再加上高灵敏度指纹碳水化合物自动分析模块化高通量筛选胞外多糖平台

摘要

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

摘要

许多微生物能够产生和分泌的胞外多糖（EPS），其具有在医学领域，食品应用或在更换的基于石油化工的重要影响。我们描述了一种液体处理系统，其允许的类型和EPS的由微生物产生的量的快速和可靠的分析，以进行自动化分析平台。它使用户能够确定新的天然微生物胞外多糖生产者和分析在一天之内的相应聚合物的碳水化合物指纹在高吞吐量（HT）。使用此平台，应变集合以及可能在工程方法来获得的菌株的变体的文库可以筛选。该平台有一个模块化设置，其允许分离协议的为两个主要部分。首先，有一种自动筛选系统，它结合了不同的多糖的检测模块:viscosit的半定量分析通过离心步骤，通过乙醇沉淀的聚合物的形成进行分析，并通过苯酚 - 硫酸 - 酸转化的总碳水化合物含量的测定ý形成。这里，有可能筛选高达每运行384菌株。第二部分通过组合两个基本模块为所有在第一部分中确定的选定车生产者详细单糖分析:完整单体组合物通过超高效液相色谱加上紫外线和电喷雾电离离子阱检测（分析UHPLC-UV-ESI-MS）和丙酮酸的确定为耦合到一个颜色形成通过酶促氧化的聚合物取代基（丙酮酸缩酮的存在下）。所有这种筛选平台的分析模块可以以不同的方式进行组合，并调节至个别的要求。此外，它们都可以被人工处理或与液体处理系统进行的。由此，筛选PLATForm的实现了巨大的灵活性，以确定不同的EPS。

引言

微生物胞外多糖（EPS）是满足各种生物功能聚合物的结构高度多样化的群体。它们通常都建复杂的重复单元，其由不同类型的单体（糖，糖的衍生物，糖酸），这些单体和它们的取代之间的键区分开的。微生物多糖的结构多样性赋予这种分子类，允许类的食物¹不同的领域及其应用，化妆品^2,3，建筑化学⁴或水处理⁵的成员，而不同的特点。以进一步扩展这些生物基和这种可持续聚合物新颖天然微生物多糖的识别以及结构变体的工程表示有前途的方法的应用领域。无论哪种方式，需要快速筛选方法来快速扫描兵卫微生物菌种的广大- [R多糖的形成，并分析他们的产品。因此，我们最近开发了用于从天然分离或工程菌株的变体，其包括单体组合物⁶的识别微生物多糖生产分析的96孔HT-筛选平台。

应用此平台的第一轮筛选〜500天然分离的使我们能够确定只有约10％至20％的分离株为能够产生车（未示出数据）。这意味着，所分析的菌株的80〜90％没有产生所施加的条件下的EPS，因此，详细的碳水化合物指纹的一个进一步的分析是没有必要的。作为这种高度复杂的识别单体组合物是一个耗时的过程，特别是对于数据分析，快速的预筛选方法，以确定该菌株的EPS生产正，会急剧增加的效率。此外，试剂耗材和测量时间的UHPLC-UV-ESI-MS将会减少。此外，不同的分析模块，虽然，一方面使该方法高度可靠的，是在另一方面复杂多于两个96孔板的并联的手工处理，因此限制了该方法的全部潜力。由于这些原因，我们决定开发一个自动化筛选平台。因此，我们结合总糖含量的完全自动化的快速检测方法的现有碳水化合物指纹技术的模块化格式，根据吸光度测定。

酚-硫酸-酸方法仍然代表所选择的用于快速确定细菌和植物多糖^7,8的总碳水化合物含量的方法。这种方法首先由Dubois 等人 ⁹在96-孔板^10,11描述的和适于不同的应用和样本大小，即使是小规模的。苯丙氨酸NOL - 硫酸酸方法测量一个值的总碳水化合物的含量，所有求和单体，低聚物和样品的聚合碳水化合物。

考虑到这些方面考虑，合适的培养介质的选择是必不可少的应用此方法。含低聚或类似酵母提取物高分子糖类化合物复杂的介质可能导致改变聚合物的含量，因此，应严格避免。此外，大量的糖被用作C-源菌株的培养。从栽培过程中其余的碳水化合物高水平可能负面与EPS内容的干扰测量。

因此，使用定义和纯糖的建议。在我们的实验中，我们使用葡萄糖的细胞的培养。培养后剩余的葡萄糖溶液通过凝胶过滤减少和通过葡萄糖的测定法来确定。最后，葡萄糖当量多糖第被已经用苯酚 - 硫酸 - 酸法检测到的从总碳水化合物含量凝胶过滤后减去剩余的葡萄糖计算。凝胶过滤和葡萄糖的测定与苯酚 - 硫酸 - 酸法组合保证可靠的结果，并且能够被提供了第一，完全自动化的检测系统。

两个新的分析模块，包括在自动化筛选平台，以增加从所述EPS检测系统的信息量:沉淀和粘度增大的观察。

许多不同的EPS - 例如琥珀酰聚糖，黄原胶和结肠酸¹² -据报道，与糖位置C4和C6的非碳水化合物丙酮酸缩酮进行修改。那些丙酮酸缩酮（正如琥珀半酯和糖醛酸）向聚阴离子性质，因此，在物理prope通过经由二价阳离子桥¹³相互作用的聚合物的rties。为了确定这些特定聚合物丙酮酸的确定建立了作为另一其他分析模块。这增加了对多糖的取代基和其潜在的宏观性质的信息。

结合所有的模块使不同EPS的标识以及一个快速，高效的决心EPS生产商。通过这种方法的筛选平台可分为两个主要部分（ 图1）。在自动筛选（第一部分）的工作流中出现全自动化（ 表1）快速预选产生菌的EPS。碳水化合物指纹分析（第二部分）定量确定由预选菌株产生的EPS的单体组合物。从而，数据分析以优化的大应变集合的筛选最小化。这个提供分析在一个单一的自动筛选运行，并以二奔跑的每每天768株天是可能的384株的可能性。此外，该碳水化合物指纹分析给出了所有所识别的车的一个更详细的概述。这使定向分析和仅稍微不同的EPS的变体或完全新的识别相比EPS的已经描述的化学结构。

研究方案

1.自动筛选

注意:所有液体处理步骤与机器人液体处理系统完成的。机器人工作台的组合物示于图2中 ，所有的消耗品被存储在存储传送带，除非另外提及。对于所有的自动筛选步骤a机器人操纵器（RM）移动消耗品，（深孔板（DWP）;微滴定板（MTP）;聚合酶链反应板（PCR板）等）的转盘位置之间（CP ）和工作台位置（WTP）。所有吸移管的步骤与一个96通道移液器臂进行的，如果它被另外提及除外。所有步骤被编程，并在96-孔格式自动地执行。

1. 菌株培养（任务1在图1）
   注:处理推定的车生产菌株的接种和无菌条件（层流）下的培养板的密封。自动化快速筛选每秒可以处理运行四个96孔板。几个属不同菌株已经测试^6。
   1. 手动从96孔甘油板96针复制器接种预培养（1毫升EPS-媒体在DWP）。覆盖透气密封膜的板，以避免蒸发和以允许通气。孵育在30℃下48小时以1,000rpm上的MTP-摇床。
   2. 用50微升12通道多吸量管和相同的条件预培养下孵育转印10微升预培养接种主培养物（在一个DWP 990微升EPS-介质）。以记录所有不生长的菌株。
2. 机器人工作台和存储旋转木马的制备
   1. 提供在材料和设备列出在存储转盘正确位置所有消耗品。在DWP的每孔加入双蒸水990微升（DDH ₂ O）为1:100稀释液次Ë葡萄糖测定法（转盘位置4-1到4-4）。
   2. 安排250毫升槽装有150毫DDH ₂ O的在工作台位置（WTP）11。
   3. 沉积的250ml槽含有50ml葡萄糖测定试剂混合（4毫升500毫摩尔磷酸钾（pH 5.7），将1.5ml的50mM 2.2 azinobis-（3ethylbenzthiazoline）-6-磺酸，加入2ml 100单位葡萄糖氧化酶， 10微升1000ü辣根过氧化物酶，并且位置WTP 1-242.49毫升的DDH ₂ O）。
   4. 将两个空的虚拟F-底部台胞证在位置WTP 3-1和3-2。
   5. 取下透气密封膜，分配主文化的转盘位置（CP）1-1到1-4，并开始自动机器人程序。
3. 凝胶过滤板的平衡
   注意:在本筛选中使用的凝胶过滤板可重复使用。对于这一点，在20℃洗涤和离心分离3次，每次用150微升的DDH ₂ O为在2000 xg离心2分钟。此后，储存在4°下用75微升20％的乙醇中并用一个硅帽垫覆盖。
   1. 移动用5mM乙酸铵缓冲液（pH 5.6），以在WTP 3-3 250mL的槽（CP 5-7）。
   2. 传送从传送带凝胶过滤板（CP 1-6，1-7，2-6和2-7）的支付意愿4-1至4-4。
   3. 用吸200微升的提示，分装到了平衡所有凝胶过滤板的中心醋酸铵缓冲液150微升。
   4. 传送凝胶过滤板进入离心机（2000 xg离心2分钟，在20℃）。
   5. 转移板回到工作台，重复步骤1.3.3，1.3.4和1.3.3。不重复离心步骤，以避免凝胶过滤板的脱水。存储平衡凝胶过滤板传送带内回来。
4. 通过离心细胞去除（任务1在图1）
   注意:为了确保所述筛选方法中的一个低的背景，分析无细胞只含EPS上清和培养后通过离心除去细胞。
   1. 从传送带（1-1〜1-4）进入离心机传送主培养DWP（4300 xg离心30分钟，在20℃）。
   2. 通过RM准备工作台加工为主的文化。
      注意:对于步骤1.4.2至1.4.3.5系统总是处理两个平行板，然后重复连下两盘的所有步骤。
      1. 对于过滤前的降雨从CP 6-1和6-2移动MTP到WTP 4-1和5-1。从CP 7-1和7-2移动pH指示剂台胞证到WTP 4-2和5-2。
      2. 从CP 2-1和2-2与集电板一起传送滤板到WTP 4-3和5-3。从离心机搬迁的主要文化DWP 1-1和1-2到4-4的WTP和5-4。
      3. 准备分析模块。
         注:请从尖端存储（位置2-1〜2-4）200微升提示。为了降低消耗品，使用相同的尖部 - 组为第1步.4.3.1。
         1. 转移180微升主培养上清液到过滤板上。从主培养物上清液吸出150微升并分配50微升到MTP沉淀过滤之前和100微升至pH指示剂板上。
            注:pH的确定是不必要的;然而，加入各孔12.5毫升甲基红指示剂（50毫克在50ml乙醇中）与一个多步骤移液器之后它表示高酸生产菌株。这个信息可以是，以避免进一步的栽培， 例如 ，用于具有较高的缓冲液浓度的第二筛选生长抑制（在低pH值）是有用的。此外，低pH值还可能诱发车生产，以保护免受酸性环境的小区。
         2. 重复步骤1.4.3.1对于第二主培养板。选用一个新鲜尖集。
         3. 移动过滤板的离心机，并从工作表中删除所有其他板块回自己的家的位置在carous埃尔。
         4. 重复这些步骤1.4.2.1到1.4.3.3对于第三和第四主培养板。
         5. 做笔记的发酵液，其中展示的主要培养板离心后沉降下降，当他们被转移回转盘（粘度控制）的。
5. 96孔过滤完整细胞去除（任务2 图1）
   注意:为了确保从粘性发酵肉汤的过滤步骤包括在筛选细胞去除。
   1. 离心过滤板在3000 XG 10分钟，在20°C，并把他们带回自己的转盘位置。
   2. 制备凝胶过滤板。
      1. 移动从转盘到离心机和自旋的平衡凝胶过滤板在1000 xg离心2分钟，在20℃。
      2. 从离心机传送凝胶过滤板，以WTP 4-1〜44。
      3. 移动清新凝胶- 过滤收集板从CP（3-1〜3-4），以WTP（5-1到5-4）。
      4. 转移平衡凝胶过滤板（WTP 4-1〜4-4），以新鲜集电板（5-1至5-4）。
      5. 清理除位置5-1和5-2工作台移动位置5-1到4-1的位置。
   3. 通过RM准备工作台处理滤液。
      注意:对于步骤1.5.3至1.6.3.5系统处理两个平行板和重复连下两盘的所有步骤。
      1. 移动从传送带（4-6和4-7）50微升提示，WTP 3-3和3-4。
      2. 转自CP 3-1 3-2过滤板到工作台（4-4和5-4）。
      3. 重新定位DWP（1:100稀释），用于从CP 4-1,4-2检测的葡萄糖消耗至WTP 4-2和5-1。
      4. 将第二降水MTP从CP 8-1和8-2过滤后的污水处理厂4-3和5-3。
      5. 从集电板提起过滤板S（WTP 4-4和5-4），并将其移动到WTP 3-1和3-2。
   4. 过滤后准备分析模块。为了减少消耗品，使用步骤1.5.4.1和1.5.4.3相同尖集。
      1. 采取50微升的提示和吸取滤液至DWP的10微升等分试样（1:100稀释）对葡萄糖的测定（葡萄糖消耗）。
      2. 吸移管35微升滤液至平衡凝胶过滤板的中心和50μl到一个用于沉淀的MTP中。
      3. 重复步骤1.5.4.1 1.5.4.2到了第二个过滤板。
      4. 移动至凝胶过滤板至离心机并从工作台移动所有其它板返回到转盘基准位置。
      5. 重复步骤1.5.3.1到1.5.4.4对于第三和第四滤板。
      6. 存储所有板材的背面在转盘注意一下高粘性上清液，通过在过滤板残差所示（高V后面在过滤步骤后iscosity控制）。缺乏滤液可导致在以下分析模块假阴性结果。
6. 通过96孔凝胶过滤的葡萄糖除去（任务3中图1）
   1. 离心凝胶过滤板在1000 xg离心20℃2分钟。
   2. 通过机械臂准备工作台处理凝胶滤液。
      1. 提供从转盘（5-3和5-4）50微升提示，WTP 3-3和3-4。
      2. 对凝胶过滤后剩余的葡萄糖测定移动两根台胞证自CP 9-1,9-2到WTP 4-1和5-1。
      3. 对于苯酚 - 硫酸 - 硫酸法提出两项台胞证由CP 8-5和8-6到4-2的WTP和5-2。
      4. 从离心机传送两层凝胶过滤板至WTP（4-3和5-3）。
      5. 解除从集电板（4-3和5-3）的凝胶过滤板和移动它们至WTP 3-1和3-2。
   3. 通过机械臂准备工作台处理凝胶滤液。
      注意:为了减少耗材，使用同样的技巧，设置步骤1.6.3.1 1.6.3.2和。
      1. 为了检测凝胶过滤（1:10稀释）后剩余的葡萄糖取50微升的技巧和25微升的DDH ₂ O（WTP 1-1）转移到一个新的中期计划。 DDH ₂ O的吸的20微升（WTP 1-1），5微升空气和5微升凝胶滤液，分装到同一板块。
      2. 对于苯酚 - 硫酸酸法吸管20微升凝胶滤液中期计划。
      3. 重复步骤1.6.3.1和1.6.3.2对于第二凝胶滤液板。
      4. 从工作台传输所有板块回到他们的传送带上的基准位置。
      5. 重复这些步骤1.6.2.1到1.6.3.4对于第三和第四凝胶过滤板。
7. 葡萄糖检测模块
   1. 通过机械臂准备工作台进行葡萄糖作为说。
      1. 从CP 4-1和4-4到5-1的WTP和5-4:重新定位DWP（100稀释1）。
      2. 将所有台胞证由CP 9-5和9-8到4-1的WTP和4-4。
      3. 以200微升技巧和吸液和分配的180微升十倍体积混合稀释。然后吸取50微升等分的中期计划。
      4. 重复步骤对所有四个DWPs 1.7.1.2和1.7.1.3（1:100稀释）。
      5. 取下工作台所有DWPs（5-1到5-4）。
   2. 准备工作台开始葡萄糖的测定。
      1. 对于其余的葡萄糖凝胶过滤转让从CP所有台胞证（9-1到9-4），以WTP（5-1到5-4）后的决心。
      2. 移动至葡萄糖的测定校正板 - 含有三次加入50μl下列葡萄糖浓度的（90，45，18，第9，4.5，1.8，0.9，0.45和0毫克/升） - 自CP 9-9至WTP 3- 3。
      3. 以200微升技巧和抽吸与W葡萄糖检测试剂混合的50微升TP 1-2，将启动首次试验。移动至中期计划进入培养箱（30℃以150rpm进行30分钟）。
      4. 设定的时间表与在板之间5分钟的延迟启动程序。
      5. 孵育30分钟后移动板从孵化器到MTP阅读器和记录吸光度在418和480纳米。
      6. 测量后移动板在旋转木马的位置。
8. 降水的制备
   注意:为了评估所述EPS生产之前和第一过滤步骤之后执行用2-丙醇上清的沉淀。此外，通过在第一纤维和薄片的观察评估在过滤器膜的聚合物的吸附，但不是在第二沉淀。
   注意:处理2-丙醇为易燃液体严格按照通风橱中。
   1. 删除所有沉淀板（CP 6-1到6-4和8-1到8-4）从传送带上。并添加手动加入150μl2-丙醇至每孔用12.5毫升多步移液管。
   2. 覆盖有硅帽垫所有中期计划，并在室温（RT）（以900rpm 10分钟）摇动。晃动，表明EPS生产后，目视观察纤维或片状形态。
9. 苯酚 - 硫酸 - 硫酸法
   注意:处理浓硫酸酸和苯酚在通风橱内。苯酚是一种腐蚀性和诱变剂。
   1. 对于苯酚 - 硫酸 - 硫酸法，从传送带上取下板（CP 8-5到8-8），并将它们放到液体处理系统（位置4-8）。包括用20微升不同葡萄糖浓度的校准板（10; 5; 2.5; 1; 0.5; 0.25; 0.1; 0.05 0克/升）在一式三份。
   2. 放置一个废物容器在位置1，在2位200微升尖端框和250毫升槽用110毫升苯酚-硫酸-酸（在冰上with18.3毫升苯酚新鲜制备的5％（重量/体积）的DDH ₂ O的91.7毫升浓:Sulfuric酸）在3位。
   3. 使用用300μl提示一个8通道移液器和转移180微升酚 - 硫酸酸成的所有板的每一行。
   4. 覆盖所有台胞证用盖子，通过摇动（以900rpm，室温下5分钟）将它们混合，并在显色反应烘箱中在80℃下孵育他们35分钟。在通风橱下冷却后，测量在480nm处的消光。
10. 车正上清液的选择（任务4在图1）
    1. EPS的生产的评价，选择从自动筛选该履行的至少两个的三个标准为阳性（粘度控制2.6.1和2.6.2，检测聚合物2.6.3，葡萄糖当量2.6.5）的那些菌株。传送从正命中剩余的滤液，以供进一步处理新的MTP中。
       注意:当所述板覆盖有可以将它们保存在-20℃下至少一周的铝密封膜。内的时间的Determina的需要被执行的碳水化合物指纹的灰。

2.碳水化合物指纹

注意:手动执行对碳水化合物指纹的所有步骤。

1. （ 图1中任务5）的正的上清液的凝胶过滤
   注:凝胶过滤是必要的，因为没有滤液从自动筛选左边。凝胶过滤用的降低净化效率超过35微升结果的量。
   1. 通过经由12.5毫升多步移液管分配150μl的乙酸铵缓冲液中至所有孔准备凝胶过滤板的平衡。
   2. 传送凝胶过滤板放入离心机（2000 xg离心2分钟，在20℃）。
   3. 重复步骤2.1.1，2.1.2和2.1.1再次。离心凝胶过滤板在1000 xg离心20℃在进一步使用前2分钟。
   4. 吸取35微升滤液进入凝胶过滤板的使用12通道50微升吸管的中心。
   5. 离心凝胶过滤板在1000 xg离心2分钟，在20℃，然后从集电板抬起。
   6. 水解前制备葡萄糖的测定:通过添加DDH ₂ O的45和5μl凝胶滤液用12通道50微升吸管执行1:10稀释并覆盖用硅酮帽垫的台胞证。
      注意:对于该聚合物的葡萄糖值的正确的确定，测量水解前的葡萄糖含量和从水解步骤后定量葡萄糖含量减去它。
   7. 水解前准备丙酮酸测定:采用了12通道200微升吸管95微升的DDH ₂ O的，转让5微升凝胶滤液加入到每口井进行1:20稀释，并用密封硅盖垫片的MTP 。
2. 96孔微水解（任务6在图1中）
   注:烧热温育烤箱（包括沙浴），以121℃至少1.5小时，使用前。一个特殊的夹紧装置的开发是为了避免在中小型水解步骤的蒸发。
   1. 取一个新的PCR板和转移20微升凝胶滤液用12通道50微升吸管。
      注意:三氟乙酸是腐蚀性酸和毒性。铵溶液具有腐蚀性。同时处理化学品只在通风橱中。
   2. 加入20μl的4M的三氟乙酸与1.25毫升多步移液管至每个孔。然后覆盖的PCR板与热塑性弹性体（TPE）帽垫，并放置在PCR板中的特殊夹紧装置。
   3. 经由反相夹紧装置十倍混合溶液。放在一个离心机和自旋将PCR板在2000×g离心2分钟以收集所有底部的液体。把PCR的板回夹紧装置并用螺丝固定在设备上。
   4. 放置在预加热的砂浴中担保夹紧装置和孵育在121℃90分钟。
   5. 从沙浴中取出夹紧装置，让它冷却下来RT。
   6. 卸下螺钉并再次在离心机中以2000 xg离心，以便收集在孔的底部的所有冷凝旋转2分钟，以防止除去帽垫的过程中交叉污染。
   7. 添加3.2％的氨水溶液将pH调节至大约8使用12通道200微升吸管。覆盖PCR板用TPE盖垫和用夹紧装置手动摇晃。
   8. 中和后离心PCR的板在2000 xg离心2分钟。
3. 高通量-1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ 图1中的任务7）碳水化合物（HT-PMP）-derivatization
   1. 转移25微升中和的水解产物中一个新鲜的PCR板使用12通道50微升吸管。
      注意:取试样后，检查neutr经由与1.25毫升多步骤移液器加入12.5微升酚红指示剂（在5ml 20％乙醇0.05克酚红）中的水解板剩余液体虚拟。不变成粉红色（pH 8）中所有的孔不正确衍生化。
   2. 添加75微升衍生试剂混合（125毫克PMP 7毫升甲醇，3.06毫升DDH ₂ O的，和438微升3.2％的硫酸铵溶液）并盖上一个TPE帽垫板。
   3. 在2000 XG在夹紧装置离心机在板摇晃的PCR板后2分钟以积累在底部的所有液体。
   4. 用于衍生化的地方将PCR板在PCR-循环仪在70℃下为100分钟，随后冷却至20℃。
   5. 使用12通道50微升吸管转移20微升等分试样到新的MTP中。然后用一个12通道200微升吸管并添加130微升19.23毫乙酸（0.962毫升1M乙酸+49.038毫升DDH ₂ O的）到每一行。直接通过aspirat混合ING和分配（最少6次）和所有的液体，具有MTP集电板转移到一个0.2微米的过滤器板。
   6. 离心机的板（1,000×g离心5分钟），取出过滤板，密封件用硅酮帽垫的MTP和放置MTP入UHPLC-UV-ESI-MS为碳水化合物指纹¹⁴的确定。
4. 的葡萄糖测定法的准备
   1. 通过加入DDH ₂ O的45微升和使用12通道50微升吸管5微升中和的水解产物进行1:10稀释并覆盖用硅酮帽垫的台胞证。添加三次加入50μl的不同葡萄糖标准（500，250，100，50，25，10，5，2.5和0μM）至用于校准一个新的MTP中。
   2. 添加使用12通道50微升吸管葡萄糖测定试剂混合（配方step1.2.3）的50微升。然后盖上硅帽垫的平板上，在30℃和400rpm的转速在一个MTP培养箱30分钟孵育。
   3. 孵育后直接使在一个MTP阅读器在一个MTP-读数器在418和480nm处读取吸光度。用于葡萄糖浓度的计算执行线性校正在步骤2.6.4进行。
5. 在丙酮酸法的制备
   1. 使用12通道200微升吸管执行1:20稀释。添加95微升DDH ₂ O的和中和的水解产物转移5μl的每个孔中。盖上盖子硅垫MTP。
   2. 加入100μl丙酮酸测定试剂混合（3毫升1mM的的N - （羧甲基氨基羰基）-4.4'双（二甲氨基） -二苯胺钠盐（DA-64），300微升10毫焦磷酸硫胺素，60微升100毫氯化镁六水合物，2.4毫升500mM的磷酸钾河豚（pH为5.7），30微升100单位丙酮酸氧化酶，12微升1000ù辣根过氧化物酶，并使用一个12信道200微升吸管24.19毫升DDH ₂ O的）。
   3. 盖上盖子硅垫上板次在37℃和150rpm下进行30分钟孵育。直接后727和540 nm的在MTP阅读器孵化测定吸光度。
6. 该自动筛选和碳水化合物指纹的所有结果评价。
   1. 注意到，展会的主要培养板已经离心分离并储存回转盘（粘度控制步骤1.4.1）下降后，这些沉淀样本。样品不显示沉淀形成为正（用于自动化的筛选准则1）。
   2. 注意到高粘性上清液，这是由残差在过滤板的过滤步骤（高粘度控制步骤1.5.4.6）之后指示的。缺乏滤液可导致假阴性结果在以下分析模块。即保持培养上清液在过滤井样品是正的（也是标准1自动筛选）。
   3. 直观地观察培养后的纤维或片状的形成。记笔记为TH就是指多糖。请评价无沉淀（ - ）;纤维或薄片的低沉淀用（+）和具有高沉淀（++）。此外，在第一经纤维和薄片的观察检测过滤器上的膜的聚合物的吸附，但不是在第二沉淀（标准2为自动筛选）。
   4. 用于葡萄糖浓度的计算执行线性校正。
      
      请点击此处查看这个方程的放大版本。
   5. 执行5至0.1克/升葡萄糖的线性校准（吸收过浓度）。葡萄糖相当于水解聚合物的计算和下面的参数评价:葡萄糖等价的:> 700毫克/升=阳性; 300-700毫克/升=推定阳性; <300毫克/ L =阴性EPS格式方面离子（用于自动化的筛选准则3）。
      
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   6. 量化与HT-PMP法测定所有的碳水化合物。总结所有的数量和评估如下:> 300毫克/升（阳性）; 150-300毫克/升（推定的正）和<150毫克/升（负）。
   7. 对于丙酮酸浓度的计算执行线性校正（100，50，25，10，5，2.5％，1，0.5和0μM）。为了排除在上清液中余下的丙酮酸，纠正经水解之前丙酮酸含量水解后丙酮酸含量。
      
      请点击此处查看该方程组的一台放大版离子。

结果

酚-硫酸-酸法的验证表明具有0.9998（ 表2）测定（R 2）的一个系数良好的结果。为5g / L的浓度变化（CV）的系数和准确性表现出与用于与5.3％（CV）和6.1％的误差的0.25克/升标准1.8％和2.2％的误差，但较低的性能良好的性能（偏压）。

测定丙酮酸的测定校正曲线（使用和不使用矩阵）的系数在150μM（ 表3）的校准范围均> 0.9999。变化（CV）为最高和最低校正水平的系数<4.6％，准确度表现在整个校准范围非常不错的表现小于3.9％的误差。因此，从水解步骤中的矩阵显示在酶测定没有影响，这是因此能够向测定值丙酮酸URE水解前后。

表4示出了作为与筛选平台成功确定了三个示例性新菌株的详细结果。表中的左侧部分显示与粘度的形成，聚合物生产及葡萄糖等效从中被用作详细碳水化合物指纹分析评价参数总水解自动筛选模块的结果。基于校准糖以及未知糖，二聚物和取代的碳水化合物指纹表中的右侧部分中给出。通过使用此信息的单体组成可以计算出，并与已知的聚合物结构相比较。此外，可以执行用于有趣的单体组合物和稀有碳水化合物靶向筛选。

微观的高性能规模水解和HT-PMP-衍生在我们以前的工作¹⁴进行了论证。此外，凝胶过滤和各种属碳水化合物指纹的验证已在另一出版物⁶所述。总之，筛选平台，其模块化结构可以很容易地进行修改和适应用户的个人要求。该平台的自动筛选使得可以通过一个八倍更高，并给出可靠的结果。像丙酮酸的测定新颖的分析模块可以集成并与碳水化合物指纹分析组合他们提供关于所识别的车非常详细的信息。从而，为稍微修改和完全新颖的EPS变种搜索时的筛选平台是必不可少的。

图1:模块化的H型整体方案IGH通量外多糖筛选平台，自动筛选包括第3个任务。细菌在96孔板培养后，将细胞通过离心（任务1）和一个96孔过滤（任务2）中除去。然后，从生长培养基的其余单体糖通过96孔凝胶过滤（任务3）中除去。含样品的EPS在任务4.按评估筛选平台的碳水化合物指纹包含最后三个任务。从任务2的正命中的剩余的滤液提供了在任务6凝胶滤液在任务5水解后，将碳水化合物指纹可通过对HT-PMP方法分析（高通量1-苯基-3-甲基的基础-5-吡唑啉酮，任务7）。所有任务之后是不同的分析模块和/或粘度控制。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:机器人工作台设置的筛选平台液态机器人搬运工作表的布局显示:（A）机器人液体处理系统和（B）液体处理工作站。 （ 一 ）设置包括微孔板载体有两个仓位（仓位1-1到1-2），对于具有四个仓位（仓位2-1到2-4）以及与每个四个位置3微孔板运营商的一次性吸头的载体（职位3-1〜3-4，4-1，以4-4和5-1到5-4）。此外，还有具有五个酒店载体（1至5），每个七深孔板（DWP）和四个酒店载体（6-9）各为21微滴度板的存储传送带。安装在液体处理机器人的硬件是一个96通道移液器臂与一次性吸头和移动板/设备betwee机器人操纵（RM）使用n个工作台，存储旋转木马，在MTP阅读器，离心机和摇晃孵化器。 （B）的液体处理站装有液体处理臂和一个8通道300微升移液管，在1位废物容器，一个尖端适配器用300μl提示（位置2），一个高度适配器30与250毫升槽（位置3），以及五个高度适配器60为中期计划（位置4至8）。位置的编号是整个协议的简称。替代工作台也可以，如果有相当的设置可以使用。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:通过丙酮酸的测定法测定16市售聚合物的丙酮酸含量 。 1克/升的聚合物溶液之后小号被水解，中和，从1:10稀释进行的丙酮酸试验（N = 3）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4:模块化高通量筛选平台的流程图 。该自动筛选系统，它结合了不同的多糖检测模块:粘度的形成，聚合物生产及总糖含量的测定分析。第二部分为所有在第一部分中确定所选择的EPS生产企业的详细分析单糖。所有从自动筛选数据，并从通过UHPLC-ESI-MS碳水化合物指纹的数据被收集在一个数据库中并启用ALR的结构相关的变体的简单的识别伊迪称为EPS或EPS新颖，因此，有针对性的筛选。 请点击此处查看该图的放大版本。

主要步骤/分析模块	工作流程	观察/说明
菌株的培养	1毫升EPS- 介质 预培养48小时，30℃，1000转一 主培养48小时，30℃，1000转一	EPS生产
细胞去除/粘度	离心:4300 XG 30分钟	无颗粒=粘度增加=正
聚合物的检测: 降水	50微升苏pernatant + 150微升2-丙醇b 振摇在RT 10分钟，900转b	视觉:纤维及片状聚合物=正沉淀
细胞去除/高粘度	180主培养上清微升 离心:在3000 XG 10分钟 1.0微米玻璃纤维膜	没有过滤器的传球=高粘度=正
聚合物的检测: 降水	将50μl滤液+ 150微升2-丙醇b 振摇在RT 10分钟，900转b	视觉:纤维及片状聚合物=正沉淀
葡萄糖消耗: 葡萄糖测定	稀释1:100: 10微升滤液+ 990微升的DDH 2 O 50微升等分+ 50微升REAG耳鼻喉科混合 温育30分钟，在30℃150rpm下 测量418-480纳米	培养后剩余的葡萄糖
凝胶过滤	平衡: 3×150微升的 NH 4 -acetat缓冲液pH 5.6 在2000 xg离心2×2分钟 以1000 xg离心1×2分钟 凝胶过滤: 35微升滤液，在1000 XG 2分钟 洗涤: 3×150微升DDH 2 O的，在2000 XG 2分钟 75微升20％的乙醇对存储	聚合物纯化: 盐，丙酮酸，葡萄糖和其他糖单体从培养上清液去除
凝胶过滤后残留的葡萄糖 葡萄糖测定	稀释1:10: 25微升的DDH 2 O + 20微升的DDH 2 O和5微升滤液 + 50微升试剂混合孵育30分钟，在30℃，150rpm下 测量418-480纳米	从苯酚 - 硫酸 - 酸法凝胶过滤后残留的葡萄糖的减法
葡萄糖相当于: 苯酚-硫酸酸方法 C	20微升的凝胶滤液+180微升酚-硫酸-乙酸（30微升5％（在DDH重量/体积）苯酚2 O + 150微升浓H 2 SO 4（ρ= 1.84克/毫升）） 振摇5分钟，以900rpm 温育35分钟，在80℃下 在480nm处测量	葡萄糖相当于: Δ（苯酚 - 硫酸 - 酸值 - 凝胶过滤后剩余的葡萄糖） <300毫克/升的负 > 300和<700毫克/升推定正 > 700毫克/升的正
手动在无菌条件下（层流） 一处理。
乙易燃液体通风橱下手工处理。
ç苯酚-硫酸酸与品牌液体在通风橱内办理站（LHS）来处理。

表1:用机器人液体处理系统和液体处理站的自动预筛选的完成的工作流概述用于自动分析模块的所有参数。

线性度			LOD	LOQ
R 2 一	一坡	偏移	毫克/升	毫克/升
0.9998	0.0007	-0.021	50	100
标准		平均b	精密b	精度b
毫克/升		毫克/升	简历％	偏差（％误差）
5000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
的八次测量，6级葡萄糖校准一个均值为0.1至5克/升
B用与学生t检验（α= 0.05; N = 8）。
LOD:检出限，LOQ:定量限，CV:变异系数。

表2:酚-硫酸-酸法的验证用的液体处理站进行的。线性是基于六点校准来计算（N = 8）。均值，精度和两个示例性选择的葡萄糖浓度的精确度在这里给出。

	线性度			LOQ
	R 2 一	一坡	偏移	μM
无矩阵	0.99999	0.0223	-0.0019	1
1:10稀释矩阵	0.99999	0.0221	-0.0011	1
	标准	平均b	精密b	精度b
	μM	μM	简历％	偏差（％误差）
无矩阵	50	49.96	3.05	-0.09
	1	1.04	2.95	3.86
1:10稀释矩阵	50	49.98	0.44	-0.04
	1	1.00	4.58	0.33
三次测量，以6种浓度丙酮酸从1至50微米的校准一个均值。
B（N = 3）
LOQ:定量限，CV:变异系数。

表3:丙酮酸的测定有和无1:10稀释中和三氟酸-基质的验证两个六点校准（N = 3）有和没有进行矩阵影响的评价。均值，精度和有和没有1:10稀释的效应之两种示例性选择丙酮酸浓度的准确性进行了计算。

表4:与平台筛选三个示范性的菌株的结果数据从自动筛选和碳水化合物指纹收集请Ç舔这里下载该表作为Microsoft Excel文件。

糖类	吸收最大值[纳米]	吸收在480nm平均值±标准偏差		相对吸光度为葡萄糖[％]
的diutan胶	470	0.342	±0.010	187
结冷胶	472	0.334	±0.002	183
瓜尔豆胶	478	0.387	±0.017	212
阿拉伯树胶	476	0.393	±0.034	215
透明质酸	484	0.231	±0.011	126
梧桐胶	478	0.455	±0.023	249
魔芋胶	480	0.297	±0.009	163
松胶	480	0.337	±0.032	185
刺槐豆胶	478	0.354	±0.033	194
硬葡聚糖	484	0.168	±0.010	92
琥珀	482	0.168	±0.005	92
塔拉胶	480	0.318	±0.016	174
黄蓍	478	0.513	±0.003	281
韦兰胶	472	0.226	±0.016	124
木聚糖	472	0.567	±0.007	311
黄原胶	482	0.245	±0.021	134
葡萄糖	484	0.191	±0.014	100
SD:标准差

表5:结果作为通过苯酚-硫酸-酸法16市售聚合物和葡萄糖得到的最大吸收和吸收在16市售的聚合物（1克/升）的480纳米以及葡萄糖（1克/升）测量施加苯酚 - 硫酸酸的方法。计算相对于全部聚合物的葡萄糖的吸光度。

	标准	意思 一	高精度A	精度
	毫克/升	毫克/升	简历％	偏差（％误差）
1:10稀释	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1.41	-0.70
1:100稀释	4500	5026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4.55
B用与学生t检验（α= 0.05; N = 8）。
CV:变异系数。

表6:自动稀释的葡萄糖测定法的验证培养（1:100），之后，用于葡萄糖的测定的稀释和凝胶过滤（1:10）后进行了验证。两个葡萄糖浓度（N = 8）通过所述液体处理系统稀释并进行评价。均值，精密度和准确度进行了计算。

理论值葡萄糖	用硅胶帽盖垫			蒸发的测试（发现）
	意味着	高精度A	精度	意味着	高精度A	精度 </ STRONG>	蒸发
毫克/升	毫克/升	简历 ％	偏差（％误差）	毫克/升	简历 ％	偏差（％误差）	％错误
45.0	45.2	0.69	0.44	46.​​0	0.66	2.05	1.60
18.0	17.7	0.80	-1.68	18.0	0.72	-0.01	1.69
9	8.74	1.20	-2.98	8.92	0.81	-0.95	2.09
4.5	4.50	1.26	-0.04	4.58	1.57	1.76	1.80
1.8	1.85	0.74	2.90	2.01	2.82	11.6	8.48
0.9	1.03	1.43	14.1	1.16	3.52	28.3	12.4
一个 （N = 4）
CV:变异系数。

表7:中的覆盖和未覆盖的MTP六种不同的葡萄糖标准的蒸发效果的评价 （N = 4）中存储的转盘，在室温下3.5小时。蒸发的作用是通过使用揭露以及覆盖（硅垫）标准样品进行评价。平均值，精确度，准确度和以％误差的蒸发进行了计算。

之前凝胶过滤

	凝胶过滤后		凝胶过滤后残留的葡萄糖
	意味着	一个 SD		意味着	一个 SD
	毫克/升	毫克/升	毫克/升	毫克/升	％
1	8,647	110	259	121	3.00
2	5,108	56	116	37	2.27
3	2,014	12	50.8	14	2.52
4	1015	12	25.1	8.1	2.47
五	510	4.9	12.8	4.3	2.51
6	223	8.6	6.6	1.5	2.94
7	122	5.6	4.3	0.9	3.48
8	75	6	3.1	0.3	4.18
一 （8）
SD:标准差

表8:的凝胶过滤效率结果八个不同的葡萄糖标准之前和凝胶过滤后测定来评价凝胶过滤的效率。的意思是，以％凝胶过滤算出的标准偏差和剩余葡萄糖后。

讨论

多糖检测与酚-硫酸-硫酸法:不同的单糖通过展示使用这种方法⁹不同的最大吸收和摩尔消光系数。这导致聚合物，其含有不同量的几种糖不同的吸收最大值。吸收最大值的16不同市售聚合物不同波长在表5中给出。在聚合物中溶解（1克/升）在DDH ₂ O中，搅拌（150rpm）下过夜，并用苯酚-硫酸-酸法测定。的diutan胶表现出最低的最大吸收在470nm和硬葡聚糖和透明质酸最高在484纳米。基于这些结果被选择为480nm此筛选平台。的聚合物的相对吸光度是根据用1克/升葡萄糖（设定为100％）得到的吸光度计算出来的。最低的结果，获得与核菌葡聚糖和琥珀，都与92％。这是EXPected因为硬葡聚糖只含有葡萄糖和琥珀酰聚糖含有以7:3的比例的葡萄糖和半乳糖:1。商用聚合物具有干燥和不同灰分含量的不同的损失，这就是为什么没有达到〜110％的理论值的原因。木聚糖显示出与311％的最高相对吸光度。这样做的原因是，从木糖达到的高摩尔消光系数，由于更占优势呋喃糖形式。以0.1克/升葡萄糖的水平的定量极限为止，以及在一个浓度<0.05克/升的检测极限。然而，对于在筛选阳性菌株的检测极限是更高大于0.7克/升，因此，该试验显示出良好的性能。为了得到可靠的结果，凝胶过滤后剩余的葡萄糖与葡萄糖的测定法来确定，该值是从由苯酚 - 硫酸 - 酸法的值中减去。

自动葡萄糖测定稀释:性能栽培（稀释1:100）之后的葡萄糖测定进行了研究。对于这一点，将10μl的上清液在深孔板经由十倍抽吸和分配180微升出该稀释的转移到990微升DDH ₂ O的和混合。第二个关键步骤是只有5从凝胶过滤后的葡萄糖测定中1:10稀释微升等分正确的移液。为了产生稀释25μl的DDH ₂ O的用50微升尖首先被转移，之后20微升的DDH ₂ O和5μl的凝胶滤液被一起吸出。这确保了尖端的更好除去5μl的等分试样。这两个稀释步骤通过葡萄糖测定各种葡萄糖标准进行了核实。对于两个示例性浓度，结果在表6中给出的1:100稀释的葡萄糖含量的测定后培养表明高精度用于与CV＆＃两种标准60; 1.2％。同时，对于更高的标准精度高达11.6（％误差）。然而，这是可忽略不计的葡萄糖测定仅代表培养后剩余的葡萄糖含量，因此，是不为聚合物检测重要。在1:10稀释为凝胶过滤后剩余的葡萄糖表现出非常可靠的结果与CV <1.4％和精确度<2.1％的误差。

考虑蒸发的:筛选需要从第一步骤到第一葡萄糖的测定3.5小时。为了找到答案，这个时间段是否有不封顶MTP存储的影响，50微升的葡萄糖检测校准标准进行储存，没有遮挡机器人传送带3.5小时。在校准范围（45到4.5毫克/升）的样品浓度几乎不增加。增加 - 引起的蒸发 - 低于2.1％和仅两个最低浓度（1.8和0.9毫克/升）则达到高达12.4％（ 表7）。

凝胶过滤:高含量的非代谢葡萄糖的血糖扰乱从水解聚合物的定量检测。因此，需要凝胶过滤步骤培养后，除去剩余的葡萄糖。此外，凝胶过滤净化含有盐和单体碳水化合物的化合物，更为比葡萄糖上清液中的聚合物，以减少在该单体的分析的分析的背景。在凝胶过滤步骤35微升滤液置于井的中心。用于凝胶过滤的自动化系统的稳健性的验证，从0.045 8校准标准高达9克/升葡萄糖被过滤（N = 8）。每一浓度的葡萄糖总是由初始值（ 表8）的95％以上的降低。在这样做时，凝胶过滤显示关于各种浓度的葡萄糖的非常好的结果。另外，剩余的葡萄糖后凝胶-Filtration也与一个葡萄糖的测定法测定，并从苯酚 - 硫酸 - 酸判定减去接收葡萄糖当量的正确量的水解聚合物。

丙酮酸的测定:首先，研究了在中和和稀释（1:10）从水解步骤TFA-矩阵是否与酶反应的干扰。因此，进行了完整的测定两次，一次用和一次性无基质和显示可靠的结果。最后，16市售聚合物的丙酮酸含量成功测量并在图3中示出，它通常已知掉那些16的聚合物的仅琥珀酰聚糖和黄原天然含有丙酮酸盐。随着我们的丙酮酸法这两种聚合物被正确识别。在硬葡聚糖，在显著量也检测Welan胶和木聚糖丙酮酸盐。总体而言，该方法的能力进行了验证和丙酮酸的测定小号howed高性能。它被证明是能够水解后，以检测在不同的聚合物丙酮酸盐。

碳水化合物指纹:执行中的自动筛查所有分析模块后，被选定为碳水化合物指纹图谱分析潜在的EPS生产商。对于这一点，被应用的几个标准:1）粘度的正观测离心后和/或之后过滤。 2）沉淀过滤前后。观察纤维薄片被评价为阳性。 3）从苯酚 - 硫酸 - 酸法葡萄糖等效值。值> 700毫克/升被评为积极，300和700毫克/升之间的值被评为公认的EPS生产商。当两个或三个标准被作为阳性评价，被选择用于进一步的碳水化合物指纹分析的菌株。该标准可以对EPS筛查（ 如低粘度EPS）的个人目的进行定制。我们的方法旨在寻找effici耳鼻喉科EPS生产商。当菌株只产生少量的EPS的搜索葡萄糖当量的评价极限应减少。

技术效益和未来的应用:该协议的一个有趣的特点是的步骤和不同的分析模块，模块化的特点。它们可以以不同的方式进行组合，调整至个体需要和新颖的模块可以容易地实现。此外，分析模块可以单独使用， 例如 ，在组合的水解模块对HT-PMP-衍生模块能够从在96-孔格式不同的聚合物溶液（1克/升）进行单体组合物的分析。为无需访问液体处理系统的完整筛选可以手动处理而不会在移液方案的任何改变的实验室。然而，使用液体处理系统增加了吞吐量高达768株（而不是192株如果screene手动D）每天。此处描述的协议能够为不同属的筛选，因此，对于大应变集合，以确定新的车生产者和分析其碳水化合物指纹在一个方法（ 图4）的筛选。此外，对于含有稀土糖，如岩藻糖，糖醛酸，甚至未知糖多糖靶向筛选可通过详细单糖分析进行。另外，在定义的比率不同的糖组合可以被检测出来。这使得已知的EPS或EPS新颖的结构相关的变种简单的识别。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2