Микробиологически Индуцированные кальцит Осадки опосредованная по<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Резюме

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Аннотация

Частности бактерия под следствием здесь (S. pasteurii) является уникальным по своей способности, при правильных условиях, чтобы вызвать гидролиз мочевины (ureolysis) в природных средах за счет секреции фермента уреазы. Этот процесс ureolysis, через цепь химических реакций, приводит к образованию карбоната кальция преципитатов. Это известно как микробиологически Индуцированные кальцита Осадки (MICP). Соответствующие протоколы культуры для MICP подробно описаны здесь. И, наконец, эксперименты визуализации при различных режимах микроскопии были выполнены, чтобы понять различные аспекты процесса осаждения. Такие методы, как оптической микроскопии, сканирующей электронной микроскопии (SEM) и X-Ray фото-электронной спектроскопии (XPS) были использованы для химически характеристики конечного продукта. Кроме того, способность этих выделений в закупоривает поры внутри естественной пористой среды была продемонстрирована с помощью качественного эксперимента, в котором губкабары были использованы для имитации порового сеть с диапазоном масштабов длины. Губка бар, смоченной в культуральной среде, содержащей бактериальные клетки затвердевает из-за засорения его пор в результате непрерывного процесса химического осаждения. Это закаленные губки бар обладает превосходной прочностью по сравнению с губкой панели управления, которая сжимается и выдавливается под действием приложенного внешней нагрузки, в то время как закаленные бар способен поддерживать одинаковый вес с небольшим количеством деформации.

Введение

Sporosarcina pasteurii является грамположительной бактерии способны выживать в сильно щелочной среде (рН ~ 10) ¹ и является одним из видов бактерий , которые могут стать возбудителем явления , называемого Микробиологически Индуцированные кальцит осадков (MICP) ^2-4. MICP представляет собой процесс , в котором осаждение карбоната кальция индуцируется некоторых микробов в подходящих условиях окружающей среды. С. pasteurii приобрела значение в последние годы из - за его идентификации в качестве возможного средства для стимулирования значительных объемов MICP при определенных условиях. Эта возможность связана с тем , что С. pasteurii обладает уникальной способностью секретировать обильное количество фермента уреазы. Этот фермент действует как катализатор, способствуя ускоренному лизис мочевины (естественные биохимические соединения с широко распространенным и избытке) в присутствии молекул воды. Через каскад реакций, этот процесс окончательнойLY приводит к образованию отрицательно заряженных ионов углерода. Эти ионы, в свою очередь, вступает в реакцию с положительными ионами металлов, таких как кальций, чтобы в конце концов образовались осадки карбоната кальция (кальцит); следовательно , ярлык MICP ^5-9.

Процесс MICP был известен и изучен в течение нескольких десятилетий ^10,11. За последние несколько лет, MICP была исследована для широкого круга инженерных и экологических применений , включая снизу вверх зеленого строительства ^12, усиление крупномасштабных структур ^13,14 и улавливания углерода и хранения ^15,16.

Например, оттяжки Каннингхэма ¹⁷ и др. аль разработан реактор умеренной температуры потока высокого давления, содержащего сердцевину из песчаника Berea. Реактор инокулированное бактериями S. fridgidimarina и в условиях высокого давления инжекции диоксида углерода в сверхкритическом состоянии , массивного накопления биомассы внутри пор тмов наблюдалось, что привело к снижению проницаемости более чем на 95%. Jonkers и Schlangen ¹⁸ изучали влияние некоторых специальных штаммов бактерий на самовосстановления процесса в бетоне. Внешняя вода транспортируется в сети пор, поступающей через поверхностные поры, как ожидается, чтобы активировать бездействующие бактерии, которые в свою очередь помогают структурную прочность через MICP. Tobler ¹⁹ и др. сравнили ureolytic активность S. pasteurii с коренным подземными водами ureolytic микрокосма в условиях , благоприятствующих крупномасштабную MCIP и обнаружили , что С. pasteurii имеет последовательную способность улучшить осаждение кальцита , даже когда коренные общины не имели предварительного активность уреазы. Мортенсен ²⁰ et.al изучали влияние внешних факторов , таких как тип почвы, концентрация хлорида аммония, солености, концентрации кислорода и лизиса клеток на MICP. Их демонстрация того, что процесс биологической очистки очень надежен с соотвЭСТ к широкому разбросу в пространстве параметров обосновывает пригодность этого процесса для различных восстановительных приложений крупномасштабных обеспечили надлежащий процесс обогащения для усиления бактерии предприняты. Phillips ²¹ и др. аль разработаны опыты по изучению изменения проницаемости и прочности колонны песка и сердечника из песчаника после инъекции с S. pasteurii культуры. Они обнаружили, что в то время как проницаемость снизился в 2 - 4 раза, а предел прочности увеличился в три раза.

С. pasteurii и его роль в MICP являются темами активных исследований и ряд вопросов , связанных с механизмом химического осаждения все еще ​​до конца не изучен. В свете этого, очень важно иметь набор согласованных стандартных протоколов точно культуры соответствующим образом обогащена запас S. pasteurii для достижения MICP. Здесь мы опишем строгий протокол, который будет обеспечивать повторяемости и воспроизводимости. Это маnuscript описывает подробные протоколы для культивирования S. pasteurii и соответствующим образом обогащении культуральной среды , чтобы вызвать осаждение. Процесс исследован с помощью различных микроскопических методов, таких как оптические и сканирующей электронной микроскопии (SEM) и X-Ray фото-электронной спектроскопии (XPS). В центре внимания рукописи на процессе MICP. Процедуры как SEM и SIMS, будучи хорошо зарекомендовавшие себя стандартные протоколы, не описаны отдельно.

протокол

Примечание: Выполнить экспериментальные протоколы в порядке, описанном ниже. Бактериальная культура Протокол обсуждается в разделе 1 (Также см рисунок 1). Раздел 2 описывает протокол для обогащения культуральной среды с использованием внешних добавок. Раздел 3 описывает протоколы для многомодового микроскопии. Веса всех отдельных компонентов могут быть измерены с помощью аналитических весов. Объем каждого раствора можно измерить с использованием объемного цилиндра.

Примечание: Правильные протоколы биобезопасности должны соблюдаться для разделов 1 - 2. Обратитесь к институциональной служба безопасности для деталей.

1. Бактериальные культуры

1. Культура Бактерии - Агар пластины Средний Приготовление
   1. Соберите оборудование и ингредиенты, такие как чашки Петри, колбы, Трис-основание, HCl, агар, Millipore вода, рН-метр etc.Sterilize все контейнеры автоклавированием при 121 ° C перед использованием.
   2. Готовят 1 л 0,13 М водный раствор трис-буфера, путем смешивания 15,75 г Трис-основание 1 л воды Millipore. Для снижения уровня рН исходного раствора (рН 10,4) добавляют 2,800 мкл HCl (концентрация 50%). Проверить непрерывно с помощью рН-метра, чтобы установить рН = 9.
   3. Разделить 1 л буферного раствора на две части следующим образом:
      1. Взять 800 мл этого раствора. Разделить его поровну на две части по 400 мл каждого. Растворить 8 г (NH _{4) 2} SO ₄ до одного раствора и 16 г дрожжевого экстракта к другому решению.
      2. Возьмите оставшиеся (200 мл) раствора и разделить его снова на две части по 100 мл каждого. Смешайте 2 г (NH _{4) 2} SO ₄ к одному. Добавляют 4 г дрожжевого экстракта и 4 г агар к другому.
   4. Автоклав 4 решения отдельно после обертывания соответствующих колб в алюминиевую фольгу и приклеить автоклава ленты.
      Примечание: Если блок Benchtop автоклав используется, объем должен быть установлен на 500 мл (температура и давление автоматчески указано в зависимости от объема).
   5. После того, как выводя их из автоклава, установить два 400 мл растворов в сторону на шаге 1.3.1 (ниже). Смешайте две 100 мл растворов, чтобы иметь 200 мл раствора. Вылейте смесь в 10 - 12 чашек Петри.
2. Культура Бактерии - Агар плиты Подготовка образцов
   1. Удалите бактериальный запас из морозильной камеры (-80 ° C) и дайте ему растаять. После размораживания должным образом, поместите бактериальный бульон и агар пластины внутри капюшоном биологической безопасности.
   2. Выберите микропипетки наименьший доступный размерности (0,5 - 10 мкл хороший выбор) , чтобы заражать наконечник с pasteurii складе Sporosarcina. Streak агар пластины с наконечником микропипетки. Поместите прожилками агаризованной внутри не-качалке инкубаторе при температуре 31 ° С в течение 48 ч.
   3. После 48 часов, удалить пластину из инкубатора и визуально изучить для существования отдельных колоний. Если нет отдельных колоний, а затем поместить его в тон инкубаторе в течение еще 24 часов.
   4. Повторите процесс, пока отдельные колонии не обнаружены. Не превышать 7 дней судебного разбирательства.
      Примечание: Если отдельные колонии не появляются даже через неделю, то можно сделать вывод о том, что шаги не были выполнены должным образом, и весь процесс необходимо повторить с шага 1.
3. Культура Бактерии - Заключительный Подготовка образцов
   1. Смешайте две 400 мл (растворы Трис - буфер + (NH _{4) 2} SO ₄ и Трис - буфер + дрожжевой экстракт (1.5.1) вместе , чтобы получить 800 мл раствора. Перенести 125 мл этого раствора в колбу.
   2. Провести визуальный осмотр поверхности чашки с агаром, чтобы идентифицировать области с высокой концентрацией отдельных колоний. Аккуратно подталкивать и сломать одну из колоний с наконечником микропипетки.
   3. Dip тот же самый кончик микропипетки в мл колбу 125 и перемешать тщательно, чтобы обеспечить достаточное количество ячеек для надежного умножения перенесешься, Поместить колбу в качалке инкубаторе при 150 оборотах в минуту, 30 & deg; С в течение 2 - 3 дней. Через 2 - 3 дней, снимите колбу из инкубатора.
4. Культура Бактерии - Заключительный Cell Count
   1. Выполнение последовательного разбавления неразбавленной культурального раствора с помощью PBS , чтобы достичь разбавления по меньшей мере , десять миллионов (10 ^-7) , чтобы гарантировать , появляются счетные единичные колонии. Нарисуйте семь параллельных равноудаленных линий на одном из агар-пластин.
      1. Сделайте это рисунок смелые линии на нижней поверхности чашки Петри, достаточно видным, чтобы быть видимыми сверху. Отбросьте 3 маленьких капель неразбавленной раствора в одном сегменте. Добавить 1 мл неразбавленной раствора до 9 мл фосфатного буферного солевого раствора (PBS), чтобы получить разведение 1:10.
   2. Возьмем небольшую аликвоту (~ 0,1 мл) этого вновь разбавленного раствора с помощью пипетки и падение более 3 маленьких капель на следующем сегменте. Перенести вновь разбавленный раствор в новую колбу и дополнительно разбавленные в десять раз (10x) подобавляя PBS. Это приносит вниз разбавления до 10 ^-2 или 1: 100.
      1. Используйте этот 1: раствор 100 в следующем сегменте. Повторите эту операцию он обработает с небольшими объемами свеже разбавленных растворов путем последовательного переноса их в новые колбы и непрерывно разбавляя в десять раз (10x) в тандеме с PBS , чтобы получить больше и больше разбавленные образцы от 10 ^-3 или 1: 1000 на всем пути вплоть до 10 ^-7 или 1:10 млн в последнем сегменте.
   3. Выполнение колониеобразующих подсчет единиц (КОЕ) обкладки для подсчета количества клеток, присутствующих в агаром после инкубации планшет в течение 1 - 2 дней при 31 ° C. Это дает количественную меру количества бактерий в неразведенном образце.
      Примечание: измеряется значение КОЕ на основе способности системы, чтобы дать начало колоний в конкретных условиях питательной среды, температуры и времени, предполагая, что каждая колония является отдельным и основана одной жизнеспособной микробной клетки.
   4. Печатьчашки Петри с самоуплотняющееся пленку и хранить оставшиеся элементы в холодильнике для будущего использования.

2. Протокол для обогащения питательного для ускорения осадков

1. Передача 9 мл приготовленной культуральной жидкости (клетки + среда) в нескольких стерилизованных центрифужные пробирки, каждая из 10 мл объема.
2. Приготовьте 100 мл исходного раствора с внешнего обогащения, состоящей из четырех компонентов в следующих концентрациях в свежей среде: мочевина: 2 г / л, хлорид аммония: 1 г / л, бикарбонат натрия: 212 мг / л, хлорид кальция: 280 мг / л. Тщательно измерить все ингредиенты с помощью аналитических весов и смешайте все, кроме мочевины со свежей средой, в химическом стакане и место в автоклаве (121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм, 15 мин).
   1. После автоклава, смешайте необходимое количество мочевины (2 мг) с 1 мл свежей среды, и пропускают через шприц, снабженный с шприцевой фильтр 0,22 мкм, чтобы завершить процесс обогащения.
   2. Добавьте 1мл этого обогащения среды с добавками к стерилизованных центрифужные пробирки, содержащие 9 мл приготовленной культуральной жидкости (клетки + среда) (этап 2.1).
      Примечание: Из всех этих компонентов, мочевина разлагаться при повышенных температурах, не могут быть стерилизованы в автоклаве. Следовательно, после того, как другие компоненты автоклавируют (121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм, 15 мин), мочевина добавляется последний через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
3. Vortex каждая трубка тщательно с использованием механического Вортекс. Поместите обогащенных жидкостей (клетки + + добавки среда) в не-качалке инкубаторе при температуре 30 ° C. Контроль всех единиц регулярно для инициации осадков. С помощью светового микроскопа, начинают микроскопические наблюдения сразу начала осаждения обнаруживается невооруженным глазом. Это, как правило, в диапазоне от 30 - 36 ч после начала экспериментов.

3. Протокол многорежимный микроскопией

1. Передача небольшого объема (~ 1 мл) жидкости высокого Магнификатаионная микроскопия-камерные системы покровного стекла для выполнения начальных наблюдений с режимом яркого поля. Начнем с того, начать все наблюдения с наименьшим увеличением (4X). которая обеспечивает широкую зону покрытия и, следовательно, глобальной информации о распределении преципитатов.
2. Выберите отдельные области со значительными объемами осадков и увеличения (20X, 40X, 60X) путем постепенного увеличения увеличения.
   Примечание: Поскольку это невозможно правильно разрешить клетки из внеклеточной полимерного вещества (EPS) при ярком поле (из-за очень близких показателей преломления), включите режим фазового контраста по мере необходимости. В этом режиме только контуры клеточных мембран (будучи другой фазой, чем насыпной клетки) открыты, что позволяет визуально дифференцирование.
3. Наконец, окрасить некоторые камеры с Live / Dead пятна, которые селективно окрашивает живые компоненты, как зеленый цвет во время окрашивания мертвых компонентов в красном цвете. Обратитесь к стандартным протоколам ^{28 <}/ SUP>.
4. Включите флуоресцентной режиме, чтобы правильно различать между красной и зеленой областях. Красный (Красный куб фильтр с возбуждением длиной волны 540 - 580 нм, дихроичное зеркало 595 нм и Барьерный фильтр 600 - 660 нм) и зеленый (GFP Long однопроходной Зеленый фильтр куб с возбуждением длиной волны 440 - 480 нм, дихроичным зеркалом 505 нм и барьерный фильтр 510 нм) фильтров кубов используются для облегчения флуоресцентные микрофотографии.
5. После того, как все данные многорежимный были собраны, выбрать лучшие изображения и вручную наложения (индивидуальная, светлого фазового контраста и флуоресцентные изображения) для получения наилучшего контраста и четкости.
6. Выполните SEM на высушенные твердых образцов, чтобы понять, кристаллические структуры. Это хорошо установлена ​​и стандартная процедура. ²² Выполните XPS , чтобы идентифицировать химические подписи функциональных групп (карбонаты). Это устоявшиеся и стандартная процедура , а также. ²³

Результаты

С. pasteurii будучи алкалифилы ²⁴ может выжить относительно суровых условиях. Когда упомянутый выше протокол культуры следует, и С. pasteurii выращивается внутри камеры, бактерии , приводит к осаждению карбоната кальция с течением времени (Фигура 2А).

Обсуждение

Критические шаги: Эта рукопись подробно описывает протоколы для культивирования жизнеспособного образца S. pasteurii. После того, как культура была приготовился, он должен быть соответствующим образом обогащена. Это является ключевым шагом жизненно важное значение для успех...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium