Inducida microbiológicamente Calcita precipitación mediada por<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Resumen

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Resumen

La bacteria en particular bajo investigación aquí (S. pasteurii) es único en su capacidad, en las condiciones adecuadas, para inducir la hidrólisis de la urea (ureolysis) en entornos naturales a través de la secreción de una enzima ureasa. Este proceso de ureolysis, a través de una cadena de reacciones químicas, conduce a la formación de precipitados de carbonato de calcio. Esto se conoce como inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP). Los protocolos de cultivo adecuados para MICP se detallan aquí. Por último, se realizaron experimentos de visualización en diferentes modos de microscopía de comprender diversos aspectos del proceso de precipitación. Técnicas como la microscopía óptica, se emplearon Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS) para caracterizar químicamente el producto final. Además, la capacidad de estos precipitados a obstruir los poros dentro de un medio poroso naturales se demostró a través de un experimento cualitativo donde esponjabarras se utilizan para imitar un poro de la red con una gama de escalas de longitud. Una barra de esponja sumergido en el medio de cultivo que contiene las células bacterianas se endurece debido a la obstrucción de sus poros resultantes del proceso continuo de precipitación química. Esta barra de esponja endurecido exhibe una resistencia superior en comparación con una barra de esponja de control que se comprime y apretó bajo la acción de una carga externa aplicada, mientras que la barra de endurecido es capaz de soportar el mismo peso con poca deformación.

Introducción

Sporosarcina pasteurii es una bacteria gram-positiva capaces de sobrevivir en entornos altamente alcalinas (pH ~ 10) ¹ y es uno de las especies bacterianas que pueden convertirse en un agente causal de un fenómeno llamado inducida microbiológicamente Calcita Precipitación (MICP) ^2-4. MICP es un proceso en el que la precipitación de carbonato de calcio es inducido por ciertos microbios en condiciones ambientales adecuadas. S. pasteurii ha cobrado importancia en los últimos años debido a su identificación como un posible agente para inducir un volumen significativo de MICP bajo ciertas condiciones. Esta posibilidad surge del hecho de que S. pasteurii tiene la capacidad única de secretar grandes cantidades de la enzima ureasa. Esta enzima actúa como un catalizador, la promoción de una lisis acelerada de urea (un compuesto orgánico que existe de forma natural con el suministro generalizada y abundante) en presencia de moléculas de agua. A través de una cascada de reacciones, este proceso finalLy conduce a la generación de iones carbonato con carga negativa. Estos iones, a su vez, reaccionan con iones metálicos positivos como el calcio para formar finalmente precipitados de carbonato de calcio (calcita); por lo tanto, la etiqueta MICP ^5-9.

El proceso de MICP ha sido conocido y estudiado durante varias décadas ^10,11. En los últimos años, se ha investigado MICP para una amplia gama de aplicaciones ambientales, incluyendo la construcción verde de abajo hacia arriba ^12, la mejora de las estructuras a gran escala ^13,14 y la captura de carbono y almacenamiento ^15,16 ingeniería y.

Por ejemplo, Cunnigham ¹⁷ et. Al diseñado un reactor de flujo temperatura moderada a alta presión que contiene un núcleo de arenisca Berea. El reactor se inoculó con las bacterias S. fridgidimarina y en condiciones de inyección de dióxido de carbono supercrítico a alta presión, una acumulación masiva de biomasa dentro del poro volse observó umes, lo que condujo a la reducción de más de 95% de la permeabilidad. Jonkers y Schlangen ¹⁸ estudiaron el efecto de ciertas cepas especiales de bacterias en el proceso de auto-sanación en el hormigón. Se espera externa de agua transportada en la red de poros entra a través de los poros de la superficie para activar las bacterias inactivas que a su vez ayudan a la resistencia estructural a través de MICP. Tobler ¹⁹ et al. han comparado la actividad de S. ureolíticas pasteurii con un agua subterránea microcosmos ureolíticas indígena en condiciones que favorecen MCIP a gran escala y se encontró que S. pasteurii tiene una capacidad constante para mejorar la precipitación de calcita incluso cuando las comunidades indígenas carecían de actividad de la ureasa antes. Mortensen ²⁰ et.al han estudiado los efectos de los factores externos, como el tipo de suelo, la concentración de cloruro de amonio, salinidad, concentración de oxígeno y la lisis de las células en MICP. Su demostración de que el proceso de tratamiento biológico es muy robusto con respect a una amplia variación en el espacio de parámetros corrobora la idoneidad de este proceso para diversas aplicaciones de remediación a gran escala proporciona un proceso de enriquecimiento adecuado para reforzar las bacterias se lleva a cabo. Phillips ²¹ et. al diseñado experimentos para estudiar los cambios en la permeabilidad y la fuerza de una columna de arena y un núcleo de arenisca después de haber sido inyectados con S. culturas pasteurii. Ellos encontraron que mientras que la permeabilidad disminuyó 2 - 4 veces, mientras que la resistencia a la fractura aumentó tres veces.

S. pasteurii y su papel en MICP son temas de investigación activa y varias cuestiones relacionadas con el mecanismo de precipitación química todavía no se entienden completamente. A la luz de esto, es muy importante contar con un conjunto de protocolos estandarizados coherentes con la cultura con precisión una población enriquecida de manera adecuada S. pasteurii para lograr MICP. A continuación, se describe un protocolo riguroso que garantice la repetibilidad y la reproducibilidad. esta manuscript describe los protocolos detallados para el cultivo de S. pasteurii y adecuadamente el enriquecimiento del medio de cultivo para inducir la precipitación. El proceso se investigó a través de diversas técnicas microscópicas tales como óptica y microscopía electrónica de barrido (SEM) y X-Ray Photo-electrón Spectroscopy (XPS). El foco del manuscrito está en el proceso de MICP. Los procedimientos como SEM y SIMS, siendo protocolos estándar bien establecidos, no se describen por separado.

Protocolo

NOTA: Realice los protocolos experimentales en el orden que se describe a continuación. El protocolo de cultivo bacteriano se discute en la Sección 1 (véase también la figura 1). Sección 2 se describe el protocolo para enriquecer el medio de cultivo utilizando aditivos externos. Sección 3 describe los protocolos para la microscopía de multi-modo. Los pesos de todos los componentes individuales se puede medir usando una balanza analítica. Volumen de cada solución se puede medir usando un cilindro volumétrico.

NOTA: los protocolos adecuados de bioseguridad debe ser seguido por las secciones 1 - 2. Consultar la oficina de seguridad institucional para obtener más detalles.

