المستحثة الميكروبيولوجية الكالسيت الهطول وساطة من قبل<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

بكتيريا معينة قيد التحقيق هنا (س. pasteurii) هي فريدة من نوعها في قدرتها، في ظل الظروف المناسبة، للحث على التحلل من اليوريا (انحلال اليوريا) في البيئات التي تحدث بشكل طبيعي من خلال إفراز من اليورياز الانزيم. هذه عملية انحلال اليوريا، من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية، ويؤدي إلى تشكيل رواسب كربونات الكالسيوم. هذا هو المعروف باسم الميكروبيولوجية المستحثة الكالسيت الهطول (MICP). وترد تفاصيل بروتوكولات الثقافة المناسبة لMICP هنا. وأخيرا، أجريت تجارب التصور تحت أوضاع مختلفة من الفحص المجهري لفهم الجوانب المختلفة لعملية هطول الأمطار. تقنيات مثل المجهر الضوئي، كانوا يعملون المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والأشعة السينية صور الإلكترون الطيفي (XPS) لتحديد خصائص كيميائيا المنتج النهائي. وعلاوة على ذلك، وقد تجلى قدرة هذه الرواسب لتسد المسام داخل وسط مسامي الطبيعي من خلال تجربة نوعية حيث الإسفنجواستخدمت قضبان لتقليد المسام شبكة مع مجموعة من المقاييس طول. شريط اسفنجة مغموسة في مستنبت التي تحتوي على الخلايا البكتيرية يصلب بسبب انسداد المسام الناتجة عن عملية مستمرة من الترسيب الكيميائي. هذا الشريط الإسفنج تصلب يسلك قوة متفوقة بالمقارنة مع شريط الإسفنج السيطرة التي تصبح مضغوطة وتقلص في إطار العمل من الحمولة الخارجية تطبيقها، في حين أن شريط صلابة غير قادرة على دعم نفس الوزن مع تشوه قليلا.

Introduction

Sporosarcina pasteurii هو نوع من البكتيريا إيجابية الجرام قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئات شديدة القلوية (الرقم الهيدروجيني ~ 10) ¹ و هي واحدة من الأنواع البكتيرية التي يمكن أن تصبح عامل المسبب للظاهرة تسمى الميكروبيولوجية المستحثة الكالسيت الهطول (MICP) ^2-4. MICP هو عملية يقوم فيها هو فعل ترسيب كربونات الكالسيوم من قبل بعض الميكروبات تحت ظروف بيئية مناسبة. س. وقد تولى pasteurii أهمية في السنوات الأخيرة بسبب هويتها كعامل محتمل للحمل كميات كبيرة من MICP في ظل ظروف معينة. ينبع هذا الاحتمال من كون س. pasteurii لديه قدرة فريدة على إفراز كميات وفيرة من اليورياز الانزيم. ويعمل هذا الانزيم كعامل محفز، والترويج لتحلل المتسارع من اليوريا (أ تحدث بشكل طبيعي مركب كيميائي حيوي مع العرض على نطاق واسع وفيرة) في وجود جزيئات الماء. من خلال سلسلة من ردود الفعل، وهذه العملية في نهاية المطافلاي يؤدي إلى توليد أيونات الكربونات سالبة الشحنة. هذه الأيونات، في المقابل، تتفاعل مع الأيونات المعدنية مثل الكالسيوم إيجابية لتشكيل أخيرا رواسب من كربونات الكالسيوم (الكالسيت)؛ ومن هنا جاءت التسمية MICP ^5-9.

عرفت عملية MICP ودرس لعدة عقود ^10،11. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم التحقيق MICP لمجموعة واسعة من الهندسة والتطبيقات البيئية بما في ذلك من أسفل إلى أعلى البناء الأخضر ^12، وتعزيز الهياكل على نطاق واسع ^13،14 واحتجاز الكربون وتخزينه ^15،16.

على سبيل المثال، Cunnigham ¹⁷ آخرون. آل تصميم ارتفاع ضغط درجة حرارة معتدلة مفاعل تدفق تحتوي على الحجر الرملي الأساسية بيريا. تم تلقيح المفاعل مع البكتيريا س. fridgidimarina وتحت ظروف الضغط العالي حقن ثاني أكسيد الكربون فوق الحرجة، وتراكم هائل من الكتلة الحيوية داخل المجلد المساموقد لوحظ umes، مما أدى إلى تخفيض أكثر من 95٪ في نفاذية. Jonkers وتشلانجين ¹⁸ دراسة تأثير بعض سلالات خاصة من البكتيريا على عملية الشفاء الذاتي في الخرسانة. ومن المتوقع لتنشيط البكتيريا نائمة والتي بدورها تساعد القوة الهيكلية عبر MICP المياه الخارجية نقلها إلى شبكة المسام تدخل من خلال مسام السطح. توبلر ¹⁹ آخرون. ومقارنة النشاط حال اليوريا س pasteurii مع المياه الجوفية حال اليوريا مصغرة الأصليين في ظل ظروف لصالح MCIP على نطاق واسع، ووجدت أن س. pasteurii لديه القدرة مستمرة لتحسين الكالسيت هطول الأمطار حتى عندما تفتقر إلى مجتمعات السكان الأصليين النشاط اليورياز مسبق. مورتنسن ²⁰ et.al درسوا آثار العوامل الخارجية مثل نوع التربة، وتركيز كلوريد الأمونيوم، والملوحة، وتركيز الأكسجين وتحلل الخلايا على MICP. مظاهرتهم أن عملية المعالجة البيولوجية هي قوية جدا مع التركيبإلخ إلى تباين واسع في الفضاء المعلمة يجسد اللياقة البدنية من هذه العملية لمختلف التطبيقات العلاجية على نطاق واسع وفرت عملية تخصيب المناسبة لتعزيز البكتيريا والاضطلاع بها. فيليبس ²¹ آخرون. آل تصميم التجارب لدراسة التغيرات في نفاذية وقوة عمود الرمل والحجر الرملي الأساسية بعد حقنها مع س. الثقافات pasteurii. ووجد الباحثون أنه في حين انخفضت نفاذية 2-4 مرات في حين زادت قوة الكسر ثلاث مرات.

س pasteurii ودورها في MICP هم لا تزال غير مفهومة مواضيع البحث النشطة والعديد من القضايا المتصلة بآلية من الترسيب الكيميائي تماما. في ضوء ذلك، من المهم جدا أن يكون مجموعة من بروتوكولات موحدة متسقة لبدقة الثقافة مخزون المخصب بشكل مناسب من S. pasteurii لتحقيق MICP. هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول صارم يضمن تكرار واستنساخ. هذا أماهيصف nuscript بروتوكولات مفصلة لزراعة س. pasteurii ومناسبة إثراء مستنبت للحث على هطول الأمطار. ويجري التحقيق في العملية من خلال تقنيات مختلفة المجهرية مثل الضوئي والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والأشعة السينية صور الإلكترون الطيفي (XPS). محور المخطوطة على عملية MICP. إجراءات مثل SEM وسيمز، ويجري البروتوكولات القياسية راسخة، لا يتم وصفها بشكل منفصل.

Protocol

ملاحظة: تنفيذ البروتوكولات التجريبية بالترتيب الموضح أدناه. وناقش بروتوكول ثقافة البكتيرية في القسم 1 (انظر أيضا الشكل 1). ويصف الجزء 2 بروتوكول لإثراء الثقافة المتوسطة باستخدام إضافات خارجية. ويصف الجزء 3 بروتوكولات متعددة وضع المجهر. ويمكن قياس وزن كل عنصر على حدة باستخدام الميزان التحليلي. ويمكن قياس حجم كل الحل باستخدام اسطوانة الحجمي.

ملاحظة: البروتوكولات المناسبة للسلامة الأحيائية يجب اتباعها للأقسام 1 - 2. راجع مكتب سلامة المؤسسات للحصول على التفاصيل.

1. البكتيرية الثقافة

1. البكتيريا الثقافة - آجار لوحة إعداد المتوسطة
   1. تجميع المعدات والمكونات مثل أطباق بتري، قارورة، تريس، قاعدة، حمض الهيدروكلوريك، أجار، ميليبور المياه، ودرجة الحموضة متر etc.Sterilize جميع الحاويات عن طريق التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية قبل الاستخدام.
   2. إعداد 1 لتر من 0.13 M محلول مائي من تريس العازلة عن طريق خلط 15.75 ز تريس قاعدة مع 1 لتر من الماء ميليبور. لخفض مستوى الرقم الهيدروجيني من الحل الأصلي (درجة الحموضة 10.4) إضافة 2800 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك (تركيز 50٪). تحقق باستمرار باستخدام الرقم الهيدروجيني متر لضبط درجة الحموضة = 9.
   3. تقسيم حل العازلة 1 لتر إلى قسمين كما يلي:
      1. خذ 800 مل من هذا الحل. تقسيمها بالتساوي إلى قسمين من 400 مل لكل منهما. حل 8 ز (NH _{4) 2} SO ₄ إلى حل و16 ز خلاصة الخميرة إلى حل آخر واحد.
      2. خذ المتبقية (200 مل من) حل وتقسيمه مرة أخرى إلى قسمين من 100 مل لكل منهما. خلط 2 غرام (NH _{4) 2} SO ₄ إلى واحد. إضافة 4 ز خلاصة الخميرة و 4 ز أجار إلى أخرى.
   4. الأوتوكلاف 4 الحلول بشكل منفصل بعد التفاف قوارير منها في آل احباط والتمسك شريط الأوتوكلاف.
      ملاحظة: إذا تم استخدام وحدة الفوق الأوتوكلاف، يجب تعيين حجم 500 مل (درجة الحرارة والضغط الآليمحدد ically بوصفها وظيفة من وحدة التخزين).
   5. بعد اخراجها من الأوتوكلاف، وتعيين اثنين 400 ومل حلول جانبا لخطوة 1.3.1 (أدناه). مزج درجتين 100 ومل الحلول أن يكون لها حل 200 مل. صب الخليط في 10-12 أطباق بتري.
2. البكتيريا الثقافة - إعداد نموذج لوحة أجار
   1. إزالة الأوراق المالية للبكتيريا من الثلاجة (-80 درجة مئوية) والسماح لذوبان الجليد. بعد ذوبان الجليد بشكل صحيح، ضع الأسهم البكتيرية ولوحة أجار داخل غطاء السلامة الأحيائية.
   2. حدد micropipette من أصغر البعد المتاحة (0،5 حتي 10 ميكرولتر هو خيار جيد) لتصيب طرف مع الأسهم Sporosarcina pasteurii. خط لوحة أجار مع طرف micropipette. وضع لوحة آغار يشوبه داخل الحاضنة غير مهتزة في 31 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
   3. بعد 48 ساعة، وإزالة لوحة من الحاضنة وفحص البصر عن وجود المستعمرات واحد. إذا لم تكن هناك مستعمرات واحدة، ثم وضعه في تيانه الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
   4. كرر العملية حتى يتم الكشف عن المستعمرات واحد. لا يتجاوز 7 أيام من المحاكمة.
      ملاحظة: إذا المستعمرات واحد لا تظهر حتى بعد أسبوع، ثم يستنتج أن لم تتبع الخطوات بشكل صحيح ويجب تكرار العملية برمتها من الخطوة 1.
3. البكتيريا الثقافة - إعداد نموذج نهائي
   1. مزج درجتين 400 ومل حلول (عازلة تريس + (NH _{4) 2} SO ₄ و تريس عازلة + خلاصة الخميرة (1.5.1) معا للحصول على حل 800 مل. نقل 125 مل من هذا المحلول في قارورة.
   2. إجراء الفحص البصري للسطح لوحة أجار لتحديد المناطق ذات التركيز العالي من المستعمرات واحد. دفع بلطف وكسر واحدة من المستعمرات مع طرف micropipette.
   3. تراجع نفس micropipette طرف في مل قارورة 125 ويحرك جيدا لضمان عدد كاف من الخلايا للتكاثر قوي الحصول على نقلها. ضع قارورة في حاضنة تهتز في 150 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. بعد 2-3 أيام، وإزالة قارورة من الحاضنة.
4. البكتيريا الثقافة - نهائي عدد خلايا
   1. أداء التخفيف المتسلسل من الحل ثقافة غير المخفف باستخدام برنامج تلفزيوني للوصول الى التخفيف من لا يقل عن عشرة ملايين (10 ^-7) لضمان تظهر المستعمرات واحد للعد. رسم سبعة خطوط متوازية مسافة واحدة على واحدة من لوحات أجار.
      1. القيام بذلك عن طريق رسم خطوط عريضة على السطح السفلي من طبق بيتري، بارز بما يكفي لتكون مرئية من أعلى. إسقاط 3 قطرات صغيرة من حل غير المخفف في جزء واحد. إضافة 1 مل من محلول غير المخفف إلى 9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للحصول على تخفيف 01:10.
   2. اتخاذ قسامة صغيرة (~ 0.1 مل) من هذه محلول مخفف حديثا مع ماصة وإسقاط 3 المزيد من قطرات صغيرة على الجزء التالي. نقل محلول مخفف حديثا إلى قارورة جديدة ومزيد من المخفف عشر مرات (10X) من خلالوأضاف في برنامج تلفزيوني. هذا يهبط التخفيف إلى 10 ^-2 أو 1: 100.
      1. استخدام هذا 1: حل 100 في الجزء التالي. كرر هذا هو معالجة مع كميات صغيرة من الحلول المخفف الطازج عن طريق نقل تباعا لهم قوارير جديدة وتمييع مستمر عشرة أضعاف (10X) جنبا إلى جنب مع برنامج تلفزيوني للحصول على المزيد وعينات أكثر المخففة من 10 ^-3 أو 1: 1000 على طول الطريق وصولا الى 10 ^-7 أو 01:10 مليون في قطاع الماضي.
   3. أداء مستعمرة-تشكيل عدد حدة (كفو) لوحة لحساب عدد الخلايا الموجودة في لوحة أجار بعد احتضان لوحة لمدة 1-2 أيام في 31 درجة مئوية. وهذا يعطي مقياس كمي لعدد البكتريا في العينة غير مخفف.
      ملاحظة: يتم قياس قيمة كفو على أساس قدرة النظام أن تؤدي إلى المستعمرات وفقا للشروط المحددة من وسط الغذائي ودرجة الحرارة والوقت على افتراض أن كل مستعمرة منفصلة وتأسست من قبل خلية الميكروبية قابلة للحياة واحدة.
   4. ختمأطباق بتري مع الذات ختم فيلم وتخزين المتبقي العناصر في الثلاجة لاستخدامها في المستقبل.

