Microbiologicamente indotta Calcite Precipitazioni Mediata da<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Riepilogo

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

La particolare batterio sotto inchiesta qui (S. pasteurii) è unico nella sua capacità, nelle giuste condizioni, di indurre l'idrolisi di urea (ureolysis) in ambienti presenti in natura attraverso la secrezione di un ureasi. Questo processo di ureolysis, attraverso una catena di reazioni chimiche, porta alla formazione di precipitati di carbonato di calcio. Questo è noto come Microbiologicamente Induced Calcite Precipitazioni (MICP). I protocolli di coltura adeguate per MICP sono descritti qui. Infine, esperimenti di visualizzazione in diverse modalità di microscopia sono state effettuate per capire i vari aspetti del processo di precipitazione. Tecniche come la microscopia ottica, microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettroni Spectroscopy (XPS) sono stati impiegati per caratterizzare chimicamente il prodotto finale. Inoltre, la capacità di questi precipitati ad ostruire i pori all'interno di un mezzo poroso naturale è stato dimostrato attraverso un esperimento qualitativa dove spugnabarre sono stati usati per simulare un poro-rete con una gamma di scale di lunghezza. Una barra spugna imbevuta nel terreno di coltura contenente le cellule batteriche indurisce l'intasamento dei suoi pori risultanti dal processo continuo di precipitazione chimica. Questa barra spugna indurito presenta una resistenza superiore rispetto a un bar spugna controllo che si comprime e spremuto sotto l'azione di un carico esterno applicato, mentre la barra indurito è in grado di sostenere lo stesso peso con poca deformazione.

Introduzione

Sporosarcina pasteurii è un batterio gram-positivo in grado di sopravvivere in ambienti fortemente alcaline (pH ~ 10) ¹ ed è una delle specie batteriche che possono diventare un agente causativo di un fenomeno chiamato Microbiologicamente Induced Calcite Precipitation (MICP) ^2-4. MICP è un processo in cui la precipitazione di carbonato di calcio è indotta da certi microbi in condizioni ambientali idonee. S. pasteurii ha assunto importanza negli ultimi anni a causa della sua identificazione come possibile agente per indurre un significativo volume di MICP in determinate condizioni. Questa possibilità deriva dal fatto che S. pasteurii ha la capacità unica di secernere grandi quantità di ureasi. Questo enzima agisce come un catalizzatore, promuovendo una lisi accelerata di urea (un composto biochimico naturale con fornitura diffusa e abbondante) in presenza di molecole di acqua. Attraverso una cascata di reazioni, questo processo finalely porta alla generazione di ioni carbonato carica negativa. Questi ioni, a sua volta, reagire con ioni metallici positivi come calcio per formare infine precipitati di carbonato di calcio (calcite); da qui l'etichetta MICP ^5-9.

Il processo di MICP è stato conosciuto e studiato per diversi decenni ^10,11. Nel corso degli ultimi anni, MICP è stato studiato per un'ampia gamma di applicazioni tecniche e ambientali, compresa bottom-up costruzione verde ^12, il miglioramento delle strutture di grandi dimensioni ^13,14 e il sequestro del carbonio e lo stoccaggio ^15,16.

Ad esempio, Cunnigham ¹⁷ et. Al progettato un reattore a flusso temperatura moderata ad alta pressione contenente un nucleo di arenaria Berea. Il reattore è stato inoculato con il batterio S. fridgidimarina e in condizioni di alta pressione carbonica supercritica iniezione anidride, un massiccio accumulo di biomassa all'interno del poro volUmes stato osservato, che ha portato ad una riduzione superiore al 95% in permeabilità. Jonkers e Schlangen ¹⁸ hanno studiato l'effetto di alcuni ceppi di batteri speciali sul processo di auto-guarigione in calcestruzzo. acqua esterna trasportata nella rete dei pori che entra attraverso i pori della superficie si prevede di attivare i batteri dormienti che a loro volta aiutano resistenza strutturale tramite MICP. Tobler ¹⁹ et al. hanno confrontato l'attività ureolytic di S. pasteurii con una falda indigena ureolytic microcosmo in condizioni che favoriscono MCIP su larga scala e ha scoperto che S. pasteurii ha una capacità costante di migliorare la calcite precipitazioni anche quando le comunità indigene mancava attività ureasica prima. Mortensen ²⁰ et.al hanno studiato gli effetti di fattori esterni come il tipo di suolo, la concentrazione di cloruro di ammonio, salinità, concentrazione di ossigeno e lisi delle cellule su MICP. La loro dimostrazione che il processo di trattamento biologico è molto robusto con respect ad un'ampia variazione nella spazio dei parametri sostanzia l'idoneità di questo processo per varie applicazioni di bonifica su larga scala di cui un processo di arricchimento adeguato per rinforzare i batteri è intrapresa. Phillips ²¹ et. al progettato esperimenti per studiare i cambiamenti nella permeabilità e la forza di una colonna di sabbia ed un nucleo di arenaria dopo l'iniezione con S. culture pasteurii. Essi hanno scoperto che, mentre la permeabilità diminuita 2 - 4 volte mentre la resistenza alla frattura è aumentato tre volte.

S. pasteurii e il suo ruolo nella MICP sono argomenti di ricerca attiva e di diverse questioni relative al meccanismo di precipitazione chimica non sono ancora pienamente compresi. Alla luce di questo, è molto importante avere un set di protocolli standardizzati coerenti con precisione la cultura un magazzino opportunamente arricchito di S. pasteurii per raggiungere MICP. Qui, descriviamo un protocollo rigoroso che assicuri ripetibilità e la riproducibilità. Questo manuscript descrive i protocolli dettagliati per la coltura di S. pasteurii ed opportunamente arricchendo il terreno di coltura per indurre la precipitazione. Il processo è indagato attraverso varie tecniche microscopiche, come ottica e microscopia elettronica a scansione (SEM) e X-Ray Photo-elettrone Spectroscopy (XPS). Il focus del manoscritto è sul processo di MICP. Procedure come SEM e SIMS, essendo protocolli standard consolidati, non sono descritte separatamente.

Protocollo

NOTA: Eseguire i protocolli sperimentali nell'ordine descritto di seguito. Il protocollo di coltura batterica è discusso nella sezione 1 (vedi anche figura 1). Sezione 2 descrive il protocollo per arricchire il terreno di coltura utilizzando additivi esterni. La sezione 3 descrive i protocolli per la microscopia multi-mode. I pesi di tutti i singoli componenti possono essere misurati con una bilancia analitica. Volume di ogni soluzione può essere misurata utilizzando un cilindro tarato.

NOTA: i protocolli di biosicurezza adeguato devono essere seguite per le sezioni 1 - 2. Consultare l'ufficio di sicurezza istituzionale per i dettagli.

1. coltura batterica

1. Batteri Cultura - Agar piastra Media Preparazione
   1. Assemblare attrezzature e gli ingredienti, come piastre di Petri, fiasco, Tris-base, HCl, agar, Millipore acqua, pH-metro etc.Sterilize tutti i contenitori in autoclave a 121 ° C prima dell'uso.
   2. Preparare 1 L di 0,13 soluzione acquosa M di Tris-buffer mescolando 15.75 g Tris-base con 1 L di acqua Millipore. Per abbassare il pH della soluzione originale (pH 10,4) aggiungere 2.800 ml di HCl (concentrazione 50%). Controllare continuamente con un pH-metro per impostare pH = 9.
   3. Dividere la soluzione tampone 1 L in due parti:
      1. Prendere 800 ml di questa soluzione. Dividerlo equamente in due parti di 400 ml ciascuna. Sciogliere 8 g (NH _{4) 2} SO ₄ con una soluzione e 16 g estratto di lievito per l'altra soluzione.
      2. Dai rimanenti (200 ml) soluzione e dividerla nuovamente in due parti di 100 ml ciascuna. Mescolare 2 g (NH _{4) 2} SO ₄ a uno. Aggiungere 4 g di estratto di lievito e 4 g di agar all'altro.
   4. Autoclave le 4 soluzioni separatamente, dopo aver terminato i rispettivi palloni in foglio di alluminio e attaccare nastri autoclave.
      NOTA: Se viene utilizzato un apparecchio da banco autoclave, il volume deve essere impostato a 500 ml (temperatura e pressione automatcamente specificato in funzione del volume).
   5. Dopo averli tolti dal autoclave, impostare i due 400 ml di soluzioni da parte per passo 1.3.1 (qui di seguito). Mescolare le due soluzioni 100 ml di una soluzione di 200 ml. Versare il composto in 10 - 12 capsule di Petri.
2. Batteri Cultura - piastra di agar Preparazione del campione
   1. Rimuovere il magazzino batterica dal congelatore (-80 ° C) e lasciarlo scongelare. Dopo lo scongelamento correttamente, posizionare il magazzino batterica e la piastra di agar all'interno di una cappa di biosicurezza.
   2. Selezionare la micropipetta di piccola dimensione disponibili (0,5-10 ml è una buona scelta) ad infestare la punta con il brodo pasteurii Sporosarcina. Streak una piastra di agar con la punta micropipetta. Posizionare la piastra di agar striato all'interno di un incubatore non agitazione a 31 ° C per 48 ore.
   3. Dopo 48 ore, rimuovere la piastra dal termostato di esaminare visivamente l'esistenza di singole colonie. Se non ci sono singole colonie, poi posto in tegli incubatrice per un altro 24 ore.
   4. Ripetere il processo fino a quando vengono rilevati singole colonie. Non superare i 7 giorni di prova.
      NOTA: Se singole colonie non appaiono anche dopo una settimana, poi si conclude che le misure non sono state seguite correttamente e l'intero processo deve essere ripetuto dal punto 1.
3. Batteri Cultura - campione finale Preparazione
   1. Mescolare le due soluzioni 400 ml (tampone Tris + (NH _{4) 2} SO ₄ e tampone Tris + estratto di lievito (1.5.1) insieme per ottenere una soluzione di 800 ml. Trasferire 125 ml di questa soluzione in un pallone.
   2. Eseguire un esame visivo della superficie della piastra di agar per identificare le regioni ad alta concentrazione di singole colonie. Delicatamente spingere e rompere una delle colonie con una punta micropipetta.
   3. Immergere la stessa punta micropipetta nel pallone 125 ml e mescolare accuratamente per garantire che il numero sufficiente di cellule per la moltiplicazione robusta vengono trasferite. Porre il pallone in un incubatore agitazione a 150 rpm, 30 ° C per 2 - 3 giorni. Dopo 2 - 3 giorni, togliere il pallone dal termostato.
4. Batteri Cultura - Finale Cell Count
   1. Eseguire diluizioni seriali della soluzione di coltura non diluito con PBS per ottenere una diluizione di almeno dieci milioni (10 ^-7) garantire appaiono singole colonie numerabili. Disegnare sette linee equidistanti parallele su una delle agar-piastre.
      1. Eseguire questa disegnando linee in grassetto sulla superficie inferiore del piatto Petri, abbastanza importante per essere visibile dall'alto. Goccia 3 piccole gocce di soluzione non diluita in un segmento. Aggiungere 1 ml di soluzione non diluita a 9 ml di tampone fosfato (PBS) per ottenere una diluizione 1:10.
   2. Prendere una piccola aliquota (~ 0,1 ml) di questa nuova soluzione diluita con una pipetta e rilasciare 3 più piccole gocce sul segmento successivo. Trasferire la nuova soluzione diluita in un pallone e ulteriormente diluita dieci volte (10x) byaggiungendo PBS. Questo fa scendere la diluizione di 10 ^-2 o 1: 100.
      1. Utilizzare questo 1: soluzione 100 nel segmento successivo. Ripetere questo si elabora con piccoli volumi di soluzioni diluite appena trasferendoli successivamente a nuovi flaconi e diluendo continuamente dieci volte (10x) in tandem con PBS per ottenere campioni sempre più diluite da 10 ^-3 o 1: 1.000 fino fino a 10 ^-7 o 1:10 milioni nell'ultimo segmento.
   3. Eseguire Colony-Forming count Unit (CFU) piastra per contare il numero di cellule presenti nella piastra di agar dopo incubazione la piastra per 1 - 2 giorni a 31 ° C. Questo dà una misura quantitativa della carica batterica nel campione non diluito.
      NOTA: Il valore CFU viene misurata in base alla capacità del sistema di dare origine a colonie nelle condizioni specifiche di mezzo nutriente, temperatura e tempo supponendo che ogni colonia è separata e fondata da una singola cellula microbica vitali.
   4. Focale piastre di Petri con autosigillante pellicola e conservare rimanendo elementi in frigorifero per un utilizzo futuro.

2. Il protocollo per l'arricchimento di nutrienti per accelerare Precipitazioni

1. Transfer 9 ml della coltura liquida preparata (cellule + medium) in diverse provette per centrifuga sterilizzati, ciascuno di 10 ml di volume.
2. Preparare una soluzione stock di arricchimento esterno costituito da quattro componenti nelle seguenti concentrazioni in mezzo fresco 100 ml: Urea: 2 g / L, cloruro di ammonio: 1 g / L, bicarbonato di sodio: 212 mg / L, cloruro di calcio: 280 mg / L. Misurare attentamente tutti gli ingredienti con una bilancia analitica e mescolare tutto, ma l'urea con terreno fresco in un bicchiere e posto in autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min).
   1. Dopo autoclave, mescolare la quantità necessaria di urea (2 mg) con 1 ml di mezzo fresco e passare attraverso una siringa con filtro a siringa da 0,22 micron per completare il processo di arricchimento.
   2. Aggiungere 1ml di questo terreno di arricchimento con additivi per le provette da centrifuga sterili contenenti 9 ml di coltura liquida preparata (cellule + media) (vedi punto 2.1).
      NOTA: Di tutti questi componenti, urea essendo degradabile a temperature elevate, non può essere sterilizzato in autoclave. Quindi, dopo gli altri componenti sono stati autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), l'urea viene aggiunto per ultimo attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron.
3. Vortex ogni provetta accuratamente con un vortex meccanico. Posizionare i liquidi arricchiti (cellule + additivi medie +) in un incubatore non agitazione a 30 ° C. Monitorare tutte le unità regolarmente per l'inizio di precipitazioni. Utilizzando un microscopio ottico, iniziare osservazioni al microscopio volta insorgenza di precipitazione viene rilevata ad occhio nudo. Questo è di solito tra 30 - 36 ore dopo l'inizio degli esperimenti.

3. Protocollo per Multi-mode Microscopia

1. Trasferire un piccolo volume (~ 1 ml) di fluido ad un alto magnificatione del sistema di microscopia coprioggetti-camerata per eseguire le osservazioni iniziali con modalità campo chiaro. Per cominciare, avviare tutte le osservazioni con l'ingrandimento più basso (4X). che fornisce un'ampia area di copertura e informazioni quindi globale sulla distribuzione di precipitati.
2. Selezionare aree particolari con volumi significativi di precipitazioni e zoom (20X, 40X, 60X) aumentando progressivamente l'ingrandimento.
   NOTA: Dal momento che è impossibile risolvere correttamente le cellule dalla sostanza extracellulare polimerico (EPS) in campo chiaro (a causa di molto vicino indici di rifrazione), attivare la modalità a contrasto di fase in caso di necessità. In questo modo, solo i contorni delle membrane cellulari (essendo una fase differente rispetto alla cella bulk) sono visibili, permettendo così differenziazione visiva.
3. Infine, macchiare alcune camere con Live macchia / Morto che tinge selettivamente le componenti in tensione, come verde, mentre la colorazione dei componenti morti in rosso. Fare riferimento a protocolli standard ^{28 <}/ Sup>.
4. Attivare la modalità fluorescente di distinguere correttamente tra le regioni rosse e verdi. Red (cubo filtro rosso con eccitazione lunghezza d'onda di 540-580 nm, dicroico specchio di 595 nm e Barriera filtro di 600-660 nm) e passaggio lungo verde (GFP cubo filtro verde con eccitazione lunghezza d'onda di 440-480 nm, dicroico specchio 505 filtro nm e Barriera di 510 cubi nm) di filtro sono utilizzati per facilitare il microscopio a fluorescenza.
5. Una volta che sono stati raccolti tutti i dati multi-mode, selezionare le migliori immagini e sovrapposizione manualmente (individuale campo chiaro, contrasto di fase e le immagini fluorescenti) per ottenere il miglior contrasto possibile e chiarezza.
6. Eseguire SEM sui campioni solidi secchi di capire strutture cristalline. Questa è una procedura ben consolidata e standard. ²² Eseguire XPS per identificare le firme chimiche dei gruppi funzionali (carbonati). Questa è una procedura ben consolidata e standard pure. ²³

Risultati

S. pasteurii essere un alkaliphile ²⁴ possono sopravvivere in condizioni relativamente difficili. Quando il protocollo cultura di cui sopra è seguita, e S. pasteurii è cresciuto all'interno di una camera, i batteri porta alla precipitazione di carbonato di calcio nel tempo (Figura 2A). Figura 2 (b) mostra un contrasto di fase ottica dell'immagine microscopica della popolazione cellulare batterica nel terreno di colt...

Discussione

Passi critici: Questo manoscritto descrive in dettaglio i protocolli per la coltura di un campione vitale di S. pasteurii. Una volta che la coltura è stato preparato, deve essere opportunamente arricchito. Questo è un passo chiave fondamentale per il successo dell'esperimento, perché un fallimento per fornire l'ambiente chimico adeguato porta a uno scale temporali molto lunghi di precipitazioni o di una completa mancanza della stessa. S. pasteurii è molto sensibile a divers...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium