Automatizzata Modular High Throughput Screening esopolisaccaride piattaforma Accoppiato con altamente sensibile Analisi Carboidrati impronte digitali

Riepilogo

We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.

Abstract

Molti microrganismi sono in grado di produrre e secernere esopolisaccaridi (EPS), che hanno importanti implicazioni in campo medico, applicazioni alimentari o nella sostituzione delle sostanze chimiche petro-based. Descriviamo una piattaforma analitica essere automatizzato in un sistema di gestione dei liquidi che permette l'analisi veloce e affidabile del tipo e la quantità di EPS prodotta da microrganismi. Esso consente all'utente di identificare nuovi produttori esopolisaccaride microbici naturali e di analizzare l'impronta digitale carboidrati dei corrispondenti polimeri entro un giorno in high throughput (HT). Utilizzando questa piattaforma, le collezioni di deformazione così come le biblioteche di varianti deformazione che potrebbero essere ottenuti in approcci di ingegneria possono essere sottoposti a screening. La piattaforma ha una configurazione modulare, che consente una separazione del protocollo in due parti principali. In primo luogo, vi è un sistema di screening automatizzato, che combina diversi moduli di rivelazione polisaccaride: un'analisi semi-quantitativa di viscositformazione y attraverso una fase di centrifugazione, l'analisi della formazione del polimero mediante precipitazione alcol e la determinazione del contenuto totale di carboidrati tramite una trasformazione fenolo-solforico-acido. Qui, è possibile allo schermo fino a 384 ceppi per ciclo. La seconda parte fornisce un'analisi monosaccaride dettagliata per tutti i produttori EPS selezionati identificati nella prima parte combinando due moduli fondamentali: l'analisi della composizione completa monomero tramite cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con ultravioletti e rilevazione trappola ionica ionizzazione elettrospray ( UHPLC-UV-ESI-MS) e la determinazione del piruvato come sostituente polimero (presenza di piruvato chetale) tramite ossidazione enzimatica che è accoppiato ad una formazione di colore. Tutti i moduli di analisi di questa piattaforma di screening possono essere combinati in modi diversi e regolati alle esigenze individuali. Inoltre, possono essere gestiti manualmente o eseguiti con un sistema di gestione dei liquidi. In tal modo, il PLA di screeningTForm consente una grande flessibilità per identificare vari EPS.

Introduzione

esopolisaccaridi microbici (EPS) sono un gruppo strutturalmente molto diversi di polimeri che soddisfano diverse funzioni biologiche. Di solito sono costruite delle unità di ripetizione complesse, che si distinguono per i diversi tipi di monomeri (zuccheri, derivati ​​da zucchero, acidi zucchero), i legami tra questi monomeri e le loro sostituzioni. La diversità strutturale di polisaccaridi microbici conferisce caratteristiche piuttosto diverse per i membri di questa classe molecola, che permette la loro applicazione in diversi settori, come il cibo ^1, cosmetici ^2,3, la costruzione della chimica ⁴ o il trattamento delle acque ^5. Per estendere ulteriormente il campo di applicazione di questi bio-based e tali polimeri sostenibili all'identificazione di nuovi polisaccaridi microbici naturali e l'ingegnerizzazione di varianti strutturali rappresenta approcci promettenti. In entrambi i casi, un metodo di screening rapido è richiesta per la scansione rapidamente un gran numero di ceppi microbici per theiR formazione polisaccaride, e di analizzare i loro prodotti. Pertanto, abbiamo recentemente sviluppato una piattaforma HT-proiezione 96 pozzetti per l'analisi della produzione polisaccaride microbica da isolati naturali o varianti di deformazione ingegnerizzati che comprende l'identificazione della composizione monomerica ^6.

Applicando questa piattaforma per un primo giro proiezione di ~ 500 isolati naturali ha permesso di identificare solo circa 10 al 20% dei ceppi isolati da poter produrre EPS (dati non mostrati). Ciò significa che il 80-90% dei ceppi analizzati non ha prodotto EPS alle condizioni applicate, e quindi un'ulteriore analisi dettagliata delle impronte carboidrati non era necessario. Poiché questo altamente complesse di identificazione della composizione monomerica è un processo che richiede tempo, in particolare per l'analisi dei dati, un metodo di pre-screening veloce per identificare i ceppi positivi nella produzione EPS, sarebbe aumentare drasticamente l'efficienza. Inoltre, i reagenti,materiali di consumo e tempo di misura a UHPLC-UV-ESI-MS sarebbero ridotti. Inoltre, i diversi moduli analitici, se da un lato rendere il metodo altamente affidabile, sono invece complicando la movimentazione manuale di più di due piastre a 96 pozzetti in parallelo, e come tale limitare la potenzialità del metodo. Per queste ragioni, abbiamo deciso di sviluppare una piattaforma di screening automatizzato. Pertanto, abbiamo combinato il formato modulare della tecnica carboidrati impronte esistente con un metodo di rilevamento rapido completamente automatizzato del tenore totale di zucchero, sulla base della misurazione di assorbanza.

Il metodo fenolo-solforico-acido rappresenta ancora il metodo di scelta per la rapida determinazione del contenuto totale di carboidrati di batteriche e vegetali polisaccaridi ^7,8. Questo metodo è stato descritto da Dubois et al. ⁹ e adattato per diverse applicazioni e dimensioni del campione, anche per piccole dimensioni in piastre da 96 pozzetti ^10,11. il pheMetodo nol-solforico-acido misura il contenuto totale di carboidrati di un valore, summating tutto monomerica, oligomerica e carboidrati polimerici dei campioni.

Tenendo conto di tali aspetti, la scelta di un mezzo di coltura adatto è essenziale applicare questo metodo. mezzi complessi contenenti oligomerica o composti di carboidrati polimerici come estratto di lievito potrebbero portare a un contenuto di polimero modificato e, pertanto, devono rigorosamente essere evitati. Inoltre, elevate quantità di zuccheri sono utilizzati come C-source per la coltivazione dei ceppi. Alti livelli di carboidrati rimanenti dal processo di coltivazione potrebbero interferire negativamente con la misurazione del contenuto di EPS.

Pertanto, si consiglia l'uso di zuccheri definiti e puri. Nei nostri esperimenti abbiamo usato il glucosio per la coltivazione delle cellule. Il glucosio rimane dopo la coltivazione è stata ridotta mediante un gel-filtrazione e fissata mediante un glucosio-test. Infine, il glucosio equivalentes dei polisaccaridi sono stati calcolati sottraendo glucosio rimanente dopo il gel-filtrazione dal contenuto totale di carboidrati che era stata rilevata con il metodo del fenolo-solforico-acido. Gel-filtrazione e glucosio-test in combinazione con il metodo di fenolo-solforico-acido assicurano risultati affidabili e sono in grado di essere il primo sistema di rilevamento, completamente automatizzato.

Due nuovi moduli analitici sono stati inclusi nella piattaforma di screening automatizzato per aumentare la quantità di informazioni dal sistema EPS rilevamento: la precipitazione e l'osservazione di un aumento della viscosità.

Molti diversi EPS - ad esempio succinoglycan, xantano e del colon acido ¹² - sono segnalati per essere modificato con un non-carboidrati piruvato chetale su posizioni di zucchero C4 e C6. Tali chetali piruvato (proprio come esteri succinil mezzo e acidi uronici) contribuiscono alla natura polianionica e quindi, al prope fisicaproprietā del polimero interagendo con ponti catione bivalente ^13. Al fine di identificare quei polimeri particolari determinazione del piruvato è stato stabilito come un altro modulo analitico aggiuntivo. Questo aumenta le informazioni sui sostituenti polisaccaridi e le loro potenziali proprietà macroscopiche.

Combinando tutti i moduli consente l'identificazione di diverse EPS e una determinazione rapida ed efficiente dei produttori EPS. Con questo approccio la piattaforma di screening potrebbe essere diviso in due parti principali (Figura 1). Entro la proiezione automatica (parte I) il flusso di lavoro avviene completamente automatizzato (Tabella 1) per preselezionare rapidamente le EPS ceppi produttori. L'analisi carboidrati impronte digitali (parte II) determina quantitativamente la composizione monomerica del EPS prodotti dai ceppi preselezionati. In tal modo, l'analisi dei dati è stato minimizzato per ottimizzare lo screening di grandi collezioni di deformazione. Questooffre la possibilità di analizzare 384 ceppi in una sola corsa di screening automatizzato e con due piste che sono possibili al giorno di 768 ceppi al giorno. Inoltre, l'analisi dei carboidrati fingerprint fornisce una panoramica ancora più dettagliata di tutti i EPS identificati. Ciò consente l'analisi diretta e l'identificazione di solo leggermente diverse varianti EPS o completamente nuovi rispetto alle strutture chimiche già descritte di EPS.

Protocollo

1. Screening automatizzato

Nota: Tutte le fasi di manipolazione dei liquidi vengono effettuate con un sistema di gestione dei liquidi robotico. La composizione del piano di lavoro del robot è presentato in Figura 2. Tutti i materiali di consumo sono memorizzati nel carosello stoccaggio, salvo diversa indicazione. Per tutto lo screening automatizzato passi un manipolatore robotico (RM) sposta i materiali di consumo, (piastra pozzo profondo (DWP); micropiastra titolo (MTP); polimerasi piastra di reazione a catena (PCR-plate) e così via) tra le posizioni carosello (CP ) e le posizioni piano di lavoro (WTP). Tutte le fasi pipetta sono eseguite con un 96-canale pipetta braccio, tranne se menzionato altrimenti. Tutte le fasi sono programmate e vengono eseguite automaticamente in formato a 96 pozzetti.

1. Strain coltivazione (Task 1 in figura 1)
   Nota: maneggiare l'inoculazione dei EPS putativi ceppi produttori e la sigillatura delle piastre di coltura in condizioni sterili (flusso laminare). la automatizzatoscreening rapido in grado di gestire quattro piastre a 96 pozzetti per corsa. Diversi ceppi di diversi generi sono stati già testati ^6.
   1. inoculare manualmente il pre-cultura (1 ml EPS-media in un DWP), con un replicatore 96 pin da una a 96 pozzetti stock di glicerolo piatto. Coprire la piastra con un film di sigillatura traspirante per evitare l'evaporazione e per consentire l'aerazione. Incubare a 30 ° C per 48 ore a 1.000 rpm in un MTP-shaker.
   2. Seminare principale-coltura (990 microlitri EPS-media in un DWP) trasferendo 10 ml di pre-coltura utilizzando 50 ul 12 canali multi-pipetta e incubare nelle stesse condizioni come il pre-coltura. Prendere una nota di tutti i ceppi che non crescono.
2. Preparazione del robot Piano di lavoro e il carosello bagagli
   1. Fornire tutti i consumabili elencati materiali e attrezzature nella posizione corretta nel carosello stoccaggio. Aggiungere 990 ml di acqua bidistillata (DDH ₂ O) in ciascun pozzetto della DWP per il 1: 100 diluizioni per °e glucosio-test (posizione carosello 4-1 a 4-4).
   2. Disporre un recipiente da 250 ml contenente 150 ml di DDH ₂ O alla posizione tavolo di lavoro (DAP) 11.
   3. Depositare un trogolo da 250 ml contenente 50 ml di glucosio-dosaggio reagenti-mix (4 ml 500 mm potassio fosfato (pH 5.7), 1,5 ml di 50 mM 2.2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) Acido -6-solfonico, 2 ml 100 U glucosio ossidasi, 10 ml 1.000 U perossidasi di rafano e 42.49 ml DDH ₂ O) a posizione WTP 1-2.
   4. Inserire due MTP F-bottom fittizi vuoti nella posizione WTP 3-1 e 3-2.
   5. Rimuovere la pellicola di tenuta traspirante, allocare le principali-culture nelle posizioni carosello (CP) 1-1 a 1-4 e avviare il programma robotico automatizzato.
3. Equilibrazione delle lastre di gel-filtrazione
   Nota: Le piastre di filtrazione di gel che vengono utilizzati durante questo screening possono essere riutilizzati. Per questo, lavare e centrifugare tre volte con 150 ml di DDH ₂ O a 2.000 xg per 2 minuti a 20 ° C. Successivamente, conservare a 4° C con 75 ml di etanolo al 20% e coprire con un tappetino tappo di silicone.
   1. Spostare il 250 ml di valle (CP 5-7) con 5 mM tampone di acetato di ammonio (pH 5,6) per il WTP 3-3.
   2. Trasferire le piastre di gel-filtrazione (CP 1-6, 1-7, 2-6 e 2-7) dalla giostra al WTPs 4-1 a 4-4.
   3. Aspirare 150 ml di tampone di acetato di ammonio con 200 microlitri suggerimenti e dispensare al centro di tutte le lastre di gel-filtrazione per il raggiungimento dell'equilibrio.
   4. Trasferire le piastre di gel-filtrazione nella centrifuga (2.000 xg per 2 minuti a 20 ° C).
   5. Trasferire le piastre di nuovo al piano di lavoro, ripetere la procedura 1.3.3, 1.3.4 e 1.3.3. Non ripetere la fase di centrifugazione per evitare la disidratazione delle piastre di gel-filtrazione. Conservare le piastre di gel-filtrazione equilibrati indietro entro la giostra.
4. La rimozione delle cellule tramite centrifugazione (Task 1 in figura 1)
   Nota: Al fine di garantire un fondo basso all'interno del metodo di screening, l'analisi delle cellule liberaEPS contenente surnatanti solo e rimuovere le cellule tramite centrifugazione dopo la coltivazione.
   1. Trasferire la principale coltura DWP dalla giostra (da 1-1 a 1-4) nella centrifuga (4.300 xg per 30 min a 20 ° C).
   2. Preparare il piano di lavoro tramite la RM per elaborare la coltura principale.
      Nota: Per la procedura 1.4.2 a 1.4.3.5 il sistema gestisce sempre due piastre in parallelo e poi si ripete tutti i passi con i prossimi due piastre.
      1. Per la precipitazione prima della filtrazione spostare il MTP dal CP 6-1 e 6-2 per WTP 4-1 e 5-1. Spostare i pH-indicatore MTP da CP 7-1 e 7-2 per WTP 4-2 e 5-2.
      2. Trasferire la piastra di filtraggio insieme con la piastra di raccolta dal CP 2-1 e 2-2 per WTP 4-3 e 5-3. Spostare il principale cultura DWP 1-1 e 1-2 dalla centrifuga a WTP 4-4 e 5-4.
      3. Preparare i moduli di analisi.
         Nota: Prendere 200 microlitri suggerimenti provenienti dallo stoccaggio punta (posizione 2-1 a 2-4). Al fine di ridurre i materiali di consumo, utilizzare la stessa punta-set per la fase 1.4.3.1.
         1. Trasferire 180 microlitri del supernatante principale coltura alla piastra di filtraggio. Aspirare 150 ml di surnatante principale cultura ed erogare 50 ml nel MTP per la precipitazione prima della filtrazione e 100 microlitri alla piastra pH indicatore.
            Nota: Il pH-determinazione non è essenziale; Tuttavia, dopo l'aggiunta di 12,5 ml di metile indicatore rosso (50 mg in 50 ml di etanolo) in ogni pozzetto con una pipetta multi-step indica ceppi che producono acido elevati. Questa informazione può essere utile per evitare l'inibizione della crescita (a pH basso) per ulteriori coltivazioni, ad esempio per una seconda proiezione con concentrazione del tampone superiore. Inoltre, il basso pH può anche indurre la produzione di EPS per proteggere la cella contro l'ambiente acido.
         2. Ripetere il passaggio 1.4.3.1 per il secondo piatto principale-cultura. Utilizzare una soffiata nuova serie.
         3. Spostare le piastre filtranti per la centrifuga e rimuovere tutti gli altri piatti dal piano di lavoro alle loro posizioni iniziali nel carousEL.
         4. Ripetere la 1.4.2.1 passaggi per 1.4.3.3 per la terza e quarta piastra principale coltura.
         5. Prendete nota di questi brodi di fermentazione, che mostrano diminuito sedimentazione dopo centrifugazione dei principali piastre di coltura, quando vengono ritrasferiti alla giostra (controllo della viscosità).
5. 96 pozzetti di filtrazione per la rimozione delle cellule completa (Task 2 nella figura 1)
   Nota: Per assicurare la rimozione delle cellule dal brodo di fermentazione viscoso una fase di filtrazione è incluso nello screening.
   1. Centrifugare le piastre di filtrazione a 3.000 xg per 10 min a 20 ° C e riportarli nella posizione iniziale giostra.
   2. Preparare le piastre di gel-filtrazione.
      1. Spostare le piastre di gel-filtrazione equilibrate dalla giostra alla centrifuga e centrifugare a 1000 xg per 2 minuti a 20 ° C.
      2. Trasferire le piastre di gel-filtrazione dalla centrifuga per WTP 4-1 a 44.
      3. Spostare il gel frescopiastre -filtrazione collettore da CP (3-1 a 3-4) a WTP (5-1 a 5-4).
      4. Trasferire le piastre di gel-filtrazione equilibrati (WTP 4-1 a 4-4) per le piastre del collettore freschi (5-1 a 5-4).
      5. Pulire il piano di lavoro, tranne le posizioni 5-1 e 5-2 e la posizione 5-1 passare alla posizione 4-1.
   3. Preparare il piano di lavoro tramite la RM per elaborare i filtrati.
      Nota: Per la procedura 1.5.3 a 1.6.3.5 il sistema gestisce due piastre in parallelo e ripete tutti i passi con i prossimi due piastre.
      1. Spostare 50 suggerimenti microlitri dalla giostra (4-6 e 4-7) per WTP 3-3 e 3-4.
      2. Trasferire le piastre filtranti da CP 3-1 a 3-2 sul piano di lavoro (4-4 e 5-4).
      3. Spostare il DWP (diluizione 1: 100) per il rilevamento del consumo di glucosio dal CP 4-1 e 4-2 per WTP 4-2 e 5-1.
      4. Spostare il MTP per il secondo precipitazioni dopo la filtrazione da CP 8-1 e 8-2 per WTP 4-3 e 5-3.
      5. Sollevare le piastre filtranti dalla piastra collettores (WTP 4-4 e 5-4) e spostarli WTP 3-1 e 3-2.
   4. Preparare i moduli di analisi dopo la filtrazione. Al fine di ridurre i materiali di consumo, utilizzare la stessa punta-set per i passi 1.5.4.1 e 1.5.4.3.
      1. Prendere 50 microlitri suggerimenti e pipettare un'aliquota 10 ml del filtrato al DWP (diluizione 1: 100) per il glucosio-test (consumo di glucosio).
      2. Pipettare 35 ml di filtrato al centro della piastra di gel-filtrazione equilibrato e 50 microlitri al MTP che viene utilizzato per la precipitazione.
      3. Ripetere i punti 1.5.4.1 a 1.5.4.2 per la seconda piastra di filtraggio.
      4. Spostare le piastre di gel-filtrazione per la centrifuga e spostare tutti gli altri piatti dal piano di lavoro torna alle posizioni iniziali della giostra.
      5. Ripetere i punti 1.5.3.1 a 1.5.4.4 per la piastra terzo e quarto filtrazione.
      6. Dopo memorizzazione di tutte le piastre indietro nella giostra prendere atto supernatanti altamente viscosi, come indicato dalla residui nella piastra filtro (alta vControllo iscosità dopo la fase di filtrazione). Una mancanza di filtrato può portare a risultati falsi negativi nei seguenti moduli analitici.
6. La rimozione del glucosio tramite 96 pozzetti Gel-filtrazione (Task 3 in figura 1)
   1. Centrifugare le piastre di gel-filtrazione a 1.000 xg per 2 minuti a 20 ° C.
   2. Preparare il piano di lavoro tramite il manipolatore robotico per elaborare i gel-filtrati.
      1. Fornire suggerimenti 50 microlitri dalla giostra (5-3 e 5-4) per WTP 3-3 e 3-4.
      2. Per la determinazione del glucosio rimanente dopo gel-filtrazione spostare due micropiastre da CP 9-1 e 9-2 per WTP 4-1 e 5-1.
      3. Per il metodo fenolo-solforico-acido spostare due MTP dal CP 8-5 e 8-6 per WTP 4-2 e 5-2.
      4. Trasferire due piastre di gel-filtrazione dalla centrifuga a WTP (4-3 e 5-3).
      5. Sollevare le piastre di gel-filtrazione dalla piastra di raccolta (4-3 e 5-3) e spostarli WTP 3-1 e 3-2.
   3. Preparare il piano di lavoro tramite il manipolatore robotico per elaborare i gel-filtrati.
      Nota: Al fine di ridurre i materiali di consumo, utilizzare la punta-set per passi 1.6.3.1 e 1.6.3.2 stesso.
      1. Per rilevare il glucosio rimane dopo gel-filtrazione (diluizione 1:10) prendere 50 punte microlitri e trasferire 25 ml di DDH ₂ O (WTP 1-1) per un MTP fresca. Aspirare 20 ml di DDH ₂ O (WTP 1-1), 5 microlitri di aria e 5 ml di gel filtrato ed erogare nello stesso piatto.
      2. Per il fenolo-acido solforico metodo pipetta 20 ml di gel filtrato al MTP.
      3. Ripetere i punti 1.6.3.1 e 1.6.3.2 per la seconda piastra di gel-filtrato.
      4. Trasferire tutte le piastre dal piano di lavoro di nuovo alle posizioni casa nella loro carosello.
      5. Ripetere la 1.6.2.1 passaggi per 1.6.3.4 per la piastra terzo e quarto gel filtrazione.
7. Moduli di glucosio-test
   1. Preparare il piano di lavoro tramite il manipolatore robotico per eseguire glucosio-asdire.
      1. Spostare il DWP (diluizione 1: 100) dal CP 4-1 e 4-4 per WTP 5-1 e 5-4.
      2. Spostare tutti MTP dal CP 9-5 e 9-8 per WTP 4-1 e 4-4.
      3. Prendere 200 punte microlitri e mescolare la diluizione da aspirare e dispensare dieci volte il volume di 180 microlitri. Pipettare quindi un'aliquota del 50 microlitri alla MTP.
      4. Ripetere i punti 1.7.1.2 e 1.7.1.3 per tutti e quattro DWPs (diluizione 1: 100).
      5. Rimuovere tutti DWPs (5-1 a 5-4) dal piano di lavoro.
   2. Preparare il piano di lavoro per avviare il glucosio-test.
      1. Per la determinazione del glucosio rimanente dopo il trasferimento gel filtrazione tutti micropiastre da CP (9-1 a 9-4) per WTP (5-1 a 5-4).
      2. Spostare la piastra di calibrazione di glucosio-test - contenente tre volte 50 ml di seguenti concentrazioni di glucosio (90, 45, 18, 9, 4.5, 1.8, 0.9, 0.45 e 0 mg / L) - da CP 9-9 a WTP 3- 3.
      3. Prendete 200 microlitri suggerimenti e aspirare 50 ml di glucosio-test reagente-mix da WTP 1-2, per iniziare il primo test. Spostare le micropiastre nell'incubatore (30 ° C a 150 rpm per 30 min).
      4. Impostare la pianificazione di tempo per avviare il programma con 5 minuti di ritardo tra le piastre.
      5. Dopo 30 min di incubazione spostare le piastre dal termostato alla MTP-reader e registrare l'assorbanza a 418 e 480 nm.
      6. Dopo la misurazione spostare le piastre nella posizione iniziale nel carosello.
8. Preparazione del Precipitation
   Nota: Per valutare la produzione EPS eseguire una precipitazione del surnatante con 2-propanolo, prima e dopo la prima fase di filtrazione. Inoltre, valutare l'adsorbimento del polimero sulla membrana filtrante dall'osservazione delle fibre e fiocchi nel primo, ma non nel secondo precipitazione.
   Attenzione: maneggiare 2-propanolo come un liquido infiammabile rigorosamente sotto una cappa aspirante.
   1. Rimuovere tutti i piatti di precipitazione (CP 6-1 a 6-4 e 8-1 a 8-4) dalla giostra. e aggiungeremanualmente 150 ml di 2-propanolo ad ogni pozzetto con una ml multi-step pipetta 12.5.
   2. Coprire tutte le MTP con un tappetino di silicone tappo e agitare a temperatura ambiente (RT) (10 min a 900 giri al minuto). Visivamente osservare in fibra o fiocco formazioni dopo l'agitazione che indicano la produzione di EPS.
9. Metodo di fenolo-solforico-acido
   Attenzione: maneggiare solforico-acido concentrato e fenolo sotto una cappa aspirante. Il fenolo è un agente corrosivo e mutageno.
   1. Per il metodo di fenolo-solforico-acido, rimuovere le piastre (CP 8-5 a 8-8) dalla giostra e metterli nel sistema di gestione dei liquidi (posizione 4 a 8). Includere la piastra di calibrazione con 20 ml di concentrazioni di glucosio diverse (10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05; 0 g / l) in triplicato.
   2. Collocare un contenitore di rifiuti in posizione 1, una scatola di punta 200 microlitri in posizione 2 e un trogolo 250 ml con 110 ml di fenolo-solforico-acido (preparata di fresco su ghiaccio with18.3 ml di fenolo 5% (w / v) in DDH ₂ O e 91,7 ml di conc. sL'acido ulfuric) in posizione 3.
   3. Utilizzare una pipetta a 8 canali con 300 microlitri suggerimenti e trasferire 180 ml di fenolo-solforico-acido in ogni fila di tutti i piatti.
   4. Coprire tutte micropiastre con coperchi, mescolarli agitando (5 min a 900 rpm, RT) e incubare per 35 min a 80 ° C in un forno per reazione colorimetrica. Dopo il raffreddamento sotto una cappa aspirante, misurare l'estinzione a 480 nm.
10. Selezione di EPS positivo sopranatanti (Compito 4 nella figura 1)
    1. Per la valutazione della produzione di EPS, selezionare quei ceppi dallo screening automatizzato che soddisfano almeno due dei tre criteri positivi (controllo della viscosità 2.6.1 e 2.6.2, il rilevamento di polimero 2.6.3, il glucosio equivalente 2.6.5). Trasferire le rimanenti filtrati dai risultati positivi in ​​un MTP per ulteriori elaborazioni.
       Nota: Quando le piastre sono ricoperte da una pellicola sigillante di alluminio possono essere conservati a -20 ° C per almeno una settimana. Entro quel tempo la Determinazione dell'impronta carboidrati deve essere eseguita.

2. Carboidrati impronte digitali

Nota: vengono eseguiti manualmente tutti i passaggi per l'impronta digitale di carboidrati.

1. Gel-filtrazione del surnatante positivo (Task 5 in figura 1)
   Nota: Gel-filtrazione è necessario in quanto non vi è filtrato lasciato dallo screening automatizzato. Gel-filtrazione con un volume superiore a 35 microlitri risultati in termini di efficienza di purificazione diminuito.
   1. Preparare equilibramento delle piastre di gel-filtrazione dispensando 150 ml di tampone di acetato di ammonio in tutti i pozzetti tramite ml multi-step pipetta 12.5.
   2. Trasferire la lastra di gel-filtrazione nella centrifuga (2.000 xg per 2 minuti a 20 ° C).
   3. Ripetere i punti 2.1.1, 2.1.2 e 2.1.1 di nuovo. Centrifugare la lastra di gel-filtrazione a 1.000 xg per 2 minuti a 20 ° C prima dell'uso ulteriore.
   4. Pipettare 35 ml di filtrato inil centro della piastra di gel-filtrazione con un 12-channel 50 microlitri pipetta.
   5. Centrifugare la lastra di gel-filtrazione a 1.000 xg per 2 minuti a 20 ° C e poi sollevarlo dalla piastra di raccolta.
   6. Preparare il glucosio-test prima di idrolisi: Eseguire una diluizione 1:10 con l'aggiunta di 45 ml di DDH ₂ O e 5 ml di gel filtrato con un microlitri pipetta a 12 canali 50 e coprire le MTP con un tappetino tappo di silicone.
      Nota: Per la corretta determinazione del valore di glucosio del polimero, misurare il contenuto di glucosio prima dell'idrolisi e sottrarre dal tenore di glucosio quantificato dopo la fase di idrolisi.
   7. Preparare la piruvato-test prima di idrolisi: Eseguire una diluizione 1:20 con un 12 canali 200 microlitri pipetta per aggiungere 95 ml di DDH ₂ O, trasferimento 5 ml di gel filtrato in ciascun pozzetto e sigillare la MTP con un tappetino tappo in silicone .
2. 96 pozzetti Micro Idrolisi (Task 6 in figura 1)
   Nota: Riscaldareil forno incubazione (compreso un bagno di sabbia) a 121 ° C per almeno 1,5 ore prima dell'uso. Un dispositivo di bloccaggio speciale è stato sviluppato per evitare l'evaporazione durante il piccolo passo di idrolisi in scala.
   1. Prendere una nuova PCR-piatto e trasferire 20 ml di gel filtrato con un microlitri pipetta a 12 canali 50.
      Attenzione: trifluoroacetico acido è un acido corrosivo e tossico. soluzione di ammonio è corrosivo. Gestire sia i prodotti chimici solo sotto una cappa aspirante.
   2. Aggiungere 20 ml di acido trifluoroacetico 4 M con un ml multi-step pipetta 1,25 a ciascun pozzetto. Poi coprire la PCR-piastra con un elastomero termoplastico (TPE) mat tappo e posizionare il PCR-piatto nel dispositivo di serraggio speciale.
   3. Mescolare le soluzioni tramite invertendo il dispositivo di bloccaggio dieci volte. Mettere la PCR-piastra in una centrifuga e centrifugare a 2000 xg per 2 minuti per raccogliere tutto il liquido sul fondo. Mettere la PCR-piastra posteriore per il dispositivo di bloccaggio e fissare il dispositivo con le viti.
   4. Posiziona ildispositivo di bloccaggio sicuro in bagno di sabbia preriscaldata e incubare per 90 min a 121 ° C.
   5. Rimuovere il dispositivo di bloccaggio del bagno di sabbia e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
   6. Rimuovere le viti e far girare nuovamente in una centrifuga a 2.000 xg per 2 minuti per raccogliere tutta la condensa sul fondo dei pozzetti e per evitare la contaminazione incrociata durante la rimozione del tappeto tappo.
   7. Aggiungere la soluzione di ammoniaca 3,2% per regolare il pH a circa. 8 utilizzando un 12-canali 200 microlitri pipetta. Coprire la PCR-piatto con un tappeto tappo TPE e agitare manualmente utilizzando il dispositivo di bloccaggio.
   8. Dopo la neutralizzazione centrifugare la PCR-piatto a 2.000 xg per 2 minuti.
3. High-throughput 1-fenil-3-metil-5-pirazolone (HT-PMP) -derivatization del carboidrati (Task 7 in figura 1)
   1. Trasferire 25 ml di idrolizzato neutralizzato in una PCR piastra fresca con una pipetta a 12 canali 50 microlitri.
      Nota: Dopo aver preso parte aliquota controllare la neutrlizzazione del liquido rimanente nella piastra di idrolisi mediante aggiunta di 12,5 microlitri indicatore rosso fenolo (0,05 g rosso fenolo in 5 ml di etanolo al 20%) con un ml multi-step pipetta 1.25. Tutti i pozzi che non si trasformano in colore rosa (pH 8) non sono derivatizzati correttamente.
   2. Aggiungere 75 ml di reagente derivatizzazione-mix (125 mg PMP, 7 ml di metanolo, 3,06 ml DDH ₂ O, e 438 ml soluzione di ammonio 3,2%) e coprire la piastra con un tappetino tappo TPE.
   3. Dopo aver agitato la PCR-piastra in centrifuga dispositivo di bloccaggio della piastra a 2.000 xg per 2 minuti per accumulare tutto il liquido sul fondo.
   4. Per posto derivatizzazione PCR-piastra in una PCR-cycler a 70 ° C per 100 minuti seguito da raffreddamento a 20 ° C.
   5. Trasferire un'aliquota di 20 microlitri in una nuova MTP utilizzando 12 canali 50 microlitri pipetta. Quindi utilizzare un 12 canali 200 microlitri pipetta e aggiungere 130 ml 19.23 mM acido acetico (0,962 ml 1 M di acido acetico + 49.038 ml DDH ₂ O) per ogni linea. Mescolare direttamente tramite aspiratzione e di erogazione (minimo sei volte) e trasferire tutto il liquido ad una piastra 0,2 micron filtro con una piastra MTP collettore.
   6. Centrifugare la piastra (1.000 xg per 5 min), rimuovere la piastra di filtraggio, sigillare la MTP con un tappetino tappo silicone e posizionare il MTP nel UHPLC-UV-ESI-MS per la determinazione dell'impronta carboidrati ^14.
4. Preparazione del glucosio-assay
   1. Eseguire una diluizione 1:10 con l'aggiunta di 45 ml di DDH ₂ O e 5 ml di idrolizzato neutralizzato utilizzando una microlitri pipetta a 12 canali 50 e coprire le MTP con un tappetino tappo di silicone. Aggiungere tre volte 50 ml di diversi standard di glucosio (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 e 0 pM) in un MTP utilizzato per la calibrazione.
   2. Aggiungere 50 ml di glucosio-test reagente-mix (ricetta step1.2.3) utilizzando un microlitri pipetta a 12 canali 50. Quindi coprire le piastre con una stuoia tappo silicio e incubare a 30 ° C e 400 rpm per 30 min in un MTP-incubatore.
   3. Subito dopo l'incubazione fare una assorbanza di leggere in un MTP-reader a 418 e 480 nm in un MTP-reader. Per il calcolo della concentrazione di glucosio eseguire una taratura lineare interpretato nel passaggio 2.6.4.
5. Preparazione del piruvato-assay
   1. Eseguire una diluizione 1:20 con un 12 canali 200 microlitri pipetta. Aggiungere 95 ml di DDH ₂ O e trasferire 5 ml di idrolizzato neutralizzato in ciascun pozzetto. Coprire il MTP con un tappetino tappo di silicone.
   2. Aggiungere 100 ml di piruvato-test reagente-mix (3 ml 1 mm n - (carboxymethylamino-carbonile) -4.4'-bis (dimetilammino) sale di sodio -diphenylamine (DA-64), 300 ml 10 mM tiamina pirofosfato, 60 ml 100 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 2,4 ml 500 mm potassio fosfato palla (pH 5.7), 30 ml 100 U piruvato ossidasi, 12 ml 1.000 U perossidasi di rafano e 24.19 ml DDH ₂ O) utilizzando un 12 canali 200 microlitri pipetta.
   3. Coprire le piastre con un tappo in silicone opaco unnd incubare a 37 ° C e 150 rpm per 30 min. Subito dopo la misura di incubazione assorbanza in un MTP-reader a 727 e 540 nm.
6. La valutazione di tutti i risultati dello screening automatizzato e la Carboidrati impronte digitali.
   1. Prendete nota di quei campioni che mostrano diminuiti sedimentazione dopo le principali piastre di coltura sono stati centrifugati e conservati di nuovo alla giostra (fase di controllo della viscosità 1.4.1). I campioni che non presentano la formazione di pellet sono positivi (criterio 1 per lo screening automatizzato).
   2. Prendete nota di surnatanti altamente viscosi, che sono indicati dai residui nella piastra filtro dopo la fase di filtrazione (fase di controllo ad alta viscosità 1.5.4.6). Una mancanza di filtrato può portare ad un risultato falso negativo nei seguenti moduli analitici. I campioni che mantengono sovranatanti di coltura nel filtro-pozzi sono positivi (anche criterio 1 per lo screening automatizzato).
   3. Visivamente osservare la formazione di fibre o fiocco dopo l'incubazione. Prendere appunti come esimoIS indica polisaccaridi. Vota senza precipitazione con (-); bassa precipitazione di fibre o scaglie con (+) e alta precipitazione con (++). Inoltre, rilevare adsorbimento del polimero sulla membrana filtrante tramite osservazione di fibre e fiocchi nel primo, ma non nel secondo precipitazioni (criterio 2 per lo screening automatizzato).
   4. Eseguire una calibrazione lineare per il calcolo della concentrazione di glucosio.
      
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   5. Eseguire la calibrazione lineare (assorbimento più di concentrazione) tra 5 e 0,1 g / L di glucosio. Calcolo del glucosio equivalente dei polimeri idrolizzati e valutare dai seguenti parametri: glucosio equivalente:> 700 mg / L = positive; 300-700 mg / L = putative positivo; <300 mg / L = negativo nei confronti del formato EPSione (criterio 3 per lo screening automatizzato).
      
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   6. Quantificare tutti i carboidrati determinato con il metodo HT-PMP. Riassumere tutti i quantitativi e valutare come segue:> 300 mg / L (positivo); 150-300 mg / L (putative positivo) e <150 mg / L (negativo).
   7. Per il calcolo della concentrazione di piruvato eseguire una taratura lineare (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 e 0 pM). Per escludere il piruvato rimanente nel surnatante, correggere il contenuto piruvato dopo idrolisi con il contenuto piruvato prima dell'idrolisi.
      
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Risultati

La validazione del metodo fenolo-solforico-acido ha mostrato buoni risultati con un coefficiente di determinazione (r²) di 0.9998 (Tabella 2). Per il 5 g / L concentrazione del coefficiente di variazione (CV) e l'accuratezza hanno mostrato una buona prestazione con 1,8% ed errore 2,2%, ma la prestazione inferiore per l'0,25 g / L di serie con 5,3% (CV) ed errore 6,1% ( Pregiudizio).

I coefficienti di determinazione di entrambe le curve di calibrazione piruvato-assay (con o senza matrice) erano> 0.9999 in un range di calibrazione di 150 pM (Tabella 3). I coefficienti di variazione (CV) per il livello di calibrazione alta e più bassa erano <4,6% e la precisione ha mostrato una buona performance nel range di calibrazione completo di errore inferiore al 3,9%. Quindi, la matrice dalla fase di idrolisi non ha mostrato alcuna influenza sul saggio enzimatico, che è quindi in grado di measure piruvato prima e dopo idrolisi.

La Tabella 4 mostra i risultati dettagliati delle tre nuovi ceppi esemplari come individuati con successo con la piattaforma di screening. La parte sinistra della tabella mostra i risultati dei moduli di screening automatizzato di formazione viscosità, produzione di polimeri e glucosio equivalente dall'idrolisi totale che sono stati utilizzati come parametri di valutazione per dettagliata analisi carboidrati impronte digitali. L'impronta digitale carboidrati a base di zuccheri calibrate e zuccheri sconosciuti, dimeri e sostituenti sono indicati nella parte destra della tabella. Con l'utilizzo di questa informazione composizione monomerica può essere calcolata e confrontata con strutture polimeriche già note. Inoltre, uno screening mirato per composizioni monomeriche interessanti e carboidrati rare può essere eseguita.

Le elevate prestazioni del microidrolisi scala e la HT-PMP-derivatizzazione sono state dimostrate nel nostro precedente lavoro ^14. Inoltre, la validazione del gel-filtrazione e l'impronta carboidrati di vari generi sono stati descritti in un'altra pubblicazione ^6. In sintesi, la piattaforma di screening con la sua struttura modulare può essere facilmente modificato e adattato alle singole esigenze dell'utente. Lo screening automatizzato della piattaforma permette un otto volte superiore throughput e fornisce risultati affidabili. moduli analitici romanzo come la piruvato-test possono essere integrati e in combinazione con l'analisi dei carboidrati impronte digitali forniscono informazioni molto dettagliate sulle EPS identificati. In tal modo, la piattaforma di screening è essenziale per la ricerca di entrambe le varianti EPS leggermente modificati e completamente nuovi.

Figura 1: Schema generale della h modulareIGH-throughput piattaforma di screening esopolisaccaride. Lo screening automatizzato comprende i primi tre compiti. Dopo batteri vengono coltivati ​​in piastre a 96 pozzetti, le cellule vengono rimosse per centrifugazione (task 1) e una filtrazione a 96 pozzetti (operazione 2). Poi, i restanti zuccheri monomeriche dal supporto di crescita vengono rimossi attraverso un gel filtrazione a 96 pozzetti (task 3). L'EPS contenenti i campioni vengono valutati nel compito 4. L'impronta digitale di carboidrati della piattaforma di screening contiene gli ultimi tre compiti. Il filtrato rimanente dei successi positivi task 2 fornisce la base per il gel-filtrato in compito 5. Dopo idrolisi nel compito 6 l'impronta digitale di carboidrati può essere analizzato tramite il metodo HT-PMP (high-throughput 1-fenil-3-metil -5-pirazolone, compito 7). Tutte le attività sono seguite da diversi moduli di analisi e / o di controllo della viscosità. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: messa a punto piano di lavoro del robot per la piattaforma di screening Layout di entrambi i piani di lavoro di movimentazione del robot liquidi sono mostrati:. (A) sistema di gestione dei liquidi robotizzato e la stazione di trattamento (B) liquido. (A) Il setup è costituito da un vettore micropiastra con due posizioni (posizioni 1-1 a 1-2), un supporto per le punte monouso con quattro posizioni (posizioni 2-1 a 2-4) e tre vettori micropiastra con quattro posizioni ciascuno (posizioni 3-1 a 3-4, 4-1 a 4-4 e 5-1 a 5-4). Inoltre, vi è una giostra di archiviazione con cinque compagnie alberghiere (da 1 a 5) a testa per sette piatti fondi e (DWP) e quattro vettori alberghiere (6-9) ciascuno per 21 micro-titolazione-piatti. L'hardware installato sul robot gestione dei liquidi è un 96-canale pipetta a braccio per l'uso con punte monouso e un manipolatore robotico (RM) che si muove piatti / attrezzature between il piano di lavoro, la giostra di memoria, il MTP-reader, la centrifuga e lo scuotimento-incubatore. (B) La stazione di manipolazione liquida è dotata di un braccio di movimentazione liquido ed un 8 canali 300 microlitri pipetta, un contenitore per rifiuti in posizione 1, un adattatore punta con 300 punte microlitri (posizione 2), un adattatore altezza 30 con 250 ml trogolo (posizione 3) e cinque altezza adattatore 60 per micropiastre (posizione 4 a 8). La numerazione delle posizioni è indicato in questo protocollo. Piani di lavoro alternativi possono essere utilizzati anche se ci sono configurazioni equivalenti disponibili. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: contenuti piruvato di 16 polimeri disponibili in commercio determinati tramite piruvato-test. Dopo la 1 g / L soluzione polimericas sono stati idrolizzati e neutralizzati, la piruvato-test è stato eseguito da una diluizione 1:10 (n = 3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Diagramma di flusso della piattaforma high-throughput screening modulare. Il sistema automatizzato di screening, che combina diversi moduli di rivelazione polisaccaride: analisi della formazione di viscosità, la produzione di polimeri e determinazione del contenuto totale di carboidrati. La seconda parte fornisce un'analisi dettagliata monosaccaride per tutti i produttori EPS selezionati individuate nella prima parte. Tutti i dati di screening automatizzato ei dati dal fingerprint carboidrati tramite UHPLC-ESI-MS sono raccolti in un database e consentono la semplice identificazione di varianti strutturalmente correlati di alrEady noto EPS o nuovi EPS e quindi, uno screening mirato. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

/ Modulo analitico passo principale	Flusso di lavoro	Osservazione / Descrizione
La coltivazione dei ceppi	1 ml EPS medio-un Pre-coltura di 48 ore, 30 ° C, 1.000 rpm un Main-coltura di 48 ore, 30 ° C, 1.000 rpm un	Produzione di EPS
la rimozione delle cellule / viscosità	Centrifugazione: 30 min a 4.300 xg	No pellet = maggiore viscosità = positivo
Rilevazione di Polimero: Precipitazioni	50 ml supernatant + 150 ml 2-propanolo b Agitazione 10 minuti a temperatura ambiente e 900 giri al minuto b	Visivi: Fibre e fiocchi = precipitazioni positivo di polimero
la rimozione delle cellule / alta viscosità	180 ml di surnatante main-cultura Centrifugazione: 10 min a 3000 xg membrana in fibra di vetro 1.0 micron	Nessun filtro passa = alta viscosità = positivo
Rilevazione di Polimero: Precipitazioni	50 microlitri filtrato + 150 microlitri 2-propanolo b Agitazione 10 minuti a temperatura ambiente e 900 giri al minuto b	Visivi: Fibre e fiocchi = precipitazioni positivo di polimero
consumo di glucosio: Glucosio-assay	Diluizione 1: 100: 10 ml filtrato + 990 ml DDH 2 O 50 ml un'aliquota + 50 ml REAGent-mix Incubazione 30 min a 30 ° C 150 rpm Misura 418-480 nm	Rimanendo glucosio dopo la coltivazione
Gel-filtrazione	equilibrazione: 3 x 150 ml NH 4 -acetat tampone pH 5.6 2 x 2 min a 2000 xg 1 x 2 min a 1000 xg Gel-filtrazione: 35 filtrato ml, 2 min a 1000 xg Lavaggio: 3 x 150 ml DDH 2 O, 2 min a 2.000 xg 75 microlitri 20% di etanolo per immagazzinaggio	Polymer purificazione: La rimozione dei sali, piruvato, glucosio e altri monomeri di zucchero da coltivazione surnatante
Rimanendo glucosio dopo gel-filtrazione Glucosio-assay	Diluizione 1:10: 25 ml DDH 2 O + 20 ml DDH 2 O e 5 ml filtrato + 50 ml di reagente-mix incubazione 30 min a 30 ° C, 150 rpm Misura 418-480 nm	Sottrazione di residuo di glucosio dopo gel filtrazione dal metodo fenolo-solforico-acido
Glucosio equivalente: Metodo di fenolo-solforico-acido c	20 microlitri gel filtrato + 180 microlitri fenolo-solforico-acido (30 microlitri 5% (w / v) fenolo in DDH 2 O + 150 microlitri conc. H 2 SO 4 (ρ = 1,84 g / ml)) Agitazione 5 min a 900 giri Incubazione 35 min a 80 ° C Misura a 480 nm	Glucosio equivalente: Δ (valore fenolo-solforico-acido - residuo di glucosio dopo gel-filtrazione) <300 mg / L negativo > 300 e <700 mg / L putative positivo > 700 mg / L positive
una gestita manualmente in condizioni sterili (flusso laminare).
b Liquido infiammabile gestita manualmente sotto una cappa aspirante.
c fenolo-solforico-acido maneggiato con Handling marca Liquid Station (LHS) sotto una cappa aspirante.

Tabella 1:. Flusso di lavoro completo della preselezione automatica con il sistema di gestione dei liquidi robotico e la stazione di gestione dei liquidi Panoramica di tutti i parametri per i moduli di analisi automatizzate.

Linearità			LOD	LOQ
R² un	Slope un	Offset un	mg / L	mg / L
0.9998	0.0007	-0,021	50	100
Standard		media B	Precision B	Precisione B
mg / L		mg / L	CV%	Bias (errore%)
5.000		5.112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
una media di otto misurazioni, calibrazione con sei livelli di glucosio da 0,1 a 5 g / L
b Eseguita con t-test di Student (α = 0.05; n = 8).
LOD: limite di determinazione, LOQ: limite di quantificazione, CV: coefficiente di variazione.

Tabella 2:Validazione del metodo fenolo-solforico-acido è stata effettuata con la stazione di gestione dei liquidi. La linearità è stata calcolata sulla base di una calibrazione sei punti (n = 8). Media, la precisione e l'accuratezza delle due concentrazioni di glucosio in modo esemplare scelti sono dati qui.

	Linearità			LOQ
	R² un	Slope un	Offset un	micron
senza matrice	0,99999	0,0223	-0,0019	1
01:10 matrice diluito	0,99999	0,0221	-0,0011	1
	Standard	media B	Precision B	Precisione B
	micron	micron	CV%	Bias (errore%)
senza matrice	50	49.96	3.05	-0.09
	1	1.04	2.95	3.86
01:10 matrice diluito	50	49.98	0.44	-0.04
	1	1.00	4.58	0,33
una media di tre misurazioni, calibrazione con sei concentrazioni di piruvato da 1 a 50 mM.
b (n = 3)
LOQ: limite di quantificazione, CV: coefficiente di variazione.

Tabella 3:. Convalida della piruvato-dosaggio con e senza trifluoroacetico-acido-matrice neutralizzato 1:10 diluito Due calibrazioni sei punti (n = 3) con e senza stati eseguiti valutazione delle influenze matrice. Media, precisione ed accuratezza di due concentrazioni piruvato esemplare scelti con e senza effetti di una diluizione 1:10 sono stati calcolati.

Tabella 4:.. I risultati di tre ceppi esemplari schermati con la piattaforma dati raccolti dallo screening automatizzato e l'impronta digitale di carboidrati prega di cleccare qui per scaricare questa tabella come un file di Microsoft Excel.

Carboidrato	Assorbimento max [Nm]	Assorbimento a 480 nm media ± SD		Relativa assorbanza al glucosio [%]
gum Diutan	470	0,342	± 0,010	187
gellano	472	0,334	± 0,002	183
Gomma di Guar	478	0.387	± 0,017	212
Gummi araba	476	0,393	± 0,034	215
Acido ialuronico	484	0,231	± 0,011	126
La gomma karaya	478	0,455	± 0,023	249
konjac	480	0,297	± 0,009	163
Larice gomma	480	0.337	± 0,032	185
gomma di semi di carrube	478	0,354	± 0,033	194
scleroglucano	484	0.168	± 0,010	92
Succinoglycan	482	0.168	± 0,005	92
La gomma di tara	480	0,318	± 0,016	174
tragacanth	478	0,513	± 0,003	281
gum welan	472	0,226	± 0,016	124
Xylan	472	0,567	± 0,007	311
gomma xantano	482	0,245	± 0,021	134
Glucosio	484	0,191	± 0,014	100
SD: deviazione standard

Tabella 5:. Risultati ottenuta secondo il metodo fenolo solforico-acido per 16 polimeri disponibili in commercio e glucosio Il massimo di assorbimento e l'assorbimento a 480 nm di 16 polimeri disponibili in commercio (1 g / L) e glucosio (1 g / L ) sono stati misurati applicando il metodo fenolo-solforico-acido. L'assorbanza relativa al glucosio di tutti i polimeri è stata calcolata.

	Standard	Significare un	Precision un	Precisione una
	mg / L	mg / L	CV%	Bias (errore%)
diluizione 1:10	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1.41	-0.70
Diluizione 1: 100	4.500	5.026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4.55
b Eseguita con t-test di Student (α = 0.05; n = 8).
CV: coefficiente di variazione.

Tabella 6:. Validazione della diluizione automatizzata per il glucosio-assay La diluizione del glucosio-test dopo coltura (1: 100) e dopo gel filtrazione (1,10) sono stati convalidati. Due concentrazioni di glucosio (n = 8) sono stati diluiti con il sistema di gestione dei liquidi e valutati. Media, precisione e accuratezza sono stati calcolati.

Il valore di glucosio teorico	Coperto con mat tappo in silicone			Prova di evaporazione (scoperto)
	intendo un	Precision un	Precisione una	intendo un	Precision un	Precisione una </ Strong>	Evaporazione
mg / L	mg / L	CV %	Bias (errore%)	mg / L	CV %	Bias (errore%)	%errore
45.0	45.2	0.69	0.44	46.0	0.66	2.05	1.60
18,0	17,7	0,80	-1.68	18,0	0,72	-0.01	1.69
9.0	8.74	1.20	-2.98	8.92	0.81	-0.95	2.09
4.5	4.50	1.26	-0.04	4.58	1.57	1.76	1.80
1.8	1.85	0.74	2.90	2.01	2.82	11.6	8.48
0.9	1.03	1.43	14.1	1.16	3.52	28.3	12.4
a (n = 4)
CV: coefficiente di variazione.

Tabella 7:. Valutazione dell'effetto evaporazione MTP Sei differenti standard di glucosio coperti e scoperti (n = 4) sono stati memorizzati nel carosello per 3,5 ore a temperatura ambiente. L'effetto di evaporazione è stata valutata utilizzando scoperto e coperto (mat silicio) campioni standard. Media, precisione, accuratezza e l'evaporazione in errore% sono stati calcolati.

Prima di gel-filtrazione

	Dopo gel filtrazione		Rimanendo glucosio dopo gel-filtrazione
	intendo un	SD un		intendo un	SD un
	mg / L	mg / L	mg / L	mg / L	%
1	8.647	110	259	121	3.00
2	5.108	56	116	37	2.27
3	2.014	12	50,8	14	2.52
4	1.015	12	25.1	8.1	2.47
5	510	4.9	12.8	4.3	2.51
6	223	8.6	6.6	1.5	2.94
7	122	5.6	4.3	0.9	3.48
8	75	6.0	3.1	0.3	4.18
a (n = 8)
SD: deviazione standard

Tabella 8:. Risultati di efficienza gel filtrazione Otto diversi standard di glucosio sono stati determinati prima e dopo gel filtrazione per valutare l'efficienza del gel-filtrazione. Media, la deviazione standard ed il glucosio rimane dopo il gel-filtrazione in% sono stati calcolati.

Discussione

Rilevamento polisaccaride con il metodo del fenolo-solforico-acido: diversi monosaccaridi mostrano diversi massimi di assorbimento e coefficienti di estinzione molare utilizzando questo metodo ^9. Ciò si traduce in diversi massimi di assorbimento dei polimeri, che contengono molti zuccheri in quantità differenti. Le diverse lunghezze d'onda massimi di assorbimento per 16 diversi polimeri disponibili in commercio sono riportati in Tabella 5. I polimeri sono stati sciolti (1 g / l) in DDH ₂ O, agitazione (150 rpm) per una notte e misurata con l'acido metodo fenolo-solforico . gum Diutan ha mostrato la massimi di assorbimento più basso a 470 nm e l'acido ialuronico scleroglucano e il più alto a 484 nm. Sulla base di questi risultati 480 nm è stato scelto per questa piattaforma screening. L'assorbanza relativa dei polimeri è stata calcolata sulla base della assorbanza ottenuto con 1 g / L di glucosio (impostato come 100%). I risultati più bassi sono stati ottenuti con scleroglucano e succinoglycan, entrambi con 92%. Questo è stato expette perché scleroglucano contiene solo glucosio e succinoglycan contiene glucosio e galattosio in un rapporto di 7: 1. Entrambi i polimeri commerciali hanno differenti perdite di essiccazione e contenuto di ceneri differenti, questo è il motivo per cui non è stato raggiunto il valore teorico di ~ 110%. Xylan ha mostrato la più alta assorbanza relativa con 311%. La ragione di questo è l'elevato coefficiente di estinzione molare ottenuto da xilosio causa della forma furanosica più dominante. Ad un livello di 0,1 g / L di glucosio è stato raggiunto il limite di quantificazione, così come il limite di rilevamento ad una concentrazione <0,05 g / L. Tuttavia, il limite di rivelazione per i ceppi positivi screening è superiore a 0,7 g / L e di conseguenza, il saggio ha mostrato una buona prestazione. Al fine di ottenere risultati affidabili, glucosio rimanente dopo gel-filtrazione è stata determinata con glucosio-test e questo valore è stato sottratto dal valore dal metodo fenolo-solforico-acido.

Automatizzata di diluizione di glucosio-test: le prestazionidella determinazione del glucosio dopo coltivazione (diluizione 1: 100) è stata studiata. Per questo, 10 pl di surnatante sono stati trasferiti a 990 ml di DDH ₂ O in un piatto pozzo profondo e mescolati con dieci volte aspirare e dispensare 180 microlitri di questa diluizione. Il secondo passo fondamentale è stata la corretta dispensazione di soli 5 un'aliquota microlitri per la diluizione 1:10 dal glucosio-test dopo il gel-filtrazione. Per generare la diluizione 25 ml di DDH ₂ O trasferiti con un microlitri punta 50 prima, successiva 20 ml di DDH ₂ O e 5 microlitri gel filtrato sono stati aspirati insieme. Ciò garantisce una migliore rimozione della parte aliquota 5 microlitri dalla punta. Entrambi i passaggi di diluizione sono stati verificati con i vari standard di glucosio attraverso una glucosio-test. I risultati di due concentrazioni esemplari sono riportati nella Tabella 6 Il 1:. 100 diluizione per la determinazione del tenore di glucosio dopo coltivazione mostrato alta precisione per entrambi gli standard con un CV & #60; 1,2%. Allo stesso tempo, la precisione per lo standard elevato era fino a 11.6 (errore%). Tuttavia, questo è trascurabile la determinazione del glucosio rappresenta solo il tenore di glucosio rimanente dopo coltivazione e di conseguenza, non è importante per la rilevazione del polimero. La diluizione 1:10 per il glucosio rimane dopo gel-filtrazione ha mostrato risultati molto affidabili, con un CV <1,4% e una precisione

Esame di evaporazione: La proiezione richiede 3,5 ore dal primo passo per la prima glucosio-test. Al fine di scoprire, se questo lasso di tempo ha un influsso su storage MTP non ridotti, 50 ml di standard di calibrazione di glucosio-test sono stati conservati con e senza copertura per 3,5 ore nel carosello robot. Nell'intervallo di calibrazione (da 45 a 4,5 mg / L) la concentrazione del campione difficilmente aumentato. Un aumento - causata dall'evaporazione - era al di sotto del 2,1% e solo per le due concentrazioni più basse (1,8 e 0,9 mg / L) ha raggiunto fino a 12,4% ( Tabella 7).

Gel-filtrazione: Elevate quantità di glucosio non metabolizzato disturbano la determinazione quantitativa di glucosio dal polimero idrolizzato. Pertanto, una fase gel-filtrazione è stato richiesto di rimuovere il glucosio rimane dopo la coltivazione. Inoltre, il gel-filtrazione purifica il polimero contenente supernatante da sali e composti monomerici carboidrati, diverse da quelle di glucosio, per minimizzare lo sfondo analitico nell'analisi monomero. Nella fase gel filtrazione 35 ml di filtrato sono stati collocati al centro del pozzo. Per la convalida della robustezza del gel filtrazione nel sistema automatizzato, otto standard di calibrazione da 0,045 fino a 9 g / L di glucosio sono stati filtrati (n = 8). Il glucosio di ogni concentrazione è stata sempre ridotta di oltre il 95% del valore iniziale (Tabella 8). In tal modo, il gel-filtrazione mostrato ottimi risultati per diverse concentrazioni di glucosio. Inoltre, il rimanente glucosio dopo gel-filtration stata determinata anche con glucosio-test e sottratto dalla determinazione di fenolo-solforico-acido per ricevere la corretta quantità di glucosio equivalente per il polimero idrolizzato.

Piruvato-assay: Prima di tutto, è stato esaminato se l'neutralizzato e diluito (1,10) TFA-matrice dallo stadio di idrolisi interferisce con la reazione enzimatica. Pertanto, il dosaggio completo è stato eseguito due volte, una volta con e una volta senza matrice e ha mostrato risultati affidabili. Infine, il contenuto piruvato di 16 polimeri disponibili in commercio è stata misurata con successo ed è mostrata in Figura 3. E 'generalmente noto che su quei 16 polimeri solo succinoglycan e xanthan contengono naturalmente piruvato. Con la nostra piruvato-saggio di entrambi questi polimeri sono stati identificati correttamente. In scleroglucano, gomma welan e xylan piruvato è stata anche rilevata in quantità significative. In generale, la capacità del metodo è stato convalidato e la piruvato-assay showed un rendimento elevato. Essa ha dimostrato di essere in grado di rilevare piruvato in diversi polimeri dopo idrolisi.

impronte digitali Carboidrati: Dopo aver eseguito tutti i moduli di analisi di screening automatizzato, potenziali produttori EPS sono stati selezionati per l'analisi dei carboidrati delle impronte digitali. Per questo, sono stati applicati diversi criteri: 1) l'osservazione positiva della viscosità dopo centrifugazione e / o dopo la filtrazione. 2) Precipitazione prima e dopo la filtrazione. fibre osservato e fiocchi sono stati valutati come positivi. 3) il valore equivalente di glucosio dal metodo fenolo-solforico-acido. Valori> 700 mg / L sono stati classificati come positivi e valori tra 300 e 700 mg / l sono stati classificati come produttori EPS putativi. Quando due o tre criteri sono stati valutati come positivi, i ceppi sono stati selezionati per ulteriore analisi fingerprint carboidrati. I criteri possono essere personalizzati verso l'obiettivo individuale dello screening EPS (ad esempio EPS a bassa viscosità). Il nostro approccio volto a trovare efficient EPS produttori. Durante la ricerca di ceppi che producono solo piccole quantità di EPS limite valutazione del glucosio equivalente deve essere ridotta.

vantaggio tecnico e applicazioni future: Una caratteristica interessante di questo protocollo è il carattere modulare dei passi e dei diversi moduli di analisi. Essi possono essere combinati in vari modi, adattato alle esigenze individuali e nuovi moduli possono essere facilmente implementati. Inoltre, i moduli di analisi possono essere utilizzati separatamente, per esempio il modulo di idrolisi in combinazione con il modulo HT-PMP-derivatizzazione è in grado di eseguire una analisi della composizione monomerica da diverse soluzioni polimeriche (1 g / L) in formato a 96 pozzetti. Per i laboratori senza avere accesso ad un sistema di gestione dei liquidi lo screening completo può essere gestito manualmente senza alcuna modifica al regime di dispensazione. Tuttavia, utilizzando un sistema di gestione dei liquidi aumenta la velocità fino a 768 ceppi (invece di 192 ceppi se Screened manualmente) al giorno. Il protocollo descritto qui è capace di screening per generi diversi e quindi, per lo screening di grandi collezioni di deformazione per identificare nuovi produttori EPS e analizzare l'impronta digitale di carboidrati in un unico approccio (Figura 4). Inoltre, uno screening mirato per polisaccaridi contenenti zuccheri rare come fucosio, acidi uronici o anche zuccheri sconosciuti può essere eseguito tramite la dettagliata analisi monosaccaride. Inoltre, diverse combinazioni di zucchero in rapporti definiti possono essere rilevati. In questo modo la semplice identificazione di varianti strutturalmente correlate di EPS già noti e di nuovi EPS.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2