2. بروتوكول لإثراء المغذيات لتسريع الهطول

1. نقل 9 مل من ثقافة السائل استعداد (خلايا + متوسطة) إلى عدة أنابيب الطرد المركزي معقمة، كل من 10 مل وحدة التخزين.
2. إعداد محلول 100 مل الأسهم لتخصيب خارجي يتكون من أربعة عناصر في التركيزات التالية في متوسطة جديدة: اليوريا: 2 غرام / لتر، وكلوريد الأمونيوم: 1 جم / لتر، الصوديوم بيكربونات: 212 ملغم / لتر، كلوريد الكالسيوم: 280 ملغم / L. بعناية قياس كل المكونات باستخدام الميزان التحليلي وتخلط جميع ولكن اليوريا مع المتوسط ​​الطازجة في كوب ومكان في الأوتوكلاف (121 درجة مئوية، و 15 رطل و 15 دقيقة).
   1. بعد الأوتوكلاف، مزيج الكمية المطلوبة من اليوريا (2 ملغ) مع 1 مل من المتوسط ​​الطازجة ويمر عبر حقنة مزودة 0.22 ميكرون فلتر حقنة لإتمام عملية التخصيب.
   2. إضافة 1مل من هذه الوسيلة التخصيب مع إضافات إلى أنابيب الطرد المركزي معقمة تحتوي على 9 مل من ثقافة السائل استعداد (خلايا + متوسطة) (راجع الخطوة 2.1).
      ملاحظة: من بين جميع هذه المكونات واليوريا كونها قابلة للتحلل في درجات حرارة مرتفعة، لا يمكن تعقيمها في الأوتوكلاف. وبالتالي، بعد أن تم تعقيمها المكونات الأخرى (121 درجة مئوية، و 15 رطل و 15 دقيقة)، وأضاف اليوريا آخر من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون.
3. دوامة كل أنبوب دقيق باستخدام وvortexer الميكانيكية. وضع السوائل التخصيب (خلايا + الإضافات + متوسطة) في حاضنة غير مهتزة عند 30 درجة مئوية. رصد جميع الوحدات بانتظام لبدء هطول الأمطار. باستخدام المجهر الضوئي، تبدأ الملاحظات المجهرية بمجرد الكشف عن بداية هطول الأمطار بالعين المجردة. وهذا عادة ما بين 30 - 36 ساعة بعد بدء التجارب.

3. بروتوكول متعدد وضع المجهر

1. نقل كمية صغيرة (~ 1 مل) من السائل إلى أعلى مستوى تعظم-أيون المجهري غرف نظام ساترة لأداء الملاحظات الأولية مع وضع حقل مشرق. لتبدأ، وتبدأ جميع الملاحظات مع أدنى التكبير (4X). الذي يوفر مساحة واسعة من التغطية والمعلومات ومن ثم العالمية حول توزيع الرواسب.
2. تحديد مناطق معينة مع كميات كبيرة من الامطار وتكبير (20X، 40X، 60X) عن طريق زيادة تدريجيا التكبير.
   ملاحظة: بما أنه من المستحيل حل صحيح الخلايا من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) تحت مشرق الميدان (بسبب مؤشرات الانكسار وثيقة جدا)، والتحول في الوضع على النقيض من المرحلة كلما كان ذلك ضروريا. في هذا الوضع، فقط الخطوط العريضة للأغشية الخلايا (وهي مرحلة مختلفة من الخلية الأكبر) واضحة، وبالتالي تمكين التمايز البصرية.
3. وأخيرا، وصمة عار بعض الدوائر مع لايف وصمة عار / الميت أن الأصباغ بشكل انتقائي المكونات الحية كما الخضراء بينما تلوين العناصر الميتة باللون الأحمر. الرجوع إلى البروتوكولات القياسية ^{28 <}/ سوب>.
4. التبديل على وضع الفلورسنت للتمييز بشكل صحيح بين المناطق الحمراء والخضراء. الأحمر (الأحمر مرشح مكعب مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر، مزدوج اللون مرآة من 595 نانومتر، والحاجز مرشح من 600-660 نانومتر) والأخضر (GFP طويل تمرير مرشح الأخضر مكعب مع الإثارة الطول الموجي من 440-480 نانومتر، مزدوج اللون مرآة وتستخدم 505 مرشح نانومتر، والحاجز من 510 نانومتر) مرشح مكعبات لتسهيل الميكروسكوب الفلورسنت.
5. مرة واحدة وقد تم جمع جميع البيانات متعددة واسطة، واختيار أفضل الصور وتراكب يدويا (brightfield الفردي، على النقيض من المرحلة والصور الفلورسنت) للحصول على أفضل النقيض من الممكن والوضوح.
6. أداء وزارة شؤون المرأة على العينات الصلبة المجففة لفهم هياكل الكريستال. هذا هو إجراء راسخة ومعيار ²² نفذ XPS لتحديد التوقيعات الكيميائية للمجموعات وظيفية (الكربونات). هذا هو إجراء راسخة والقياسية أيضا. ²³

النتائج

س pasteurii كونه alkaliphile ²⁴ يمكن البقاء على قيد الحياة ظروف قاسية نسبيا. عندما يتبع بروتوكول ثقافة المذكورة أعلاه، وس. ويزرع pasteurii داخل غرفة، والبكتيريا يؤدي إلى هطول الأمطار من كربونات الكالسيوم على مر الزمن (الشكل 2A). الش...

Discussion

خطوات حاسمة: تصف هذه المخطوطة في التفاصيل البروتوكولات لزراعة عينة قابلة للحياة س. pasteurii. مرة واحدة وقد اعدت الثقافة، لا بد من التخصيب بشكل مناسب. هذا هو خطوة رئيسية حيوية لنجاح التجربة لأن الفشل في توفير البيئة المناسبة الكيميائية يؤدي إلى أي جداول زمن?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium