت غطاء الدخان.
   1. إزالة جميع لوحات هطول الأمطار (CP 6-1 إلى 6-4 و8-1 ل04/08) من دائري. و أضفيدويا 150 ميكرولتر من 2-بروبانول إلى كل بئر مع 12.5 مل ماصة متعددة الخطوات.
   2. تغطية جميع الخطط متوسطة الأجل مع حصيرة غطاء سيليكون ويهز في درجة حرارة الغرفة (RT) (10 دقيقة في 900 دورة في الدقيقة). بصريا مراقبة الألياف أو تقشر تشكيلات بعد ان اطمأن التي تشير إلى إنتاج EPS.
9. طريقة الفينول الكبريتيك حمض
   تحذير: التعامل مع المركز الكبريتيك، وحامض الفينول وتحت غطاء الدخان. الفينول هو عامل تآكل والتشوهات الخلقية.
   1. للتعرف على طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية، وإزالة لوحات (CP 8-5 إلى 8-8) من دائري ووضعها في نظام التعامل مع السائل (المركز 4-8). تتضمن لوحة المعايرة مع 20 ميكرولتر من تركيزات الجلوكوز مختلفة (10 و 5 و 2.5، 1، 0.5، 0.25، 0.1، 0.05، 0 غرام / لتر) في يثلث.
   2. وضع حاوية النفايات في الموضع 1، مربع تلميح 200 ميكرولتر في موضع 2 وأقل مستوى 250 مل 110 مل الفينول الكبريتيك حمض (الطازجة على with18.3 الجليد مل الفينول 5٪ (ث / ت) في [ده ₂ O و91،7 مل من اضرب. قحمض ulfuric) في موقف 3.
   3. استخدام ماصة 8 قنوات مع 300 نصائح ميكرولتر ونقل 180 ميكرولتر من الفينول الكبريتيك حمض في كل صف من جميع لوحات.
   4. تغطية جميع الخطط متوسطة الأجل مع الأغطية، ومزجها عن طريق هز (5 دقائق في 900 دورة في الدقيقة، RT)، واحتضان لهم لمدة 35 دقيقة في 80 درجة مئوية في الفرن لمدة رد الفعل اللون. بعد تهدئة تحت غطاء الدخان، وقياس الانقراض في 480 نانومتر.
10. اختيار EPS إيجابي Supernatants (العمل 4 في الشكل 1)
    1. لتقييم إنتاج EPS، حدد تلك السلالات من الفرز الآلي التي تلبي اثنين على الأقل من المعايير الثلاثة ايجابيات (مراقبة اللزوجة 2.6.1 و2.6.2، والكشف عن البوليمر 2.6.3، الجلوكوز يعادل 2.6.5). نقل الرواشح المتبقية من الضربات الإيجابية إلى الخطة المتوسطة الأجل جديدة لمزيد من المعالجة.
       ملاحظة: عندما تتم تغطية لوحات مع فيلم ختم الألومنيوم يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل. ضمن ذلك الوقت determinaنشوئها بصمة الكربوهيدرات يحتاج إلى أن يقوم به.

2. الكربوهيدرات بصمات الأصابع

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات للبصمة الكربوهيدرات يدويا.

1. هلام الترشيح للSupernatants إيجابي (المهمة 5 في الشكل 1)
   ملاحظة: جل الترشيح ضروري حيث لا يوجد الترشيح اليسار من الفرز الآلي. هلام الترشيح مع حجم أكثر من 35 النتائج ميكرولتر في كفاءة تنقية انخفضت.
   1. إعداد موازنة لوحات هلام الترشيح عن طريق الاستغناء عن 150 ميكرولتر من العازلة خلات الأمونيوم في جميع الآبار عبر 12.5 مل ماصة متعددة الخطوات.
   2. نقل لوحة هلام الترشيح في أجهزة الطرد المركزي (2000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية).
   3. كرر الخطوات من 2.1.1، 2.1.2 و 2.1.1 مرة أخرى. أجهزة الطرد المركزي لوحة هلام الترشيح في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية قبل استخدامها مرة أخرى.
   4. ماصة 35 ميكرولتر من الترشيح فيوسط لوحة هلام الترشيح باستخدام 12 قناة 50 ميكرولتر ماصة.
   5. أجهزة الطرد المركزي لوحة هلام الترشيح في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة عند 20 درجة مئوية ومن ثم رفعه من لوحة جامع.
   6. إعداد الجلوكوز فحص قبل التحلل: إجراء تخفيف 01:10 بإضافة 45 ميكرولتر من ده ₂ O و 5 ميكرولتر من هلام الترشيح مع ميكرولتر ماصة 12 قناة 50، وتغطي الخطط متوسطة الأجل مع حصيرة غطاء سيليكون.
      ملاحظة: لتحديد الصحيح لقيمة الجلوكوز من البوليمر، وقياس نسبة السكر قبل التحلل وطرح عليه من نسبة السكر كميا بعد خطوة التحلل.
   7. إعداد البيروفات-فحص قبل التحلل: إجراء تخفيف 01:20 باستخدام 12 قناة 200 ميكرولتر ماصة لإضافة 95 ميكرولتر من ده ₂ O، ونقل 5 ميكرولتر من هلام الترشيح إلى كل بئر وختم الخطة المتوسطة الأجل مع حصيرة غطاء السيليكون .
2. 96-جيدا مايكرو الحلمأة (العمل 6 في الشكل 1)
   ملاحظة: تسخينالفرن حضانة (بما في ذلك حمام الرمل) إلى 121 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1.5 ساعة قبل استخدام. وقد تم تطوير جهاز لقط خاص لتجنب التبخر خلال خطوة صغيرة التحلل تحجيمها.
   1. اتخاذ PCR لوحة جديدة ونقل 20 ميكرولتر من هلام الترشيح مع ميكرولتر ماصة 12 قناة 50.
      تحذير: Trifluoroacetic الحمض هو حمض تآكل وسامة. حل الأمونيوم غير قابلة للتآكل. التعامل مع كل من المواد الكيميائية فقط تحت غطاء الدخان.
   2. إضافة 20 ميكرولتر من 4 حمض M trifluoroacetic مع 1.25 مل ماصة متعددة المراحل لكل بئر. ثم تغطية PCR لوحة مع الاستومر (TPE) غطاء حصيرة ووضع PCR لوحة في الجهاز لقط خاص.
   3. مزيج من الحلول عبر قلب الجهاز لقط عشر مرات. وضع PCR لوحة في جهاز للطرد المركزي وتدور في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة لجمع كل السائل على الجزء السفلي. وضع PCR لوحة إلى جهاز لقط وتأمين الجهاز مع مسامير.
   4. ضع الجهاز لقط المضمون في حمام الرمل قبل ساخنة واحتضان لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
   5. إزالة الجهاز لقط من حمام الرمل وندعه يبرد لRT.
   6. إزالة مسامير وتدور مرة أخرى في أجهزة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة من أجل جمع كل المكثفات في الجزء السفلي من الآبار ومنع التلوث خلال إزالة حصيرة الغطاء.
   7. إضافة 3.2٪ محلول الأمونيا لضبط درجة الحموضة إلى تقريبا. 8 باستخدام 12 قناة 200 ميكرولتر ماصة. تغطية PCR لوحة مع حصيرة غطاء TPE والتخلص منه يدويا باستخدام جهاز لقط.
   8. بعد تحييد أجهزة الطرد المركزي PCR لوحة في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة.
3. عالية الإنتاجية-1-فينيل-3-ميثيل-5-pyrazolone (HT-PMP) -derivatization من الكربوهيدرات (المهمة 7 في الشكل 1)
   1. نقل 25 ميكرولتر من هيدروليساتي تحييد في PCR لوحة جديدة باستخدام ماصة 12 قناة 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: بعد أخذ قسامة، والتحقق من neutralization من السائل المتبقي في لوحة المائي عبر مضيفا 12.5 الفينول ميكرولتر المؤشر الأحمر (0.05 غ أحمر الفينول في 5 مل 20٪ من الإيثانول) مع 1.25 مل ماصة متعددة الخطوات. لا derivatized جميع الآبار التي لا تتحول إلى اللون الوردي (درجة الحموضة 8) بشكل صحيح.
   2. إضافة 75 ميكرولتر اشتقاق كاشف مزيج (125 PMP ملغ و 7 مل الميثانول، 3.06 مل ده ₂ O، و 438 ميكرولتر 3.2٪ محلول النشادر)، وتغطي لوحة مع حصيرة غطاء TPE.
   3. بعد تهز PCR لوحة في أجهزة الطرد المركزي جهاز لقط لوحة في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة لتجميع كل السائل في الجزء السفلي.
   4. المركز اشتقاق من PCR لوحة في PCR-cycler على عند 70 درجة مئوية لمدة 100 دقيقة تليها التبريد إلى 20 درجة مئوية.
   5. نقل قسامة 20 ميكرولتر في الخطة المتوسطة الأجل جديدة باستخدام 12 قناة 50 ميكرولتر ماصة. ثم استخدام 12 قناة 200 ميكرولتر ماصة وإضافة 130 ميكرولتر 19.23 ملي حمض الخليك (0.962 مل 1 M حمض الخليك + 49.038 مل ده ₂ O) إلى كل سطر. مزيج مباشرة عبر aspiratجي والاستغناء عن (الحد الأدنى ست مرات)، ونقل كل السائل إلى لوحة 0.2 ميكرون فلتر مع لوحة الخطة المتوسطة الأجل جامع.
   6. أجهزة الطرد المركزي لوحة (1000 x ج لمدة 5 دقائق)، وإزالة لوحة تصفية، وختم الخطة المتوسطة الأجل مع حصيرة غطاء سيليكون ووضع الخطة المتوسطة الأجل في UHPLC للأشعة فوق البنفسجية-ESI-MS لتحديد البصمة الكربوهيدرات ^14.
4. إعداد الجلوكوز، فحص
   1. إجراء تخفيف 01:10 عبر إضافة 45 ميكرولتر من ده ₂ O و 5 ميكرولتر من هيدروليساتي تحييد باستخدام 12 قناة 50 ميكرولتر ماصة وتغطية الخطط متوسطة الأجل مع حصيرة غطاء سيليكون. إضافة ثلاث مرات 50 ميكرولتر من المعايير الجلوكوز مختلفة (500، 250، 100، 50، 25، 10، 5، 2.5 و 0 ميكرومتر) إلى الخطة المتوسطة الأجل الجديدة المستخدمة لمعايرة.
   2. إضافة 50 ميكرولتر من الجلوكوز الفحص الكاشف مزيج (وصفة step1.2.3) باستخدام 12 قناة 50 ميكرولتر ماصة. ثم تغطية لوحات مع حصيرة غطاء السيليكون واحتضان عند 30 درجة مئوية و 400 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في الخطة متوسطة المدى الحاضنة.
   3. مباشرة بعد حضانة جعل الامتصاصية قراءة في الخطة المتوسطة الأجل للقارئ في 418 و 480 نانومتر في قارئ الخطة المتوسطة الأجل. لحساب تركيز الجلوكوز إجراء المعايرة الخطية كما يؤديها في الخطوة 2.6.4.
5. إعداد البيروفات-فحص
   1. إجراء تخفيف 01:20 باستخدام 12 قناة 200 ميكرولتر ماصة. إضافة 95 ميكرولتر من ده ₂ O ونقل 5 ميكرولتر من هيدروليساتي تحييد إلى كل بئر. تغطية الخطة المتوسطة الأجل مع حصيرة غطاء السيليكون.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من-البيروفات الفحص الكاشف مزيج (3 مل 1 ملم N - (carboxymethylamino-الكربونيل) -4.4' مكرر (dimethylamino) -diphenylamine ملح الصوديوم (DA-64)، و 300 ميكرولتر 10 ملي ثيامين بيروفوسفات، 60 ميكرولتر 100 ملي هيدرات كلوريد المغنيسيوم، و 2.4 مل 500 ملي فوسفات البوتاسيوم البخاخ (5.7 درجة الحموضة)، 30 ميكرولتر 100 U البيروفات أوكسيديز، 12 ميكرولتر 1000 U الفجل البيروكسيديز و24.19 مل ده ₂ O) باستخدام 12 قناة 200 ميكرولتر ماصة.
   3. تغطية لوحات مع غطاء سيليكون حصيرة لالثانية احتضان عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. مباشرة بعد الامتصاصية التدبير حضانة في الخطة المتوسطة الأجل للقارئ في 727 و 540 نانومتر.
6. تقييم جميع نتائج الفرز الآلي والكربوهيدرات بصمات الأصابع.
   1. أخذ علما بهذه العينات التي تظهر انخفاض الترسيب بعد أن تم طرد لوحات ثقافة الرئيسية وتخزينها إلى دائري (مراقبة اللزوجة خطوة 1.4.1). العينات التي لا تظهر تشكيل بيليه إيجابية (المعيار 1 للفحص الآلي).
   2. يحيط علما supernatants لزجة جدا، والتي يتضح من المخلفات في لوحة تصفية بعد خطوة الترشيح (اللزوجة العالية تحكم خطوة 1.5.4.6). وعدم وجود الترشيح يمكن أن يؤدي إلى نتيجة سلبية كاذبة في الوحدات التحليلية التالية. العينات التي تحافظ على supernatants الثقافة في تصفية الآبار إيجابية (أيضا المعيار 1 للفحص الآلي).
   3. مراقبة بصريا الألياف أو تقشر تشكيل بعد الحضانة. تدوين الملاحظات كما في الغير يشير السكريات. معدل هطول الأمطار لا مع (-)؛ هطول الأمطار منخفضة من الألياف أو رقائق مع (+) وارتفاع معدل هطول الأمطار مع (++). وعلاوة على ذلك، كشف امتصاص البوليمر على غشاء فلتر عن طريق الملاحظة من الألياف ورقائق في البداية، ولكن ليس في هطول الثاني (المعيار 2 لفحص الآلي).
   4. إجراء المعايرة الخطية لحساب تركيز الجلوكوز.
      
      الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه المعادلة.
   5. أداء المعايرة الخطية (الاستيعاب أكثر من التركيز) ما بين 5 إلى 0.1 غرام / لتر جلوكوز. حساب ما يعادل الجلوكوز من البوليمرات تحلل وتقييم من قبل المعلمات التالية: ما يعادل الجلوكوز:> 700 ملغ / لتر = إيجابية. 300-700 ملغم / لتر = المفترضة إيجابية. <300 ملغ / لتر = سلبية في ما يتعلق في شكل EPSأيون (معيار 3 للفحص الآلي).
      
      الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه المعادلة.
   6. تحديد كل الكربوهيدرات مع تحديد طريقة HT-PMP. نلخص كل الكميات وتقييم على النحو التالي:> 300 ملغ / لتر (إيجابية). 150-300 ملغ / لتر (المفترضة إيجابي) و <150 ملغ / لتر (سلبي).
   7. لحساب تركيز البيروفات إجراء المعايرة الخطية (100، 50، 25، 10، 5، 2.5، 1، 0.5 و 0 ميكرومتر). استبعاد البيروفات المتبقية في طاف، تصحيح محتوى البيروفات بعد التحلل من خلال محتوى البيروفات قبل التحلل.
      
      الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا equatأيون.

النتائج

أظهر المصادقة على طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية نتائج جيدة مع معامل التحديد (r²) من 0.9998 (الجدول 2). ل5 جم / لتر تركيز معامل الاختلاف (CV) ودقة أظهر أداء جيدا مع 1.8٪ والخطأ 2.2٪، ولكن أقل أداء لل0،25 ز / قياسي لتر مع 5.3٪ (CV) والخطأ 6.1٪ ( التحيز).

وكانت معاملات التقدير لكل من منحنيات المعايرة البيروفات الفحص (مع وبدون المصفوفة)> 0.9999 في مجموعة والمعايرة من 150 ميكرومتر (الجدول 3). وكانت معاملات التباين (CV) للأعلى وأدنى مستوى معايرة <4.6٪ وأظهرت دقة أداء جيدا جدا على نطاق المعايرة الكامل مع خطأ أقل من 3.9٪. وهكذا، أظهرت مصفوفة من الخطوة التحلل أي تأثير على فحص الأنزيمية، وهو لذلك قادرة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافلدى عودتهم البيروفات قبل وبعد التحلل.

ويبين الجدول 4 النتائج التفصيلية لثلاث سلالات جديدة المثالية على النحو المحدد بنجاح مع منصة الفرز. الجزء الأيسر من الجدول يعرض النتائج من وحدات الفرز الآلي بخصوص تشكيل اللزوجة، وإنتاج البوليمر وما يعادل الجلوكوز من التحلل الكلي التي استخدمت كمعلمات تقييم لتحليل مفصل الكربوهيدرات بصمات الأصابع. ونظرا للبصمة الكربوهيدرات القائمة على السكريات معايرة وكذلك السكريات غير معروفة، dimers وبدائل في الجزء الأيمن من الجدول. عن طريق استخدام هذه المعلومات لتكوين أحادى يمكن حساب ومقارنة مع الهياكل البوليمر المعروف بالفعل. وعلاوة على ذلك، فحص المستهدفة للتركيبات أحادى مثيرة للاهتمام والكربوهيدرات نادرة لا يمكن أن يؤديها.

