Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Özet

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Özet

Birçok mikroorganizma üreten ve tıp alanları, gıda uygulamalarında ya petro-bazlı kimyasallar yerine önemli etkileri eksopolisakaridleri (EPS), salgılayan yeteneğine sahiptir. Biz türü ve mikroorganizmalar tarafından üretilen EPS miktarının hızlı ve güvenilir analiz sağlayan bir sıvı taşıma sistemi otomatik hale analitik platformu açıklar. Bu kullanıcı, yeni doğal mikrobiyal ekzopolisakkarit üreticileri tespit etmek ve yüksek verim (HT) bir gün içinde karşılık gelen polimerlerin karbohidrat parmak izi analizi sağlar. Bu platformu kullanarak, mühendislik yaklaşımlarına elde edilebilir gerilme koleksiyonları yanı sıra gerilme varyantları kütüphaneleri taranabilir. Platform iki ana bölüme protokolünün bir ayrılık sağlayan modüler kurulum vardır. İlk olarak, farklı bir polisakarit algılama modülleri birleştiren otomatik bir tarama sistemi vardır: Viscosit bir yarı-kantitatif analizibir santrifüjleme adımı alkol çökeltme yoluyla, polimer oluşumu, bir analiz ve bir fenol-sülfürik asit dönüştürme aracılığıyla toplam karbonhidrat içeriğinin belirlenmesi yoluyla Y oluşumu. Burada, dönemde başına 384 suşları kadar taranması mümkündür. İkinci bölüm, iki temel modülleri birleştirerek ilk bölümünde tanımlanmış tüm seçili EPS üreticileri için ayrıntılı bir monosakarit analizi sağlar: UV ve elektrosprey iyonizasyon iyon tuzağı algılama (birleştiğinde ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile tam bir monomer bileşiminin analizi UHPLC UV-ESI-MS) ile bir renk oluşumu ile birleştirilir enzimatik oksidasyon aracılığıyla, bir polimer ikame (piruvat ketal varlığı) ve piruvat belirlenmesi. Bu tarama platformun tüm analitik modüllerinin farklı şekillerde bir araya getirilmiş ve kişisel gereksinimlere göre ayarlanabilir. Buna ek olarak, hepsi elle hareket ettirilmesi veya bir sıvı taşıma sistemi ile gerçekleştirilebilir. Böylece, eleme plaTForm çeşitli EPS tanımlamak için büyük bir esneklik sağlar.

Giriş

Mikrobiyal eksopolisakaridlerin (EPS), çeşitli biyolojik fonksiyonları yerine getirir bir polimer yapısal yüksek gruptur. Genellikle, farklı monomer tipleri (şeker, şeker türevleri, şeker asitleri), bu monomerlerin ve ikameleri arasındaki bağlar ile ayırt edilir kompleksi tekrar birimlerinin, örülmüştür. Mikrobiyal polisakkaritler yapısal çeşitlilik gıda ¹ gibi farklı alanlardaki uygulama sağlayan bu molekül sınıfına, kozmetik ^2,3, inşaat kimya ⁴ veya su arıtma ⁵ üyelerine oldukça farklı özelliklere bahşeder. ayrıca yeni, doğal mikrobik polisakaritler tanımlanması ve yapısal varyantları tekniği umut vadeden yaklaşımlar temsil bu biyolojik bazlı ve sürdürülebilir polimerlerin uygulama alanını genişletmek için. Her iki durumda da, hızlı bir tarama yöntemidir hızla thei için mikrobiyal suşların geniş bir sayıda tarama için gereklidirr polisakkarit oluşumu ve ürünlerini analiz etmek. Bu nedenle, en son monomer bileşimin ⁶ belirlenmesini içeren, doğal izolatları ya da genetik mühendisliği suşu türevleri mikrobiyal polisakarit üretimi analizi için 96-çukurlu HT-görüntüleme platformunu geliştirdik.

~ 500 doğal izolatların bir ilk tarama turu için bu platformu uygulamak bize EPS üretmek mümkün varlık olarak yalnızca yaklaşık 10 İzole edilen suşların% 20 tespit izin (veriler gösterilmemiştir). Bu analiz suşların% 80-90 uygulanan koşullar altında EPS vermedi ve bu nedenle ayrıntılı bir karbohidrat parmak izi bir başka analizi, gerekli olmadığı anlamına gelmektedir. monomerik kompozisyon bu son derece sofistike kimlik olarak özellikle veri analizi için, hızlı bir ön tarama yöntemi, EPS üretimi olumlu suşları belirlemek için büyük ölçüde verimliliği artıracak, zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca, reaktifler,UHPLC-UV-ESI-MS de sarf malzemeleri ve ölçüm süresi azalacaktır. Bir yandan yöntem son derece güvenilir yaparken Buna ek olarak, farklı analitik modülleri paralel en az iki 96-yuvalı plakalar kılavuzu taşıma komplike Diğer taraftan, ve bu şekilde yöntemin tam potansiyelini sınırlamaktadır. Bu nedenlerden dolayı, biz otomatik tarama platformu geliştirmeye karar verdi. Bu nedenle, absorbans ölçümü dayalı olarak, toplam şeker içeriği tam otomatik hızlı bir algılama yöntemi mevcut karbohidrat parmak tekniğin modüler bir biçimde bir araya.

Fenol-sülfürik asit yöntemi hala bakteri ve bitki polisakkaritler ^7,8 toplam karbonhidrat içeriğinin hızlı tayini için tercih yöntemi temsil eder. Bu yöntem, ilk 96-yuvalı plakalar ^10,11 daha küçük ölçekli, farklı uygulamalar ve örnek boyutları için Dubois ve diğ. ⁹ ile tarif uyarlanmıştır. phenol-sülfürik asit yöntemi tüm monomerik, oligomerik ve örnekleri polimerik karbonhidrat summating, tek bir değere göre, toplam karbonhidrat içeriği ölçer.

dikkate bu yönleri alarak, uygun bir yetiştirme ortamının seçimi, bu yöntemin uygulanması için çok önemlidir. oligomerik veya maya özü gibi polimerik karbohidrat bileşikleri ihtiva eden kompleks ortam değişmiş bir polimer içeriğine yol açabilir ve bu nedenle, kesinlikle kaçınılması gerekmektedir. Bundan başka, şekerler, yüksek miktarlarda soylarının yetiştirilmesi için C-kaynağı olarak kullanılır. yetiştirme sürecinden kalan karbonhidratların yüksek seviyelerde olumsuz EPS içeriği ölçümü etkileyebilir.

Bu nedenle, tanımlanmış ve saf şekerler kullanılması tavsiye edilir. Deneylerimizde hücrelerinin kültivasyonu için glükoz kullanılır. yetiştirme sonrası kalan glukoz jel filtrasyon yoluyla indirgendi ve glikoz tahlili ile belirlendi. Son olarak, glukoz eşdeğeripolisakaritlerin s fenol-sülfürik asit yöntem ile tespit edilmiş toplam karbonhidrat içeriği jel filtreleme işleminden sonra kalan glukoz çıkarılarak hesaplanmıştır. fenol-sülfürik asit metodu ile kombinasyon halindeki jel filtre ve glukoz-deney güvenilir sonuçlar sağlar ve ilk, tamamen otomatik kontrol sistemi olma yeteneğine sahiptir.

çökeltme ve viskozitedeki bir artış gözlenmesi: İki yeni analitik modül EPS algılama sistemi bilgi miktarını artırmak için otomatik tarama platformu alındı.

Birçok farklı EPS - örneğin suksinoglikanlar, ksantan ve kolon asit ¹² - şeker pozisyonları C4 ve C6 olmayan bir karbonhidrat piruvat ketal ile modifiye olduğu bildirilmektedir. (Sadece süksinil yarım esterleri ve üronik asitler gibi) bu piruvat ketaller fiziksel prope için, bu nedenle polianyonik doğaya katkıda bulunmak veiki değerlikli katyon köprüleri ¹³ vasıtasıyla etkileşim polimerin ilgili taraflar. bu özel polimerler belirlemek amacıyla piruvat belirlenmesi ek başka bir analiz modülü olarak kurulmuştur. Bu polisakkarit ikamesi ve potansiyel makroskopik özellikleri hakkında bilgi arttırır.

tüm modülleri birleştiren farklı EPS belirlenmesini yanı sıra EPS üreticilerinin hızlı ve etkin belirlenmesini sağlar. Bu yaklaşımla tarama platformu iki ana bölümden (Şekil 1) bölünebilir. Otomatik tarama (Bölüm I) iş akışı tam otomatik oluşur içinde (Tablo 1) hızla üreten suşlar EPS preselect için. karbonhidrat parmak izi analizi (Bölüm II) nicel önceden seçilmiş suşları tarafından üretilen EPS monomer bileşimi belirler. Böylece, veri analizi büyük gerilme koleksiyonları tarama optimize etmek için minimize edilmiştir. Butek otomatik tarama vadede ve günde 768 suşları günde mümkün olan iki çalışan ile 384 suşları analiz imkanı sunuyor. Ayrıca, karbonhidrat parmak izi analizi, tüm belirlenen EPS daha da ayrıntılı bir bakış sunuyor. Bu yönelik analiz ve EPS önce tarif kimyasal yapıları ile karşılaştırıldığında sadece biraz farklı EPS varyantları ya da tamamen yeni olanlar tanımlanmasını sağlar.

Protokol

1. Otomatik Eleme

Not: Tüm sıvı taşıma adımlar bir robot sıvı taşıma sistemi ile yapılır. Robot tezgahının bileşim olup, Şekil 2 içinde sunulmaktadır. Aksi belirtilmediği sürece tüm sarf malzemeleri, depolama atlıkarınca saklanır. (CP atlıkarınca pozisyonları arasındaki tüm otomatik tarama için bir robot manipülatör (RM) sarf taşır, (böylece polimeraz zincir reaksiyonu plakası (PCR plaka) ve;, mikro titre plakası (OVP) derin kuyu plakası (DWP)) adımları ) ve çalışma masası pozisyonlar (WTP). Tüm pipet adımlar aksi belirtilmediği takdirde dışında, 96 kanal pipet-kol ile yapılmaktadır. Tüm adımlar, programlanabilir ve 96 oyuklu bir formatta otomatik olarak gerçekleştirilir.

1. Gerilme Yetiştirme (Şekil 1 Görev 1)
   Not: suşları üreten varsayılan EPS aşılama ve steril koşullar (laminer akış) kapsamında yetiştirme plakalarının sızdırmazlık tutun. otomatikHızlı tarama çalışması için dört, 96 gözlü levhalar işleyebilir. Birkaç cins farklı suşları zaten ⁶ test edildi.
   1. El ile 96-çukurlu bir gliserol hazır plaka 96 pimli çoğaltıcı ile ön kültür (a DWP 1 ml EPS ortamı) aşılamak. Buharlaşmayı önlemek için ve havalandırma sağlamak için hava alabilir bir sızdırmazlık filmi ile plaka kaplayın. MTP-çalkalayıcıda 1000 rpm'de 48 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   2. 50 ul 12-kanallı çok pipet kullanılarak ve ön kültür olarak, aynı şartlar altında inkübe ön kültür 10 ul aktarılarak ana kültür (a DWP 990 ul EPS ortamı) aşılamak. uzamıyor tüm suşları not alın.
2. Robot Çalışma masası ve Depolama Carousel Hazırlanması
   1. Depolama atlıkarınca doğru pozisyona malzeme ve ekipman listelenen tüm sarf sağlayın. Th 100 seyreltileri: 1 DWP her çukuruna çift damıtılmış su 990 ul (O GKD ₂₎ ekleyine glikoz-tahlil (atlıkarınca pozisyonu 4-1 4-4).
   2. İş tezgahı konumuna (AAT) 11 de GKD ₂ O 150 ml içeren 250 ml'lik bir çukur düzenlemek.
   3. 50 ml glukoz deney reaktif karışımı (4 mi, 500 mM potasyum fosfat (pH 5.7), 1.5 ml 50 mM 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-sülfonik asit, 2 mi, 100 U glükoz oksidaz ihtiva eden 250 ml'lik bir oluk yatırın 10 ul 1.000 U yaban turpu peroksidaz ve pozisyon WTP 1-2 at 42.49 ml GKD ₂ O).
   4. pozisyon WTP 3-1 ve 3-2 iki boş kukla F-alt MTP'ler yerleştirin.
   5. , Nefes sızdırmazlık filmi çıkarın 1-1 1-4 ile atlıkarınca pozisyonları (SP) ana-kültürleri tahsis ve otomatik robot programını başlatın.
3. Jel filtrasyon Tabaklar dengeleme
   Not: Bu tarama sırasında kullanılan jel filtrasyonu plakalar yeniden kullanılabilir. Bunun için, 20 ° C 'de 2 dakika boyunca 2.000 x g'de GKD ₂ O 150 ul her bir yıkama ve bir santrifüj üç kez. Daha sonra, 4 ° C'de saklamak% 20 etanol içinde 75 ul, ° C ve bir silikon kap mat ile kaplayın.
   1. Su arıtma 3-3 5 mM amonyum asetat tampon (pH 5.6) ile 250 mi çukur (CP 5-7) taşıyın.
   2. 4-4 WTPs 4-1 atlıkarınca gelen jel filtrasyon plakaları (CP 1-6, 1-7, 2-6 ve 2-7) aktarın.
   3. Aspire amonyum asetat tamponu 150 ul 200 ul ipuçlarını kullanarak dengeleme seyahati jel filtrasyon plakalarının merkezine dağıtmak.
   4. (20 ° C'de 2,000 xg 2 dakika) santrifüje jel filtrasyon plakaları aktarın.
   5. adımları 1.3.3, 1.3.4 ve 1.3.3 tekrar tezgaha geri plakaları aktarın. jel filtrasyon plakaların dehidratasyonu önlemek için santrifüj adımı tekrarlayın etmeyin. geri atlıkarınca içinde dengelenmiş jel filtrasyon plakaları saklayın.
4. Santrifüj yoluyla hücre Temizleme (Şekil Görev 1: 1)
   Tarama yaklaşımı içinde düşük bir arka plan sağlamak için ücretsiz hücreyi analiz Not:EPS süpernatantlar sadece içeren ve ekimi sonrası santrifüj yoluyla hücreleri çıkarmak.
   1. (20 ° C'de 4,300 xg, 30 dakika) santrifüje tambur (1-4 1-1) ana-kültür DWP aktarın.
   2. Ana kültürünü işlemek için RM üzerinden worktable hazırlayın.
      Not: adımlar 1.4.2 için sistem her zaman paralel iki tabak kolları ve ardından sonraki iki plakalı tüm adımları tekrarlar 1.4.3.5 için.
      1. filtrasyon öncesi yağış 4-1 ve 5-1 wtp CP 6-1 ve 6-2 dan MTP'yi taşıyın. 4-2 ve 5-2 wtp CP 7-1 ve 7-2 pH-gösterge MTP'ler taşıyın.
      2. 4-3 ve 5-3 wtp CP 2-1 ve 2-2 dan toplayıcı plaka ile birlikte filtrasyon plaka aktarın. 4-4 ve 5-4 wtp için santrifüj ana-kültür DWP 1-1 ve 1-2 değiştirin.
      3. analitik modülleri hazırlayın.
         Not: ucu depolama (pozisyon 2-4 2-1) 200 ul ipuçları alın. sarf azaltmak için, adım 1 için aynı uç dizisi kullanılır.4.3.1.
         1. filtrasyon plakasına ana kültür süpernatanının 180 ul aktarın. Aspire 150 ana kültür süpernatanından ul ve fıltrasyondan önceki çökeltme için MTP'ye 50 ul ile pH göstergesi plakasına 100 ul dağıtın.
            Not: pH belirlenmesi gerekli değildir; Bununla birlikte, bir çok-aşamalı pipetle her bir 12.5 ml metil kırmızı gösterge (50 mi etanol içinde 50 mg) ilave edildikten sonra yüksek asit üreten suşlar gösterir. Bu bilgiler, daha yüksek tampon maddesi konsantrasyonu ile ikinci bir tarama için örneğin başka yetiştirmek için kullanılacak (düşük pH değerinde) büyüme inhibisyonunu önlemek için yararlı olabilir. Bundan başka, düşük pH asidik ortama karşı hücre korumak için EPS üretimi indükleyebilir.
         2. İkinci ana-kültür plaka için yineleyin 1.4.3.1. taze uç-set kullanın.
         3. santrifüj filtrasyon plakaları taşımak ve carous kendi ev konumlarına geri tezgahının diğer tüm plakaları kaldırmakEl.
         4. Üçüncü ve dördüncü ana-kültür plaka için 1.4.3.3 adımları 1.4.2.1 tekrarlayın.
         5. onlar atlıkarınca (viskozite kontrolü) geri aktarılır zaman gösteri, ana kültür plakaları santrifüj sonra sedimantasyon azalmış olan fermentasyon ortamından, bir kenara not alın.
5. Komple Hücre Kaldırma için 96-iyi Filtrasyon (Şekil 1 Görev 2)
   Not: süzme aşaması tarama dahildir yapışkan fermantasyon sıvısından hücre çıkarılmasını sağlamak.
   1. 20 ° C'de 10 dakika süreyle 3000 xg'de filtrasyon plakaları Santrifüj ve geri atlıkarınca ana konuma getirmek.
   2. jel filtrasyon tabak hazırlayın.
      1. 20 ° C'de 2 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ve spin için tamburun dengelenmiş jel süzme plakaları hareket ettirin.
      2. 44 WTP 4-1 santrifüj jel filtrasyon plakaları aktarın.
      3. taze jel TaşıSAT için CP (3-1 3-4) -filtration toplayıcı plakalar (5-1 5-4).
      4. Taze toplayıcı plakaları (5-4 5-1) ila (4-4 için WTP 4-1) dengelenmiş jel filtrasyon plakaları aktarın.
      5. pozisyonlarında 5-1 ve 5-2 dışındaki worktable temizleyin ve 4-1 pozisyon pozisyon 5-1 taşıyın.
   3. süzüntüler işlemek için RM üzerinden worktable hazırlayın.
      Not: Sistemi 1.6.3.5 için adımlar 1.5.3 için paralel iki plaka kolları ve önümüzdeki iki plakalı tüm adımları tekrarlar.
      1. AAT 3-3 ve 3-4 atlıkarınca (4-6 ve 4-7) 50 ul ipuçlarını taşıyın.
      2. Bu çalışma (4-4 ve 5-4) üzerine 3-2 CP 3-1 dan filtrasyon plakaları aktarın.
      3. 4-2 ve 5-1 wtp CP 4-1 ve 4-2 glikoz tüketimi tespiti için: (100 seyreltme 1) DWP değiştirin.
      4. 4-3 ve 5-3 wtp CP 8-1 ve 8-2 dan süzüldükten sonra ikinci yağış MTP'yi taşıyın.
      5. toplayıcı plaka filtrasyon plakaları kaldırıns (WTP 4-4 ve 5-4) ve AAT 3-1 ve 3-2 taşıyın.
   4. Filtreleme işleminden sonra, analitik modülleri hazırlayın. sarf azaltmak için adımlar 1.5.4.1 ve 1.5.4.3 için aynı uç-set kullanın.
      1. glikoz-tahlil (glikoz tüketimi) için: 50 ul ipuçları alın ve DWP süzülen bir 10 ul tablet pipetle (100 seyreltme 1).
      2. Pipet dengelenmiş jel filtrasyon plakasının merkezine süzüntünün 35 ul ve çökelme için kullanılan MTP 50 ul.
      3. Tekrarlayın ikinci filtrasyon plakası için 1.5.4.2 için 1.5.4.1 adımları.
      4. santrifüj jel filtrasyon plakaları hareket ettirin ve atlıkarınca ev konumlarına geri tezgahının diğer tüm plakaları hareket ettirin.
      5. Tekrarlayın üçüncü ve dördüncü filtrasyon plağına için 1.5.4.4 için 1.5.3.1 adımları.
      6. filtre plakasında kalıntılarının gösterdiği gibi oldukça viskoz süpernatanların atlıkarınca almak notu, geri tüm plakaların depolama (yüksek hacim sonrafiltrasyon basamağından sonra iscosity kontrolü). süzüntünün eksikliği aşağıdaki analitik modülleri yanlış negatif sonuçlara yol açabilir.
6. 96-iyi Jel filtrasyon yoluyla Glukoz çıkarılması (Şekil Görev 3 1)
   1. 20 ° C'de 2 dakika boyunca 1000 x g'de jel filtrasyon plakaları santrifüjleyin.
   2. Jel-süzüntüler işlemek için robot manipülatör aracılığıyla worktable hazırlayın.
      1. AAT 3-3 ve 3-4 atlıkarınca (5-3 ve 5-4) 50 ul ipuçları sağlar.
      2. Jel süzme sonra kalan glikoz belirlenmesi için 4-1 ve 5-1 AAT CP 9-1 ve 9-2 iki MTP'ler hareket eder.
      3. fenol-sülfürik asit yöntem için 4-2 ve 5-2 wtp CP 8-5 ve 8-6 iki MTP'ler taşıyın.
      4. AAT (4-3 ve 5-3) için santrifüj iki jel filtrasyon plakaları aktarın.
      5. kollektör plakası (4-3 ve 5-3) den jel filtrasyon plakaları kaldırın ve 3-1 ve 3-2 wtp taşıyın.
   3. Jel-süzüntüler işlemek için robot manipülatör aracılığıyla worktable hazırlayın.
      Not: Sarf malzemelerini azaltmak için, kullandığınız uç seti adımlar 1.6.3.1 ve 1.6.3.2 için.
      1. Jel filtrasyon (1:10 seyreltme) sonra kalan şekeri tespit etmek için 50 ul ipuçları almak ve taze bir OVP'de için GKD ₂ O (WTP 1-1) 25 ul aktarın. GKD ₂ O aspire 20 ul (WTP 1-1), havanın 5 ul ve 5 jel süzüntünün ul ve aynı plaka içine dağıtmak.
      2. fenol-sülfürik asit-yöntem pipet MTP jel-süzüntü 20 ul İçin.
      3. Tekrarlayın 1.6.3.1 ve ikinci jel süzüntü plaka için 1.6.3.2 adımları.
      4. kendi atlıkarınca ev konumlarına geri tezgahının tüm plakaları aktarın.
      5. üçüncü ve dördüncü jel filtrasyon levha 1.6.3.4 oluşturma adımları 1.6.2.1 yineleyin.
7. Glikoz-tahlil Modülleri
   1. olarak glukozu-gerçekleştirmek için robot manipülatör aracılığıyla worktable hazırlayınsöylemek.
      1. 5-1 ve 5-4 wtp CP 4-1 ve 4-4 dan: DWP (100 seyreltme 1) değiştirin.
      2. 4-1 ve 4-4 wtp CP 9-5 ve 9-8 tüm MTP'ler taşıyın.
      3. 200 ul ipuçları alın ve aspire ve 180 ul on kat hacmini dağıtarak seyreltme karıştırın. Sonra OVP için bir 50 ul kısım pipetle.
      4. (: 100 seyreltme 1) tekrarlayın dört DWPs için 1.7.1.2 ve 1.7.1.3 adımları.
      5. Bu çalışma tüm DWPs (5-4 5-1) çıkarın.
   2. glikoz-tahlil başlatmak için worktable hazırlayın.
      1. SAT jel filtrasyon transferi CP tüm MTP (9-4 kadar 9-1) (5-1 5-4) sonra kalan glikoz belirlenmesi için.
      2. 3- AAT CP 9-9 - Üç kez aşağıdaki glukoz konsantrasyonları 50 ul (90, 45, 18, 9, 4.5, 1.8, 0.9, 0.45, 0 mg / L) ihtiva eden - glukoz deney kalibrasyon levhasını hareket 3..
      3. 200 ul ipuçları ve aspire W glikoz-deney reaktif karışımı 50 ul alınTP 1-2, ilk olarak tahlildeki başlatın. inkübatör (30 dakika boyunca 150 rpm'de 30 ° C) içine MTP'ler hareket ettirin.
      4. plakalar arasında 5 dk gecikme ile programı başlatmak için zaman çizelgesi ayarlayın.
      5. inkübasyon 30 dakika sonra 418 ve 480 nm MTP-okuyucu ve kayıt absorbans için inkübatör plakaları taşıyın.
      6. ölçümden sonra atlıkarınca kendi ev konumuna plakaları taşıyın.
8. Yağış hazırlanması
   Not: EPS üretimi öncesi ve birinci, filtrasyon basamağından sonra 2-propanol ile yüzer bir çökelmesini gerçekleştirmek değerlendirilmesi için. Ayrıca, ancak ikinci çökeltme, birinci elyaf ve pul gözlem ile filtre zarı polimerin adsorpsiyonu değerlendirir.
   Dikkat: kesinlikle davlumbaz altında bir yanıcı sıvı olarak 2-propanol tutun.
   1. (CP 6-1 6-4 ve 8-1 8-4 kadar) carousel tüm yağış plakaları çıkarın. Ve Ekle12.5 mi, çok adımlı pipetle her bir oyuğa, 2-propanol ve el 150 ul.
   2. bir silikon kap mat Tüm MTP'ler örtün ve oda sıcaklığında (RT) (900 rpm'de 10 dakika) çalkalanır. Görme EPS üretimi göstermektedir ki salladıktan sonra lif veya pul oluşumları görüyoruz.
9. Fenol-sülfürik asit Yöntem
   Dikkat: davlumbaz altında konsantre sülfürik-asit ve fenol tutun. Fenol aşındırıcı ve mutajenik ajandır.
   1. fenol-sülfürik asit yöntem için, atlıkarınca dan (CP 8-8 8-5) plakaları kaldırmak ve sıvı taşıma sistemi (8 Pozisyon 4) içine koyun. (, 5, 2.5, 1, 0.5; 0.25; 0.1; 0.05; 0 g / L, 10), üç kez farklı glukoz konsantrasyonlarının 20 ul ile kalibrasyon levhasını içerir.
   2. , 1 konumundaki 2 konumundaki 200 ul ucu kutu ve taze (buz with18.3 mi fenol 5% hazırlanan 110 mL fenol sülfürik-asidi (250 mi çukur bir çöp kutusuna koyun a / h) ile kombine ₂ O konsantre 91.7 mi. s3 konumundaki ulfuric asit).
   3. 300 ul ipuçları ile 8 kanallı pipet kullanın ve tüm plakaların her satıra fenol-sülfürik aside 180 ul aktarın.
   4. , Kapakların Tüm MTP'ler Kapak (900 rpm, oda sıcaklığında 5 dakika) sallayarak karıştırın ve renk reaksiyonu için bir fırın içinde 80 ° C'de 35 dakika boyunca inkübe. davlumbaz altında soğutulduktan sonra, 480 nm deki sönüm değeri ölçer.
10. EPS Pozitif süpematantlan seçimi (Şekil Görev 4 1)
    1. EPS üretiminde değerlendirilmesi için, (eşdeğer glukoz viskozite kontrolü 2.6.1 ve 2.6.2, polimer 2.6.3 tespiti, 2.6.5) pozitif olarak üç kriter en az ikisini yerine getirmek otomatik tarama gelenler suşları seçin. daha fazla işlem için yeni bir OVP'de pozitif hit kalan süzüntüler aktarın.
       Not: Plakalar en az bir hafta boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir bir alüminyum sızdırmazlık filmi ile kaplandıktan sonra. O zaman Determina içindekarbohidrat parmak izi olarak gerçekleştirilmesinin gerekmektedir.

2. Karbonhidrat Parmak İzi

Not: Karbonhidrat parmak izi için tüm adımları elle yapılır.

1. (Şekil 1 Görev 5) Pozitif süpematantlan jel filtrasyon
   Not: Otomatik tarama soldan hiçbir süzüntü olmadığı için Jel filtrasyon gereklidir. azalmış saflaştırma veriminde en fazla 35 ul sonuç bir hacim ile jel filtrasyon.
   1. 12.5 mi, çok adımlı bir pipetle her kuyulara amonyum asetat tampon 150 ul tevzi ile jel filtrasyon plakalarının dengede hazırlayın.
   2. (20 ° C'de 2,000 xg 2 dakika) santrifüje jel filtrasyon plakası aktarın.
   3. Tekrarlayın 2.1.1, 2.1.2 ve 2.1.1 tekrar adımları. Daha fazla kullanımdan önce 20 ° C 'de 2 dakika boyunca 1000 x g'de jel filtrasyon plakası santrifüjleyin.
   4. Pipet süzüntünün 35 ul halinde12 kanallı 50 ul pipet kullanılarak jel-filtrasyon plakasının merkezi.
   5. 20 ° C'de 2 dakika boyunca 1000 x g'de jel filtrasyon plakası santrifüj ve kollektör plakasından çıkarın.
   6. 12 kanallı 50 ul pipet ile GKD ₂ O 45 ul ve jel filtre 5 ul ekleyerek 1:10 seyreltme gerçekleştirin ve bir silikon kap mat MTP'ler kapsar: hidrolizden önce glukoz deneyi hazırlayın.
      Not: polimer glikoz değerinin doğru belirlenmesi, hidroliz önce glukoz içeriğini ölçmek ve hidroliz adımından sonra sayısal glukoz içeriğinin onu çıkarmak için.
   7. Her bir oyuğa GKD ₂ O 95 ul transfer jel süzüntü 5 ul eklemek için 12 kanallı 200 ul pipet kullanarak bir 1:20 seyreltme gerçekleştirin ve bir silikon kapak mat MTP mühür: hidroliz önce piruvat-tahlil hazırlayın .
2. 96 gözlü (Şekil 1 'de görev 6) mikro hidrolizi
   Not: ısıtınkullanmadan önce en az 1.5 saat için 121 ° C (bir kum banyosu dahil) inkübasyon fırını. Özel bir sıkıştırma tertibatı küçük ölçekli hidroliz adımı sırasında buharlaşmasını önlemek için geliştirilmiştir.
   1. yeni bir PCR-plaka alın ve 12 kanallı 50 ul pipet ile jel filtre 20 ul transfer.
      Dikkat: Trifloroasetik asit aşındırıcı asit ve toksik özelliktedir. Amonyum çözüm aşındırıcı olduğunu. sadece davlumbaz altında hem kimyasal anlaştım.
   2. her oyuğa 1,25 mi, çok adımlı pipet ile 4 M trifloroasetik asit 20 ul ekle. Daha sonra, bir termoplastik elastomer (TPE) kap mat ile PCR plaka kapak ve sıkıştırma aygıtının PCR-plaka koyun.
   3. sıkıştırma parçası on kez ters yüz ile çözüm karıştırın. 2 dk altındaki tüm sıvı toplamak için 2000 xg'de santrifüj ve spin PCR tabak koydu. geri sıkıştırma cihazına PCR plaka koyun ve vida ile cihazı sabitleyin.
   4. YeriÖnceden ısıtılmış bir kum banyosuna güvenli sıkıştırma cihazı ve 121 ° C'de 90 dakika süreyle inkübe edin.
   5. kum banyosundan sıkma aygıtı kaldırın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
   6. Vidaları çıkarın ve kuyu dibinde tüm yoğunlaşanı toplamak için 2 dakika süreyle 2000 x g'de santrifüj tekrar dönmeye ve kapak mat çıkarılması sırasında çapraz bulaşmayı önlemek için.
   7. Yaklaşık pH'ı ayarlamak için% 3.2 amonyak çözeltisi ekleyin. 8 12 kanallı 200 ul pipet kullanılarak. Bir TPE kapak mat ile PCR plaka Kapak ve elle sıkıştırma cihazı kullanarak sallayın.
   8. Nötralizasyon sonra 2 dakika süreyle 2000 xg'de PCR plaka santrifüj.
3. Yüksek verimli-1-fenil-3-metil-5-pirazolon (Şekil 1 'de Görev 7) karbonhidratlar (HT-PMP) -derivatization
   1. Transferi 50 12 kanallı ul pipet kullanarak taze PCR plakadaki nötralize hidrolizat 25 ul.
      Not: kısım aldıktan sonra, nötr kontrol1.25 mi, çok adımlı pipetle 12.5 ul fenol kırmızı gösterge (5 ml% 20 etanol içerisinde 0.05 g fenol kırmızısı) ilave ile hidroliz plakalarında kalan sıvının layan serbestleştirme. Pembe renk (pH 8) içine açmazlar Tüm kuyular doğru türetilmiş değildir.
   2. 75 ul türetme reaktif karışımı (125 mg PMP, 7 ml metanol, 3.06 ml GKD ₂ O ve 438 | il% 3.2 amonyum çözeltisi) ekleyin ve bir TPE kap mat levha kapsamaktadır.
   3. 2000 xg'de sıkıştırma tertibatı santrifüj plaka PCR plaka sıktıktan sonra 2 dakika altındaki tüm sıvı birikir için.
   4. türetme bir yer için 100 dakika boyunca 70 ° C de bir PCR-cycler PCR levhası 20 ° C'ye kadar soğutulmuştur.
   5. 12 kanallı 50 ul pipet kullanarak yeni bir MTP içine 20 ul tablet aktarın. Daha sonra, bir 12 kanal 200 ul pipet kullanın ve her bir hat 130 ul 19.23 mM asetik asit (0.962 mi, 1 M asetik asit + 49,038 mi GKD ₂ O) ekleyin. Aspirat yoluyla doğrudan karıştırıning ve (en az altı katı) dağıtma ve bir MTP kollektör plakası ile 0.2 um filtre plakasına tüm sıvı aktarın.
   6. Santrifüj plaka (5 dakika boyunca 1.000 xg), filtre plaka kaldırmak silikon kapak mat MTP mühür ve karbonhidrat parmak izi ¹⁴ belirlenmesi için UHPLC-UV-ESI-MS içine MTP'yi yerleştirin.
4. Glikoz-tayinin hazırlanması
   1. GKD ₂ O 45 ul ve 12 kanallı 50 ul pipet kullanılarak nötralize hidrolizatı 5 ul ekleyerek ile 1:10 seyreltme gerçekleştirmek ve bir silikon kap mat MTP'ler kapsamaktadır. Kalibrasyon için kullanılan yeni bir MTP üç kez farklı glükoz standartları (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2.5 ve 0 uM), 50 ul ekle.
   2. 12 kanallı 50 ul pipet kullanılarak glukoz-deney reaktif karışımı (tarifi step1.2.3) 50 ul ekle. Daha sonra silikon kapak mat plakaları kapak ve 30 ° C ve bir MTP-kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca 400 rpm'de inkübe edin.
   3. Doğrudan kuluçkadan sonra MTP-okuyucuda 418 ve 480 nm dalga boyunda bir MTP-okuyucuda okunan absorbans olun. Adım 2.6.4 gerçekleştirilen glikoz konsantrasyonu hesaplanması için doğrusal bir kalibrasyonu yapın.
5. Piruvat-tayinin hazırlanması
   1. 12 kanallı 200 ul pipet kullanılarak 1:20 seyreltme gerçekleştirin. Her bir oyuğa nötralize hidrolizatı GKD ₂ O 95 ul transfer 5 ul ekle. Bir silikon kapak mat MTP'yi örtün.
   2. (Karboksimetilamino-karbonil) -4.4'-bis (dimetilamino) -diphenylamine sodyum tuzu (DA-64), 300 ul 10 mM tiyamin pirofosfat, 60 ul 100 - piruvat-deney reaktif karışımı (3 mi 1 mM N 100 ul ekle mM magnezyum klorür hekzahidrat, 2.4 mi, 500 mM potasyum fosfat kirpi (pH 5.7), 30 ul 100 U piruvat oksidaz, 12 ul 1.000 U yaban turpu peroksidaz ve 12 kanallı 200 ul pipet kullanılarak 24.19 mi GKD ₂ O).
   3. Bir silikon kapak mat a ile plakaları KapakND, 37 ° C'de ve 30 dakika boyunca 150 rpm'de inkübe edin. Doğrudan 727 ve 540 nm 'de bir MTP-okuyucuda inkübasyon emilimi ölçün sonra.
6. Otomatik Tarama ve Karbonhidrat Parmak İzi Tüm Sonuçlarının Değerlendirilmesi.
   1. Ana kültür plakaları santrifüj ve atlıkarınca (viskozite kontrol adım 1.4.1) geri saklandıktan sonra sedimantasyon azalma göstermektedir, bu örneklerin not alın. pelet oluşumu görünmüyor numuneler (otomatik tarama için kriter 1) pozitiftir.
   2. Filtrasyon aşama (yüksek viskozite kontrol adımı 1.5.4.6) sonra, filtre plakası artıklara ile gösterilen son derece yapışkan bir üst fazları, dikkat edin. Süzüntünün eksikliği, aşağıdaki analitik modüller bir yanlış negatif sonuca yol açabilir. Filtre-kuyularda kültür süpernatanlarını korumak Örnekleri (otomatik tarama için 1 kriterinden) pozitiftir.
   3. Görme kuluçkadan sonra lif veya pul oluşumunu gözlemlemek. inci gibi notlar alınisimli polisakaritler gösterir. hiçbir yağış Rate (-); (+) Olan lifler ya da parçacıkların düşük çökelme ve yüksek çöktürme (++). Ayrıca, ancak ikinci çökeltme (otomatik tarama için kriter, 2) 'de, birinci elyaf ve pul gözlem ile filtre zarı polimerin adsorpsiyonu algılar.
   4. glikoz konsantrasyonunun hesaplanması için doğrusal bir kalibrasyon yapın.
      
      Bu denklemin büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   5. 5 0.1 g / L glukoz arasındaki doğrusal kalibrasyon (konsantrasyon üzerinde emme) gerçekleştirin. hidrolize polimerlerin glikoz eşdeğeri hesaplanması ve aşağıdaki parametreler ile değerlendirmek: glikoz eşdeğeri:> 700 mg / L = pozitif; 300-700 mg / L = farazi pozitif;
      Bu denklemin büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
   6. HT-PMP yöntemi ile belirlenen tüm karbonhidratlar ölçmek. Tüm miktarlarda özetlemek ve aşağıdaki gibi değerlendirmek:> 300 mg / L (pozitif); 150-300 mg / L (varsayılan pozitif) ve <150 mg / L (negatif).
   7. piruvat yoğunluğun hesaplanması için doğrusal bir kalibrasyon (100, 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0 uM) gerçekleştirmek. süpernatant kalan piruvat dışlamak için, hidroliz önce piruvat içeriği aracılığıyla hidroliz sonra piruvat içeriği düzeltin.
      
      Bu equat büyük halini görmek için buraya tıklayınıziyon.

Sonuçlar

Fenol-sülfürik asit yönteminin doğrulanması 0,9998 (Tablo 2) belirlenmesi (r²) içindeki bir katsayı ile iyi sonuçlar elde edilmiştir. 5 g / L konsantrasyonunda varyasyon (CV) katsayısı ve doğruluk için% 5,3 (CV) ve% 6.1 hata ile 0.25 g / L standart% 1.8 ve% 2.2 hata, ancak daha düşük performans ile iyi bir performans (gösterdi Önyargı).

(Matris olan ve olmayan), her ikisi de piruvat-deney kalibrasyon eğrilerinin belirlenmesi katsayıları 150 uM (Tablo 3) bir kalibrasyon aralığı içinde> 0,9999 edildi. yüksek ve en düşük kalibrasyon seviyesi için varyasyon (CV) katsayılarının

Tablo 4 'de başarılı bir şekilde tarama platform ile tespit edilen üç örnek teşkil eden yeni suşların ayrıntılı sonuçlarını göstermektedir. Tablonun sol kısmı viskozite oluşumu, polimer üretimi ve ayrıntılı karbonhidrat parmak izi analizi için değerlendirme parametreleri olarak kullanılmıştır toplam hidroliz glikoz eşdeğeri ilişkin otomatik tarama modülleri sonuçlarını görüntüler. kalibre şekerlerin yanı sıra bilinmiyor şekerler, dimerleri ve ikame göre karbohidrat parmak tablonun sağ tarafında verilmektedir. Bu bilginin kullanılmasıyla monomer bileşimin hesaplanmış ve önceden bilinen bir polimer yapıları ile karşılaştırılabilir. Ayrıca ilginç monomer bileşimler ve nadir karbonhidratlar için hedeflenen bir tarama yapılabilir.

mikro yüksek performanslıÖlçek hidroliz ve HT-PMP-türetme önceki çalışmalarında ¹⁴ saptandı. Bundan başka, jel filtrasyon ve çeşitli cins karbonhidrat parmak izinin doğrulama bir yayın ^6'da tarif edilmiştir. Özetle, modüler yapısı ile tarama platformu kolayca değiştirilebilir ve kullanıcının bireysel ihtiyaçlarına uyarlanmış. Platformun otomatik tarama sekiz kat daha yüksek verim sağlayan ve güvenilir sonuçlar verir. piruvat-tahlil gibi yeni analitik modüller entegre edilebilir ve karbonhidrat parmak izi analizi ile birlikte belirledikleri EPS hakkında çok ayrıntılı bilgi sağlar. hem biraz değiştirilmiş ve tamamen yeni EPS varyantlar ararken Böylece, tarama platformu esastır.

Şekil 1: Modüler h genel şemasıüksek verimlilik ekzopolisakkarid tarama platformu. otomatikleştirilmiş tarama ilk üç görevleri içerir. Bakteriler 96 oyuklu plakalar içinde yetiştirilen sonra hücreler, santrifüj (görev 1) ve bir 96-çukurlu filtrasyon (görev 2) ile çıkarılır. Daha sonra, büyüme ortamı, kalan monomer şekerler, 96 oyuklu bir jel filtrasyonu (görev 3) ile çıkarılır. örnekleri içeren EPS tarama platformu karbonhidrat parmak izi son üç görevleri içerir görev 4. değerlendirilir. Görev 2 pozitif isabet kalan süzüntü, karbohidrat, parmak izi HT-PMP yöntemi ile analiz edilebilir görev 6 hidrolizi sonra görevi 5. jel filtre (yüksek verimli 1-fenil-3-metil için bir temel sağlar -5-pirazolon, görev 7). Tüm görevler, farklı analitik modülleri ve / veya viskozite kontrolü ile takip edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

: fo lass = "jove_content"
Şekil 2: Tarama platformu için Robot Worktable kurulumu hem sıvı taşıma robotu worktables ve Düzenleri gösterilmiştir. (A) robotik sıvı taşıma sistemi ve (B) sıvı taşıma istasyonu. (A) kurulum iki konum (pozisyon 1-2 1-1), dört pozisyonları her dört pozisyonlara (pozisyon 2-4 2-1) ve üç mikroplak taşıyıcıları ile tek kullanımlık uçları için bir taşıyıcı ile bir mikroplaka taşıyıcı oluşur (konumları 3-1 4-1 5-4 4-4 ve 5-1 ile, 3-4). Buna ek olarak, 21 mikro titre plakaları yedi derin sağlam plakanın (DWP) ve dört Otel taşıyıcı (6-9) her biri için beş Otel taşıyıcı (1 ilâ 5) her biri, bir depolama döngü vardır. sıvı taşıma robotu yüklü donanım tek kullanımlık uçları ve betwee levhalar / ekipman hareket eden bir robot manipülatör (RM) ile kullanılmak üzere 96 kanal pipet-koln çalışma masası, depolama atlıkarınca, MTP-okuyucu, santrifüj ve sallayarak-inkübatör. (B) sıvı taşıma istasyonu sıvı taşıma kolu ile donatılmıştır ve 8 kanallı 300 ul pipet, 1 konumundaki bir çöp konteyneri, 250 ml 300 ul ipuçları (konum 2), bir yükseklik adaptörü 30 ile bir ipucu adaptörü MTPs'lerden yalak (konum 3) ve beş yükseklik adaptörü 60 (8 pozisyon 4). Kutup numaralandırma Bu protokol boyunca anılır. Eşdeğer kurulumları mevcut olup olmadığını, alternatif işyerleri de kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: piruvat-tahlili ile belirlenen 16 ticari olarak temin edilebilen polimerlerin Piruvat içeriği. 1 g / L polimer çözeltisi sonras hidrolize ve nötralize edildi, piruvat-tahlil 1:10 seyreltme dan (n = 3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Modüler yüksek verimli bir tarama platformu akış şeması. Farklı polisakkarit algılama modülleri birleştiren otomatik tarama sistemi: viskozite oluşumu, polimer üretimi ve toplam karbonhidrat içeriğinin belirlenmesi analizi. İkinci bölüm ilk bölümünde tanımlanan tüm seçili EPS üreticileri için ayrıntılı bir monosakkarit analiz sağlar. UHPLC-ESI-MS yoluyla karbonhidrat parmak dan otomatik tarama Tüm veriler ve veriler bir veritabanında toplanarak ALR yapısal ilgili türevleri basit kimlik sağlayacak olaneady EPS ya da yeni EPS bilinen ve bu nedenle, bir hedef tarama. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ana adım / Analitik modülü	İş Akışı	Gözlem / Açıklama
suşları Yetiştirme	1 mi EPS ortamının bir Ön kültür 48 saat 30 ° C, 1000 rpm'de bir Ana-kültür 48 saat, 30 ° C, 1000 rpm bir	EPS üretimi
Hücre kaldırma / viskozite	Santrifüj: 4300 xg'de 30 dakika	Hiçbir pelet = artan viskozite = pozitif
Polimer Tespiti: Yağış	50 ul supernatant + 150 ul 2-propanol b Oda sıcaklığında, 10 dakika ve 900 rpm B Çalkalama	Görsel: Lifler ve pul = polimer pozitif yağış
Hücre çıkarma / yüksek viskoziteli	Ana kültürün 180 ul süpernatan Santrifüj: 3,000 xg'de 10 dk 1.0 um, cam elyaftan zar	Hiçbir filtre geçen = yüksek viskoziteli = pozitif
Polimer Tespiti: Yağış	50 ul süzüntü + 150 ul 2-propanol b Oda sıcaklığında, 10 dakika ve 900 rpm B Çalkalama	Görsel: Lifler ve pul = polimer pozitif yağış
Glikoz tüketimi: Glukoz-deney	Seyreltme 1: 100: 10 ul filtre ürünü + 990 ul GKD 2 O 50 ul alikot + 50 ul Reagent-mix Kuluçka 30 dakika 30 ° C'de 150 rpm'de Ölçme 418-480 nm	kültivasyonu takiben glikoz Kalan
Jel filtrasyon	Dengeleme: 3 x 150 ul NH4 -acetat tamponu pH 5.6 2.000 xg'de 2 x 2 dk 1000 xg'de 1 x 2 dk Jel filtrasyonu: 35 ul filtre ürünü, 1.000 x g'de 2 dakika yıkama: 3 x 150 ul GKD 2 O, 2.000 x g'de 2 dakika depolama için 75 ul% 20 etanol	Polimer saflaştırma: kültür süpernatanından tuzları piruvat, glikoz ve diğer şeker monomerlerinin Kaldırma
Jel süzme sonrasında kalan glukoz Glukoz-deney	1:10 seyreltisi: 25 ul GKD 2 O + 20 ul GKD 2 O ve 5 ul filtre ürünü + 50 ul reaktif karışımı Kuluçka 30 dakika, 150 rpm'de Ölçme 418-480 nm	fenol-sülfürik asit yönteminden jel filtreleme işleminden sonra kalan glikoz Çıkarma
Glukoz eşdeğeri: Fenol-sülfürik asit yöntem c	20 ul filtre ürünü jel + 180 ul fenol-sülfürik asit (30 ul,% 5 (GKD içinde ağırlık / hacim) fenol 2 O + 150 ul konsantre.! H 2 SO 4 (ρ = 1.84 g / ml)) 900 rpm'de 5 dakika Çalkalama Kuluçka 35 dakika, 80 ° C'de 480 nm seviyesinde ölçüm	Glukoz eşdeğeri: Δ (fenol-sülfürik asit değeri - jel filtreleme işleminden sonra kalan glikoz) <300 mg / L negatif > 300 ve pozitif varsayılan <700 mg / L > 700 mg / L pozitif
Bir elle steril koşullar (laminer akış) altında işliyor.
b Yanıcı sıvı davlumbaz altında elle işlenmiş.
c Fenol-sülfürik asit Marka Sıvı davlumbaz altında İstasyonu (LHS) Taşıma ele.

Tablo 1:. Otomatik analitik modüller için tüm parametrelerin robot sıvı taşıma sistemi ve sıvı taşıma istasyonu ile otomatik prescreening tam iş akışı bakış.

doğrusallık			LOD	LOQ
r² a	Eğim a	Ofset bir	mg / L'	mg / L'
0,9998	0,0007	-0,021	50	100
Standart		b ortalama	hassas b	doğruluk b
mg / L'		mg / L'	ÖZGEÇMİŞ%	Eğilim (% hata)
5000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
0,1 ila 5 g / L kuvvetini altı seviyeleri glükoz ile kalibrasyon bir ortalama
b Student t-testi ile gerçekleştirilen (α = 0.05; n = 8).
LOD: determinasyon limiti, LOQ: tayin sınırı, CV: değişim katsayısı.

Tablo 2:Fenol-sülfürik asit yöntemi Doğrulama sıvı taşıma istasyonu ile yürütülmüştür. Doğrusallık altı noktalı kalibrasyon ile hesaplanmıştır (n = 8). Ortalama, hassas ve iki örnek olarak seçilen glukoz konsantrasyonları doğruluğu burada verilmiştir.

	doğrusallık			LOQ
	r² a	Eğim a	Ofset bir	iM
matris olmadan	0,99999	0,0223	-0,0019	1
1:10 oranında seyreltildi matrisi	0,99999	0,0221	-0,0011	1
	Standart	b ortalama	hassas b	doğruluk b
	iM	iM	ÖZGEÇMİŞ%	Eğilim (% hata)
matris olmadan	50	49,96	3.05	-0.09
	1	1.04	2.95	3.86
1:10 oranında seyreltildi matrisi	50	49.98	0.44	-0.04
	1	1.00	4.58	0.33
Üç ölçüm, 1 ila 50 um, piruvat altı konsantrasyonlarda kalibrasyon bir ortalama.
B (n = 3)
LOQ: Kuvantalama sınırı, CV: değişim katsayısı.

Tablo 3:. Ve 1:10 seyreltildi nötralize trifloroasetik asit-matris olmadan piruvat-tahlilin Doğrulama iki ila altı noktalı kalibrasyon (n = 3) ve matris etkilerin değerlendirilmesi yapıldı yoktur. Ortalama, hassasiyet ve ve 1:10 seyreltme etkisi olmadan iki örnek olarak seçilen piruvat konsantrasyonları doğruluğu hesaplanmıştır.

Tablo 4:.. Platformu ile tarandı üç örnek suşları Sonuçları Veri otomatik tarama ve karbonhidrat parmak toplanan Lütfen cMicrosoft Excel dosyası olarak bu tabloyu indirmek için buraya yalamak.

Karbonhidrat	Emilim max [nm]	480 nm ortalama ± SS olarak Emilim		Absorbans göreli [%] glikoza
Diutan sakız	470	0.342	0.010 ±	187
gellan zamkı	472	0.334	0.002 ±	183
Guar sakızı	478	0.387	0.017 ±	212
gummi arapça	476	0.393	0.034 ±	215
Hiyalüronik asit	484	0.231	0.011 ±	126
karaya zamkı	478	0.455	0.023 ±	249
konjak zamkı	480	0.297	0.009 ±	163
karaçam sakız	480	0.337	0.032 ±	185
Keçi boynuzu zamkı	478	0.354	0.033 ±	194
skleroglukan	484	0.168	0,010 ±	92
süksinoglikan	482	0.168	0,005 ±	92
tara zamkı	480	0.318	0.016 ±	174
kitre	478	0,513	0.003 ±	281
velan sakız	472	0.226	0.016 ±	124
ksilan	472	0.567	0.007 ±	311
Ksantan sakızı	482	0.245	0.021 ±	134
glikoz	484	0.191	0.014 ±	100
SD: standart sapma

Tablo 5:. Sonuçlar 16 ticari olarak temin edilebilir polimerler ve glikoz için fenol-sülfürik asit metodu ile elde edilen maksimum soğurma ve emici 16 ticari olarak temin edilebilen polimerlerin (1 g / l) 480 nm 'de hem de glikoz (1 g / L ) fenol-sülfürik asit yöntemi kullanılarak ölçüldü. Tüm polimer glikoz absorbans göre hesaplandı.

	Standart	Ortalama	hassas bir	doğruluk
	mg / L'	mg / L'	ÖZGEÇMİŞ%	Eğilim (% hata)
01:10 seyreltme	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1.41	-0,70
1: 100 dilüsyon	4.500	5026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4.55
b Student t-testi ile gerçekleştirilen (α = 0.05; n = 8).
CV: değişim katsayısı.

Tablo 6:. glukoz deneyi için otomatik seyreltme Doğrulama tohumları (1: 100) sonra, glukoz-tahlil için seyreltme ve jel filtrasyon (1:10) daha sonra doğrulanmıştır. Iki glukoz konsantrasyonları (n = 8), sıvı işleme sistemi ile seyreltildi ve değerlendirilmiştir. Ortalama, hassasiyet ve doğruluk hesaplandı.

Teorik glukoz değeri	Silikon kapak mat ile kaplı			Buharlaşma Testi (ortaya)
	ortalama bir	hassas bir	doğruluk	ortalama bir	hassas bir	Doğruluk </ Strong>	buharlaşma
mg / L'	mg / L'	ÖZGEÇMİŞ %	Eğilim (% hata)	mg / L'	ÖZGEÇMİŞ %	Eğilim (% hata)	%hata
45.0	45.2	0.69	0.44	46.0	0.66	2.05	1.60
18.0	17.7	0.80	-1,68	18.0	0.72	-0.01	1.69
9,0	8.74	1.20	-2,98	8.92	0.81	-0,95	2.09
4,5	4.50	1.26	-0.04	4.58	1.57	1.76	1.80
1.8	1.85	0.74	2.90	2.01	2.82	11.6	8.48
0.9	1.03	1.43	14.1	1.16	3.52	28.3	12.4
(n = 4)
CV: değişim katsayısı.

Tablo 7:. Kapalı ve kapalı OVP altı farklı glükoz standartları buharlaştırılması etkisinin değerlendirilmesi (n = 4), oda sıcaklığında 3.5 saat için atlıkarınca depolanmıştır. buharlaşma etkisi standart örnekleri ortaya yanı sıra kapalı (silikon mat) kullanılarak değerlendirildi. Ortalama, hassasiyet, doğruluk ve% hata buharlaşma hesaplanmıştır.

jel filtrasyon öncesi

	Gel-Filtration		Jel süzme sonrasında kalan glukoz
	ortalama bir	SD		ortalama bir	SD
	mg / L'	mg / L'	mg / L'	mg / L'	%
1	8647	110	259	121	3.00
2	5108	56	116	37	2.27
3	2014	12	50.8	14	2.52
4	1.015	12	25.1	8.1	2.47
5	510	4.9	12.8	4.3	2.51
6	223	8.6	6.6	1.5	2.94
7	122	5.6	4.3	0.9	3.48
8	75	6	3.1	0.3	4.18
A (n = 8)
SD: standart sapma

Tablo 8:. Jel filtrasyon verimliliğine sonuçları Sekiz farklı glükoz standartları jel filtrasyon etkinliğinin değerlendirilmesi için önce ve jel süzme sonrasında tespit edilmiştir. % olarak jel filtrasyonu hesaplanmıştır standart sapma ve kalan glukoz sonra.

Tartışmalar

Fenol-sülfürik asit yöntemle Polisakarit tespiti: Farklı monosakaridler bu yöntemin ⁹ kullanımı ile farklı bir absorpsiyon maksimum ve molar sönüm katsayılarını gösteriyor. Bu, farklı miktarlarda çeşitli şekerler içeren polimerlerden farklı soğurma maksimumları ile sonuçlanır. 16 farklı ticari olarak temin edilebilir polimerler için absorpsiyon maksimum seviyesinin farklı dalga boylarının Tablo 5'de verilmiştir. Polimerler (1 g / L) içinde eritildi GKD ₂ O (150 rpm), gece boyunca karıştırıldı ve fenol-sülfürik asit-yöntemi ile ölçülmüştür . Diutan sakız 470 nm ve skleroglukan ve hyaluronik asit 484 nm'de en yüksek, en düşük maksimum absorpsiyon gösterdi. Bu sonuçlara dayanarak 480 nm bu tarama platformu için seçildi. Polimerlerin göreceli emme (% 100 olarak ayarlanmış), 1 g / L glikoz elde edilen absorbansa göre hesaplandı. düşük sonuçlar% 92, her ikisi de skleroglukan ve süksinoglikan ile elde edilmiştir. Bu ihr olduskleroglukan sadece glikoz içerir ve süksinoglikan 7 oranında glikoz ve galaktoz içerdiği yansıtılmaktadır: 1 arasındadır. Hem ticari polimerler kurutma ve farklı kül içeriğinin farklı kayıplar, bu ~% 110 teorik değeri ulaşılamamıştır nedeni budur. Ksilan 311% ile en bağıl absorbans gösterdi. Bunun nedeni daha baskın furanoz forma ksiloz ulaşılan yüksek molar tükenme katsayısı. 0.1 g / L glukoz seviyesinde miktar sınırı ulaşıldı, hem de bir konsantrasyonda <0.05 g / L'de tespit limiti. Bununla birlikte, tarama pozitif suşları için tespit limiti daha yüksek 0.7 g / L ve bu nedenle, tahlil, iyi bir performans göstermiştir. güvenilir sonuçlar elde etmek için, jel-filtreleme sonra kalan glikozu, bir glikoz-tahlili ile belirlendi ve bu değer, fenol-sülfürik asit yönteminden değerinden çıkarıldı.

Otomatik glukoz-tahlil seyreltme: performansekimi (sulandırma 1: 100), daha sonra glukoz belirlenmesi araştırılmıştır. Bunun için, süpernatan 10 ul aspire ve seyreltme 180 ul dağıtma on kat ile derin oyuklu bir plaka içerisinde GKD ₂ O 990 ul transfer edildi ve karıştırıldı. İkinci önemli bir adım jel filtrasyon sonrası glikoz tahlili 1:10 seyreltme için yalnızca 5 ul alikot doğru pipetleme idi. GKD ₂ O seyreltme 25 ul oluşturmak için ilk 50 ul-ucu ile transfer edilmiştir, GKD ₂ O ve 5 ul jel süzüntünün daha sonra 20 | il bir araya aspire edildi. Bu ucu dışarı 5 ul alikotununLH daha iyi uzaklaştırılmasını sağlar. Her ikisi de seyreltme adımları bir glikoz-tahlil yoluyla çeşitli glukoz standartları ile doğrulandı. İki örnek konsantrasyonları için sonuçları Tablo 6'da verilmiştir: 1. 100 seyreltme glukoz içeriğinin belirlenmesi için ekimi bir CV & # ile hem standartları yüksek hassasiyet gösterdi sonra60,% 1.2. Aynı zamanda, daha yüksek standartta için doğruluk 11.6 (% hatası) kadar oldu. glukoz belirlenmesi kültivasyonu takiben geriye kalan glukoz içeriği temsil eder ve bu nedenle, polimer, algılama için önemli değildir Ancak, bu ihmal edilebilir düzeydedir. Jel süzme sonra kalan glikoz 1:10 seyreltme CV <% 1,4 ve doğrulukla <% 2.1 hatası çok güvenilir sonuçlar göstermiştir.

buharlaşma göz önünde: tarama, ilk glukoz-tahlil ilk adım 3.5 saat gerektirir. Bu zaman çerçevesi kapatılmamış MTP depolama etkisinin olup olmadığını öğrenmek için, glukoz-tahlil kalibrasyon standartları 50 ul ve robot atlıkarınca 3,5 saat kapaksız saklandı. kalibrasyon aralığı (45-4,5 mg / L), numune konsantrasyonu hemen hemen artmıştır. Bir artış - buharlaşma nedeniyle -% 2,1 altında ve sadece iki düşük konsantrasyonlarda (1.8 ve 0.9 mg / L)% 12.4 kadar ulaşmıştır (oldu Tablo 7).

Jel filtrasyon: non-metabolize glikoz Yüksek miktarda hidrolize polimerden glikoz kantitatif tespiti rahatsız. Bu nedenle, bir jel filtrasyon aşaması, kültivasyondan sonra, kalan glukoz kaldırmak için gerekli oldu. Buna ek olarak, jel filtrasyon monomer analizinde analiz arka en aza indirmek için, glikoz daha tuzları ve monomerik karbohidrat bileşikler diğerlerinden süpernatan ihtiva eden polimer temizler. Jel filtrasyon adımında filtre 35 ul iyi merkezine yerleştirildi. otomatik sistemi içerisindeki jel-filtrasyon sağlamlığı doğrulama için, 9 g / L glikoz kadar 0.045 sekiz kalibrasyon standartları süzüldü (n = 8). Her konsantrasyon glükoz, her zaman ilk değer (Tablo 8)% 95'den daha fazla azalmıştır. Bu şekilde, jel filtrasyon glikoz çeşitli konsantrasyonlarda çok iyi sonuçlar elde edilmiştir. Buna ek olarak, diğer glukoz jel f sonra, filtrasyon da glukoz-testi ile belirlenmiştir ve hidrolize polimer için glukoz eşdeğeri doğru miktarda almak için fenol-sülfürik asit belirlenmesi çıkarıldı.

Piruvat-deney: Her şeyden önce, bu hidroliz aşamasından nötralize edildi ve seyreltildi (1:10), TFA-matris, enzimatik reaksiyonu kesintiye uğrattığı araştırılmıştır. Bu nedenle, tam tahlil ile bir kez ve bir kez matris olmadan, iki kez gerçekleştirilen ve güvenilir sonuçlar gösterdi. Son olarak, 16 ticari olarak temin edilebilen polimerlerin piruvat içeriği başarıyla ölçülmüş ve Şekil 3'te gösterilmektedir. Genel olarak, bu 16 polimerler arasından, sadece süksinoglikan ve ksantan doğal piruvat içeren bilinmektedir. Bizim piruvat-tahlil ile bu polimerlerin iki doğru bir şekilde tespit edilmiştir. skleroglukan olarak, velan sakızı ve ksilan piruvat da önemli miktarda tespit edilmiştir. Genel olarak, yaklaşım yeteneği onaylanmış ve piruvat-tahlil s olduyüksek performans howed. Bu hidroliz sonrası farklı polimerler içinde piruvat tespit etmek mümkün olduğu kanıtlanmıştır.

Karbonhidrat parmak izi: Otomatik tarama tüm analitik modülleri gerçekleştirdikten sonra, potansiyel EPS üreticileri karbonhidrat parmak izi analizi için seçildi. Bunun için, çeşitli kriterler uygulanmıştır: viskozite 1) pozitif bir gözlem santrifüj sonra ve / veya süzme sonrasında. 2) Yağış süzme öncesinde ve sonrasında. Gözlenen lifler ve yongalar olumlu olarak değerlendirilmiştir. fenol-sülfürik asit yöntemiyle 3) Glikoz eşdeğer değer. > 700 mg / L değerleri arasında pozitif olarak değerlendirilmiştir ve 300 ve 700 mg / L arasındaki değerler varsayılan EPS üreticileri olarak değerlendirilmiştir. iki ya da üç kriter pozitif olarak değerlendirilmesi durumunda, suşları daha karbohidrat parmak izi analizi için seçildi. Kriterler EPS tarama (örneğin, düşük viskoziteli EPS) bireysel amaca yönelik özelleştirilebilir. Bizim yaklaşım effici bulma amaçlıent üreticileri EPS. Sadece EPS küçük miktarlarda üretmek suşları ararken glikoz eşdeğeri değerlendirme sınırı azaltılmalıdır.

Teknik yarar ve gelecek uygulamalar: Bu protokolün ilginç bir özelliği adımlar ve farklı analitik modüllerin modüler karakteridir. Bunlar bireysel gereksinimlere göre ayarlanabilir, farklı şekillerde kombine edilebilir ve yeni modüller kolayca uygulanabilir. Ayrıca, analiz modülü ayrı ayrı kullanılabilir örneğin HT-PMP-türetme modülü ile bir arada hidroliz modülü 96 oyuklu bir formatta, farklı polimer çözeltileri (1 gr / lt) bir monomerik bileşimin analizi gerçekleştirebilir. tam tarama pipetleme şemasında herhangi bir değişiklik olmadan manuel olarak ele alınabilir bir sıvı taşıma sistemine erişimi kalmadan laboratuvarlar için. Ancak, sıvı taşıma sistemi kullanılarak en fazla 768 suşları (yerine Screene eğer 192 suşları verimi artırırgün başına) elle d. Burada açıklanan protokol farklı cins için bir tarama özelliğine sahiptir ve bu nedenle, yeni bir EPS üreticileri belirlemek ve bir yaklaşımı (Şekil 4) da karbohidrat parmak izi analizi büyük Strain collections'da taranması için kullanılabilir. Ayrıca, fukoz gibi nadir şekerler, üronik asitler ya da bilinmeyen bir şeker içeren polisakaridler için hedeflenen bir tarama detaylı bir monosakarit analizi ile yapılabilir. Ayrıca, tanımlanan oranlarda çeşitli şeker kombinasyonları tespit edilebilir. Bu zaten bilinen EPS veya yeni EPS yapısal olarak ilişkili türevleri basit tanımlanmasını sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2