أداء عال من الجزئيوقد أظهر التحليل المائي على نطاق وHT-PMP-اشتقاق في الأعمال السابقة لدينا ^14. وعلاوة على ذلك، وقد وصفت المصادقة على هلام الترشيح والبصمات الكربوهيدرات لمختلف الأجناس في منشور آخر ^6. وباختصار، فإن منصة الفحص مع هيكلها وحدات يمكن بسهولة تعديل وتكييفها مع الاحتياجات الفردية للمستخدم. الفرز الآلي للمنصة تمكن ثمانية أضعاف الإنتاجية ويعطي نتائج يمكن الاعتماد عليها. وحدات تحليلية جديدة مثل البيروفات-الفحص يمكن أن تكون متكاملة وفي تركيبة مع تحليل الكربوهيدرات بصمة أنها توفر معلومات مفصلة جدا حول EPS التي تم تحديدها. وبالتالي، فإن منصة الفحص ضروري عند البحث عن كلا الخيارين EPS معدلة بشكل طفيف ومبتكرة تماما.

الشكل 1: مخطط شامل للح حدات IGH-الإنتاجية منصة exopolysaccharide الفرز. ويشمل الفحص الآلي المهام الثلاث الأولى. بعد تزرع البكتيريا في لوحات 96-جيدا، تتم إزالة الخلايا بواسطة الطرد المركزي (مهمة 1) وترشيح 96-جيدا (مهمة 2). ثم، يتم إزالة ما تبقى من السكريات أحادى من وسائط النمو عن طريق الترشيح هلام 96-جيدا (مهمة 3). يتم تقييم EPS تحتوي على عينات في مهمة 4. بصمة الكربوهيدرات من منصة فحص تحتوي على المهام الثلاث الماضية. الرشاحة المتبقية من الزيارات الإيجابية من مهمة 2 يوفر الأساس لهلام الترشيح في مهمة 5. بعد hydrolyzation في المهمة 6 بصمة الكربوهيدرات يمكن تحليلها عن طريق أسلوب HT-PMP (عالية الإنتاجية-1-فينيل-3-الميثيل -5-pyrazolone، المهمة 7). يتم اتباع جميع المهام من قبل وحدات تحليلية مختلفة و / أو السيطرة على اللزوجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معشوقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 2: إعداد المنضدة روبوت لمنصة الفحص يتم عرض المخططات على حد سواء السائلة التعامل مع المناضد الروبوت: (أ) الروبوتية نظام مناولة السائل ومحطة معالجة (ب) السائل. (A) ويتكون الإعداد حاملة صفيحة مع اثنين من وظائف (وظائف 1-1 إلى 1-2)، والناقل للحصول على نصائح القابل للتصرف مع أربع وظائف (وظائف 2-1 إلى 2-4) وثلاث ناقلات صفيحة مع أربع وظائف كل (مواقف 3-1 إلى 3-4، 4-1 ل4-4 و5-1 ل04/05). وبالإضافة إلى ذلك، هناك دائري تخزين مع خمس ناقلات الفندق (1-5) كل سبع لوحات عميقة كذلك (برنامج عمل الدوحة) وأربع ناقلات الفندق (6-9) في كل من 21 عيار لوحات صغيرة. الأجهزة المثبتة على التعامل مع الروبوت السائل هو 96 قناة ماصة ذراع للاستخدام مع نصائح للتصرف ومناور الروبوتية (RM) التي تتحرك لوحات / المعدات بين هذا وذاكن المنضدة، دائري التخزين، وقارئ الخطة المتوسطة الأجل، وأجهزة الطرد المركزي و-حاضنة تهتز. (ب) وقد تم تجهيز محطة معالجة السائل مع ذراع التعامل مع السائل و8 قنوات 300 ميكرولتر ماصة، حاوية النفايات في الموضع 1، محول طرف مع 300 نصائح ميكرولتر (موقف 2)، محول ارتفاع 30 مع 250 مل الحوض الصغير (موقف 3) وخمسة ارتفاع محول 60 بشأن الخطط متوسطة الأجل (موقف 4-8). يشار ترقيم المواقف إلى جميع أنحاء هذا البروتوكول. ويمكن أيضا المناضد بديلة يمكن استخدامها في حالة وجود الاجهزة يعادل المتاحة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): محتوى البيروفات من 16 البوليمرات المتاحة تجاريا تحديدها عبر البيروفات-الفحص. بعد 1 جم / لتر حل البوليمرالصورة تم تحلل وتحييدها، تم إجراء البيروفات-فحص من تخفيف 01:10 (ن = 3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مخطط تدفق وحدات منصة فحص عالية الإنتاجية. النظام الآلي الفرز، والذي يجمع بين مختلف وحدات الكشف السكاريد: تحليل تشكيل اللزوجة، وإنتاج البوليمر وتحديد مجموع محتوى الكربوهيدرات. ويقدم الجزء الثاني تحليلا مفصلا أحادي السكاريد لجميع المنتجين EPS اختيار المحددة في الجزء الأول. يتم جمع كافة البيانات من الفرز الآلي والبيانات من بصمة الكربوهيدرات عبر UHPLC-ESI-MS في قاعدة بيانات وتمكين تحديد بسيط من المتغيرات المرتبطة هيكليا من الرإيدي يعرف EPS أو EPS جديدة، وبالتالي، لفحص المستهدفة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخطوة الرئيسية / وحدة تحليلية	سير العمل	ملاحظة / الوصف
زراعة السلالات	1 مل EPS متوسطة قبل ثقافة 48 ساعة و 30 درجة مئوية، 1000 دورة في الدقيقة ل الرئيسية ثقافة 48 ساعة و 30 درجة مئوية، 1000 دورة في الدقيقة ل	إنتاج EPS
إزالة الخلايا / اللزوجة	الطرد المركزي: 30 دقيقة في 4300 x ج	لا بيليه = زيادة اللزوجة = إيجابية
الكشف عن بوليمر: الهطول	50 ميكرولتر سوpernatant + 150 ميكرولتر 2-بروبانول ب هز مدة 10 دقيقة في RT و 900 دورة في الدقيقة ب	البصرية: الالياف ورقائق = هطول إيجابي من البوليمر
إزالة الخلايا / اللزوجة العالية	180 طاف ميكرولتر من ثقافة الرئيسية الطرد المركزي: 10 دقيقة في 3000 x ج 1.0 ميكرومتر غشاء الألياف الزجاجية	لا مرشح تمرير = اللزوجة العالية = إيجابية
الكشف عن بوليمر: الهطول	50 ميكرولتر الترشيح + 150 ميكرولتر 2-بروبانول ب هز مدة 10 دقيقة في RT و 900 دورة في الدقيقة ب	البصرية: الالياف ورقائق = هطول إيجابي من البوليمر
استهلاك الجلوكوز: الجلوكوز فحص	التخفيف 1: 100: 10 ميكرولتر الترشيح + 990 ميكرولتر ده 2 O 50 قسامة ميكرولتر + 50 ميكرولتر reagوالأنف والحنجرة مزيج حضانة 30 دقيقة في 30 ° C 150 دورة في الدقيقة قياس 418-480 نانومتر	تبقى الجلوكوز بعد زراعة
هلام الترشيح	موازنة: 3 × 150 ميكرولتر NH 4 -acetat عازلة درجة الحموضة 5.6 2 × 2 دقيقة في 2000 x ج 1 × 2 دقيقة في 1000 x ج جل الترشيح: 35 الترشيح ميكرولتر، 2 دقيقة في 1000 x ج غسل: 3 × 150 ميكرولتر ده 2 O، 2 دقيقة في 2000 x ج 75 ميكرولتر 20٪ من الإيثانول لتخزين	تنقية البوليمر: إزالة الأملاح، البيروفات والجلوكوز وأخرى أحادية السكر من طاف زراعة
تبقى الجلوكوز بعد هلام الترشيح الجلوكوز فحص	تخفيف 01:10: 25 ميكرولتر ده 2 O + 20 ميكرولتر ده 2 O و 5 ميكرولتر الترشيح + 50 ميكرولتر كاشف مزيج الحضانة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية، 150 دورة في الدقيقة قياس 418-480 نانومتر	طرح ما تبقى من الجلوكوز بعد هلام الترشيح من طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية
أي ما يعادل الجلوكوز: طريقة الفينول الكبريتيك حمض ج	20 ميكرولتر هلام الترشيح + 180 ميكرولتر الفينول الكبريتيك حمض (30 ميكرولتر 5٪ (ث / ت) الفينول في ده 2 O + 150 ميكرولتر اضرب. H 2 SO 4 (ρ = 1.84 جم / مل)) تهز 5 دقائق في 900 دورة في الدقيقة حضانة 35 دقيقة في 80 ° C قياس في 480 نانومتر	أي ما يعادل الجلوكوز: Δ (قيمة الفينول الكبريتيك الحمضية - المتبقية الجلوكوز بعد هلام الترشيح) <300 ملغ / لتر سلبية > 300 و <700 ملغ / لتر المفترض إيجابية > 700 ملغ / لتر إيجابي
والتعامل معها يدويا تحت ظروف معقمة (تدفق الصفحي).
B سائل قابل للإشتعال التعامل معها يدويا تحت غطاء الدخان.
ج الفينول-الكبريتيك حمض التعامل مع العلامة التجارية معالجة السائل محطة (LHS) تحت غطاء الدخان.

الجدول 1: العمل الكامل للالغربلة الآلي مع نظام المناولة السائل الروبوتية ومحطة معالجة السائل نظرة عامة على جميع المعلمات لنماذج تحليلية الآلي.

الخطي			اللد	LOQ
r² ل	منحدر	تعويض	ملغم / لتر	ملغم / لتر
0.9998	0.0007	-0.021	50	100
معيار		يعني ب	الدقة ب	دقة ب
ملغم / لتر		ملغم / لتر	السيرة الذاتية٪	التحيز (خطأ٪)
5000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
يعني من ثمانية القياسات والمعايرة مع ستة مستويات الجلوكوز 0،1-5 ز / L
ب يؤديها مع اختبار t لطلبة (α = 0.05، ن = 8).
اللد: الحد من عزم، LOQ: الحد من الكمي، السيرة الذاتية: معامل الاختلاف.

الجدول 2:وجرى المصادقة على طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية بها مع محطة معالجة السائل. وقد حسبت الخطي على أساس المعايرة ست نقاط (ن = 8). يتم إعطاء متوسط ​​والدقة ودقة اثنين من تركيزات الجلوكوز اختيار exemplarily هنا.

	الخطي			LOQ
	r² ل	منحدر	تعويض	ميكرومتر
دون مصفوفة	0.99999	0.0223	-0.0019	1
01:10 مصفوفة المخفف	0.99999	0.0221	-0.0011	1
	معيار	يعني ب	الدقة ب	دقة ب
	ميكرومتر	ميكرومتر	السيرة الذاتية٪	التحيز (خطأ٪)
دون مصفوفة	50	49.96	3.05	-0.09
	1	1.04	2.95	3.86
01:10 مصفوفة المخفف	50	49.98	0.44	-0.04
	1	1.00	4.58	0.33
يعني من ثلاثة قياسات والمعايرة مع ستة تركيزات البيروفات 1-50 ميكرومتر.
ب (ن = 3)
LOQ: الحد من الكمي، السيرة الذاتية: معامل الاختلاف.

الجدول 3: التحقق من البيروفات-الفحص مع وبدون 01:10 المخفف تحييد trifluoroacetic الحمضية مصفوفة اثنين المعايرة ست نقاط (ن = 3) مع أو بدون أجريت تقييم التأثيرات المصفوفة. تم حساب متوسط ​​والدقة ودقة اثنين من تركيزات البيروفات اختيار exemplarily مع وبدون آثار التخفيف 01:10.

الجدول 4: النتائج من ثلاث سلالات المثالية فحص مع منصة جمع البيانات من الفرز الآلي والبصمة الكربوهيدرات الرجاء جلعق هنا لتحميل هذا الجدول كما ملف Microsoft Excel.

كربوهيدرات	امتصاص ماكس [نانومتر]	امتصاص عند 480 نانومتر يعني ± SD		قريب الامتصاصية إلى جلوكوز [٪]
العلكة Diutan	470	0،342	± 0.010	187
الصمغ جيلان	472	0.334	± 0.002	183
صمغ الغوار	478	0.387	± 0.017	212
صمغ العربية	476	0.393	± 0.034	215
حمض الهيالورونيك	484	0.231	± 0.011	126
الترتر اللثة	478	0.455	± 0.023	249
[كونجك اللثة	480	0.297	± 0.009	163
ارش اللثة	480	0.337	± 0.032	185
الجراد حبة العلكة	478	0.354	± 0.033	194
Scleroglucan	484	0.168	± 0010	92
Succinoglycan	482	0.168	± 0.005	92
تارا الصمغ	480	0.318	± 0.016	174
الكثيراء	478	0،513	± 0.003	281
العلكة Welan	472	0.226	± 0.016	124
الزيلان	472	0.567	± 0.007	311
صمغ زنتان	482	0.245	± 0.021	134
جلوكوز	484	0.191	± 0.014	100
SD: الانحراف المعياري

الجدول 5: النتائج كما تم الحصول عليها من طريقة الفينول الكبريتيك حمض لمدة 16 البوليمرات والجلوكوز متاحة تجاريا الحد الأقصى الاستيعاب والامتصاص في 480 نيوتن متر من 16 البوليمرات المتاحة تجاريا (1 جم / لتر)، وكذلك الجلوكوز (1 جم / لتر تم قياس) تطبيق طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية. تم احتساب الامتصاصية بالنسبة لمستوى السكر في جميع البوليمرات.

	معيار	تعني ص> ل	الدقة ل	دقة ل
	ملغم / لتر	ملغم / لتر	السيرة الذاتية٪	التحيز (خطأ٪)
01:10 التخفيف	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1.41	-0.70
1: 100 التخفيف	4500	5026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4.55
ب يؤديها مع اختبار t لطلبة (α = 0.05، ن = 8).
السيرة الذاتية: معامل الاختلاف.

العمر = "1"> الجدول 6: تم التحقق من صحتها وبعد هلام الترشيح (01:10): التحقق من التخفيف الآلي لالجلوكوز فحص والتخفيف عن الجلوكوز فحص بعد زراعة (100 1). اثنين من تركيزات الجلوكوز (ن = 8) وكانت مخففة عن طريق نظام التعامل مع السائل وتقييمها. تم حساب متوسط ​​والدقة والدقة.

قيمة السكر في النظرية	مغطاة غطاء سيليكون حصيرة			اختبار التبخر (كشف)
	يعني	الدقة ل	دقة ل	يعني	الدقة ل	دقة و</ قوي>	تبخر
ملغم / لتر	ملغم / لتر	السيرة الذاتية ٪	التحيز (خطأ٪)	ملغم / لتر	السيرة الذاتية ٪	التحيز (خطأ٪)	٪خطأ
45.0	45.2	0.69	0.44	46.0	0.66	2.05	1.60
18.0	17.7	0.80	-1.68	18.0	0.72	-0.01	1.69
تسعة	8.74	1.20	-2.98	8.92	0.81	-0.95	2.09
4.5	4.50	1.26	-0.04	4.58	1.57	1.76	1.80
1.8	1.85	0.74	2.90	2.01	2.82	11.6	8.48
0.9	1.03	1.43	14.1	1.16	3.52	28.3	12.4
(ن = 4)
السيرة الذاتية: معامل الاختلاف.

الجدول 7: تقييم تأثير التبخر من الخطة المتوسطة الأجل ستة معايير الجلوكوز المختلفة التي تغطيها وكشف (ن = 4) تم تخزينها في دائري لمدة 3.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم تقييم تأثير التبخر باستخدام كشفت فضلا عن تغطيتها (السيليكون حصيرة) العينات القياسية. تم حساب متوسط، والدقة والدقة وتبخر في الخطأ٪.

قبل هلام الترشيح

	بعد هلام الترشيح		تبقى الجلوكوز بعد هلام الترشيح
	يعني	SD ل		يعني	SD ل
	ملغم / لتر	ملغم / لتر	ملغم / لتر	ملغم / لتر	٪
1	8647	110	259	121	3.00
2	5108	56	116	37	2.27
3	2014	12	50.8	14	2.52
4	1015	12	25.1	8.1	2.47
5	510	4.9	12.8	4.3	2.51
6	223	8.6	6.6	15	2.94
7	122	5.6	4.3	0.9	3.48
8	75	6.0	3.1	0.3	4.18
(ن = 8)
SD: الانحراف المعياري

الجدول 8: النتائج كفاءة هلام الترشيح تم تحديد ثمانية معايير الجلوكوز مختلفة قبل وبعد هلام الترشيح لتقييم كفاءة هلام الترشيح. يعني، الانحراف المعياري والجلوكوز المتبقي بعد حسبت هلام الترشيح في٪.

Discussion

كشف السكاريد مع طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية: السكريات الأحادية مختلفة تظهر مختلف ماكسيما الامتصاص ومعامل الانقراض المولي عن طريق استخدام هذه الطريقة ^9. وهذا يؤدي إلى امتصاص ماكسيما مختلفة من البوليمرات، والتي تحتوي على العديد من السكريات بكميات مختلفة. ونظرا لأطوال موجية مختلفة من ماكسيما امتصاص لمدة 16 مختلفة البوليمرات المتاحة تجاريا في الجدول 5. وتم حل البوليمرات (1 جم / لتر) في [ده ₂ O، أثار (150 دورة في الدقيقة) بين عشية وضحاها ويقاس مع الفينول الكبريتيك، وحامض وطريقة . وأظهرت اللثة Diutan أدنى الحدود القصوى امتصاص عند 470 نانومتر حمض الهيالورونيك وscleroglucan وأعلى مستوى عند 484 نانومتر. وبناء على هذه النتائج تم اختيار 480 نانومتر لهذا النظام الأساسي الفرز. تم احتساب الامتصاصية النسبي للبوليمرات على أساس الامتصاصية التي تم الحصول عليها مع 1 جم / لتر جلوكوز (مجموعة من 100٪). تم الحصول على أدنى النتائج مع scleroglucan وsuccinoglycan، على حد سواء مع 92٪. كان هذا إكسبECTED لscleroglucan يحتوي فقط على الجلوكوز وsuccinoglycan يحتوي على الجلوكوز والجلاكتوز في نسبة 7: 1. كلا البوليمرات التجارية لديها خسائر مختلفة من تجفيف والرماد مختلفة، وهذا هو السبب لماذا لم يتم الوصول إلى القيمة النظرية لل~ 110٪. أظهر الزيلان أعلى الامتصاصية النسبي مع 311٪. والسبب في ذلك هو ارتفاع معامل الانقراض المولي تحقق من زيلوز نتيجة لشكل فورانوز أكثر هيمنة. عند مستوى 0.1 جم / لتر جلوكوز تم التوصل إلى الحد الكمي، فضلا عن الحد كشف بتركيز <0.05 جم / لتر. ومع ذلك، فإن حد الكشف عن سلالات إيجابية في الفحص هو أعلى من 0.7 جم / لتر، وبالتالي، أظهر فحص الأداء الجيد. من أجل الحصول على نتائج موثوقة، تم تحديد نسبة الجلوكوز المتبقية بعد هلام الترشيح مع الجلوكوز فحص وتطرح هذه القيمة من القيمة من طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية.

آلية تخفيف الجلوكوز فحص: أداءمن تقرير الجلوكوز بعد زراعة (التخفيف 1: 100) وكان التحقيق. لهذا، تم نقل 10 ميكرولتر من طاف إلى 990 ميكرولتر من ده ₂ O في لوحة بئر عميقة ومختلطة عبر عشر مرات الشفط والاستغناء عن 180 ميكرولتر من هذا التخفيف. وكانت الخطوة الثانية الحاسمة في pipetting لالصحيح قسامة ميكرولتر 5 فقط من أجل تخفيف 1:10 من الجلوكوز فحص بعد هلام الترشيح. من أجل توليد ميكرولتر التخفيف 25 من ده ₂ O نقلوا مع 50 ميكرولتر طرف أول، ويستنشق بعد ذلك 20 ميكرولتر من ده ₂ O و 5 ميكرولتر هلام الترشيح معا. وهذا يضمن أفضل إزالة قسامة 5 ميكرولتر من طرف. وتم التحقق من كل من خطوات تخفيف مع مختلف مستويات الجلوكوز عن طريق الجلوكوز الفحص. وبالنظر إلى النتائج لمدة تركيزات نموذجية في الجدول 6 في 1: 100 التخفيف لتحديد نسبة السكر بعد أن أظهرت زراعة دقة عالية لكل من المعايير مع السيرة الذاتية & #60؛ 1.2٪. وفي الوقت نفسه، كانت دقة لمستوى أعلى يصل إلى 11.6 (خطأ٪). ومع ذلك، هذا لا يكاد يذكر كما يمثل تقرير الجلوكوز فقط نسبة السكر المتبقية بعد زراعتها وبالتالي، ليس مهما للكشف البوليمر. أظهر تخفيف 01:10 لالجلوكوز المتبقية بعد هلام الترشيح نتائج موثوقة جدا مع السيرة الذاتية <1.4٪ ودقة <خطأ 2.1٪.

النظر في التبخر: الفحص يتطلب 3.5 ساعة من الخطوة الأولى لأول الجلوكوز الفحص. من أجل معرفة ما إذا كان هذا الإطار الزمني له تأثير على تخزين الخطة المتوسطة الأجل لم يسبق لهم اللعب، تم تخزين 50 ميكرولتر من المعايير معايرة سكر الفحص مع وبدون غطاء لمدة 3.5 ساعة في دائري الروبوت. في نطاق معايرة (45 حتي 4،5 ملغ / لتر) تركيز عينة بالكاد زادت. وكانت أقل من 2.1٪ وفقط لمدة أقل تركيز (1.8 و 0.9 ملغم / لتر) وصلت إلى 12.4٪ (- زيادة - الناجمة عن التبخر الجدول 7).

هلام الترشيح: كميات عالية من الجلوكوز غير استقلاب يزعج الكشف الكمي من الجلوكوز من البوليمر تحلل. ولذلك، كان مطلوبا خطوة هلام الترشيح لإزالة الجلوكوز المتبقية بعد زراعة. بالإضافة إلى ذلك، وهلام الترشيح ينقي البوليمر تحتوي على طاف من الأملاح والمركبات الكربوهيدرات أحادى، والبعض الآخر من الجلوكوز، للحد من خلفية تحليلية في التحليل مونومر. في خطوة هلام الترشيح وضعت 35 ميكرولتر من الترشيح في وسط البئر. للتأكد من صحة ومتانة هلام الترشيح في النظام الآلي، ومرشح ثمانية معايير المعايرة من 0.045 يصل إلى 9 ز / L الجلوكوز (ن = 8). تم تخفيض مستوى السكر في كل التركيز دائما من قبل أكثر من 95٪ من القيمة الأولية (الجدول 8). في القيام بذلك، أظهر هلام الترشيح نتائج جيدة للغاية لتركيزات مختلفة من الجلوكوز. بالإضافة إلى ذلك، الجلوكوز المتبقية بعد هلام وتم تحديد iltration أيضا مع الجلوكوز فحص وتطرح من تقرير الفينول الكبريتيك حمض لتلقي المبلغ الصحيح من مكافئ الجلوكوز لالبوليمر تحلل.

البيروفات-فحص: أولا وقبل كل شيء، وكان التحقيق هو ما إذا كان تحييد والمخفف (01:10) TFA مصفوفة من الخطوة التحلل يتداخل مع رد الفعل الأنزيمية. لذلك، تم إجراء فحص كامل مرتين، مرة واحدة مع ومرة ​​واحدة دون المصفوفة وأظهرت نتائج موثوقة. وأخيرا، تم قياس محتوى البيروفات من 16 البوليمرات المتاحة تجاريا بنجاح وصورت في الشكل (3). ومن المعروف عموما أن للخروج من تلك البوليمرات سوى 16 succinoglycan وزنتان يحتوي بشكل طبيعي على البيروفات. مع شركائنا في البيروفات-الفحص تم تحديد كل من هذه البوليمرات بشكل صحيح. في scleroglucan، تم الكشف عن اللثة welan والبيروفات الزيلان أيضا بكميات كبيرة. وعموما، تم التحقق من قدرة النهج والبيروفات-فحص الصورةhowed عالية الأداء. ثبت أن تكون قادرة على الكشف البيروفات في البوليمرات مختلفة بعد التحلل.

بصمة الكربوهيدرات: بعد تنفيذ جميع وحدات تحليلية في الفرز الآلي، وقد تم اختيار المنتجين EPS المحتملين لتحليل الكربوهيدرات بصمات الأصابع. لهذا، تم تطبيق عدة معايير هي: 1) الملاحظة الإيجابية من اللزوجة بعد الطرد المركزي و / أو بعد الترشيح. 2) إن الأمطار قبل وبعد الترشيح. تم تقييم الألياف المرصودة ورقائق بأنها إيجابية. 3) ما يعادل قيمة الجلوكوز من طريقة الفينول الكبريتيك الحمضية. تم تصنيف القيم> 700 ملغ / لتر بأنها إيجابية وتم تصنيف القيم بين 300 و 700 ملغم / لتر كمنتجين EPS المفترضة. عندما تم تقييم اثنين أو ثلاثة معايير بأنها إيجابية، وقد تم اختيار السلالات لمزيد من التحليل بصمة الكربوهيدرات. معايير يمكن تخصيص نحو الهدف الفردي للEPS الفرز (على سبيل المثال EPS اللزوجة المنخفضة). نهجنا تهدف إلى إيجاد efficiوالأنف والحنجرة EPS المنتجين. عند البحث عن السلالات التي تنتج كميات صغيرة فقط من EPS الحد تقييم ما يعادل الجلوكوز ينبغي تخفيض.

فائدة التقنية والتطبيقات المستقبلية: ميزة واحدة مثيرة للاهتمام من هذا البروتوكول هو الطابع حدات من الخطوات وحدات تحليلية مختلفة. ويمكن الجمع بين بطرق مختلفة مع تعديلها لتلبية الاحتياجات الفردية، ويمكن بسهولة أن تنفذ وحدات جديدة. وعلاوة على ذلك، فإن وحدات تحليلية يمكن استخدامها بشكل منفصل، على سبيل المثال وحدة التحلل في تركيبة مع وحدة HT-PMP-اشتقاق قادرة على إجراء تحليل لبنية أحادى من محاليل البوليمرات المختلفة (1 جم / لتر) في شكل 96-جيدا. للمختبرات دون الوصول إلى نظام مناولة السائل فحص كامل يمكن التعامل معها يدويا دون أي تغيير في نظام pipetting ل. ومع ذلك، باستخدام نظام مناولة السائل يزيد من إنتاجية تصل إلى 768 سلالات (بدلا من 192 سلالات إذا screeneد يدويا) في اليوم الواحد. بروتوكول الموضح هنا هو قادر على فحص للأجناس مختلفة، وبالتالي، لفحص مجموعات سلالة كبيرة لتحديد EPS رواية المنتجين وتحليل البصمات من الكربوهيدرات في نهج واحد (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، فحص تستهدف السكريات التي تحتوي على السكريات النادرة مثل فوكوسي والأحماض uronic أو حتى السكريات غير معروفة لا يمكن أن يؤديها من خلال تحليل أحادي السكاريد تفصيلا. أيضا، تركيبات السكر مختلفة في نسب محددة يمكن الكشف عنها. وهذا يتيح تحديد بسيط من المتغيرات المرتبطة هيكليا من EPS معروفة أو EPS جديدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2