1. bacteriana Cultura

1. Las bacterias Cultura - agar placa de medio Preparación
   1. Montar equipo y los ingredientes tales como placas de Petri, frasco, Tris-base, HCl, agar, Millipore agua, pH-metro etc.Sterilize todos los contenedores en autoclave a 121 ° C antes de su uso.
   2. Preparar 1 L de 0,1solución 3 M acuosa de tampón Tris mezclando 15,75 g de Tris-base con 1 L de agua Millipore. Para bajar el nivel de pH de la solución original (pH 10,4) añadir 2.800 l de HCl (concentración 50%). Comprobar continuamente usando un pH-metro para ajustar pH = 9.
   3. Dividir la solución tampón 1 L en dos partes como sigue:
      1. Tomar 800 ml de esta solución. Divida igualmente en dos partes de 400 ml cada uno. Disolver 8 g (NH _{4) 2} SO ₄ a una solución y 16 g de extracto de levadura a la otra solución.
      2. Tomar las restantes (200 ml de) solución y se divide de nuevo en dos partes de 100 ml cada uno. Mezclar 2 g (NH _{4) 2} SO ₄ a uno. Añadir 4 g de extracto de levadura y 4 g de agar a la otra.
   4. Autoclave las 4 soluciones por separado después de concluir los respectivos frascos de lámina de aluminio y se pegue cintas de autoclave.
      NOTA: Si se utiliza un equipo de mesa autoclave, el volumen debe establecerse en 500 ml (temperatura y presión autómatacamente especificado como una función del volumen).
   5. Después de sacarlos del autoclave, ajustar las dos soluciones de 400 ml a un lado para el paso 1.3.1 (a continuación). Mezclar las dos soluciones de 100 ml para tener una solución de 200 ml. Verter la mezcla en 10 - 12 placas de Petri.
2. Las bacterias Cultura - placa de agar Preparación de muestras
   1. Retire la acción bacteriana del congelador (-80 ° C) y deje que se descongele. Después de descongelar correctamente, coloque la población bacteriana y la placa de agar dentro de una campana de bioseguridad.
   2. Seleccione la micropipeta de menor dimensión disponible (0,5 - 10 l es una buena opción) para infestar la punta con el caldo de pasteurii Sporosarcina. Racha de una placa de agar con la punta de la micropipeta. Coloque la placa de agar con rayas dentro de una incubadora no agitación a 31 ° C durante 48 horas.
   3. Después de 48 horas, retire la placa de la incubadora y examinar visualmente para detectar la existencia de colonias individuales. Si no hay colonias individuales, luego se coloca en tél incubadora durante otras 24 horas.
   4. Repita el proceso hasta que se detectan colonias individuales. No exceda de 7 días de prueba.
      NOTA: Si no aparecen incluso después de una semana, entonces se concluye que las medidas no se han aplicado correctamente y todo el proceso debe repetirse desde el paso 1 colonias individuales.
3. Las bacterias Cultura - Muestra final Preparación
   1. Mezclar las dos soluciones de 400 ml (tampón de Tris + (NH _{4) 2} SO ₄ y tampón de Tris + extracto de levadura (1.5.1) entre sí para obtener una solución de 800 ml. De transferencia de 125 ml de esta solución en un matraz.
   2. Realizar un examen visual de la superficie de la placa de agar para identificar regiones con alta concentración de colonias individuales. empujar suavemente y romper una de las colonias con una punta de micropipeta.
   3. Moje la misma punta de la micropipeta en el matraz de 125 ml y se remueve a fondo para asegurar que un número suficiente de células para la multiplicación robusta ser transferido. Colocar el matraz en un incubador con agitación a 150 rpm, 30 ° C durante 2 - 3 días. Después de 2 - 3 días, retirar el matraz de la incubadora.
4. Las bacterias Cultura - Recuento de Células final
   1. Realizar dilución en serie de la solución de cultivo no diluido con PBS para alcanzar una dilución de al menos diez millones (10 ^-7) para asegurar aparecen colonias individuales contables. Dibuje siete líneas equidistantes paralelas sobre una de las placas de agar.
      1. Para ello, dibujando líneas en negrita en la superficie inferior de la placa de Petri, lo suficientemente prominente como para ser visible desde la parte superior. Caída de 3 pequeñas gotas de solución no diluida en un segmento. Añadir 1 ml de solución no diluida a 9 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una dilución de 1:10.
   2. Tomar una pequeña alícuota (~ 0,1 ml) de esta solución recién diluida con una pipeta y colocar 3 gotas más pequeñas en el siguiente segmento. Transferir la solución recién diluida a un nuevo matraz y más diluidas diez veces (10x) porla adición de PBS. Esto hace bajar la dilución de 10 ^-2 o 1: 100.
      1. Utilice esta solución 1: 100 en el siguiente segmento. Repita este se procesa con pequeños volúmenes de las soluciones diluidas por ellos recién transferir sucesivamente a nuevos frascos y diluyendo de forma continua de diez veces (10x) en conjunto con PBS para obtener más y más muestras diluidas de 10 ^-3 ó 1: 1.000 de todo el camino hasta 10 ^-7 o 1:10 millones en el último segmento.
   3. Realizar formadoras de colonias recuento Unidad (CFU) Placa para contar el número de células presentes en la placa de agar después de incubar la placa durante 1 - 2 días a 31 ° C. Esto da una medida cuantitativa de la recuento de bacterias en la muestra sin diluir.
      NOTA: El valor CFU se mide en base a la capacidad del sistema para dar lugar a colonias en las condiciones específicas de medio nutriente, temperatura y tiempo asumiendo que todas las colonias es independiente y fundada por una sola célula microbiana viable.
   4. Sellolas placas de Petri con la película de cierre automático y tienda de artículos restante en un refrigerador para su uso futuro.

2. Protocolo para el enriquecimiento de nutrientes para acelerar la precipitación

1. Transferencia de 9 ml de líquido de cultivo preparada (células + medio) en varios tubos de centrífuga estériles, cada una de 10 ml de volumen.
2. Preparar una solución madre de 100 ml del enriquecimiento externo que consta de cuatro componentes en las siguientes concentraciones en medio fresco: Urea: 2 g / L, cloruro de amonio: 1 g / L, bicarbonato de sodio: 212 mg / L, cloruro de calcio: 280 mg / L. medir cuidadosamente todos los ingredientes usando una balanza analítica y se mezcla todo, pero la urea con medio fresco en un vaso de precipitados y el lugar en el autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min).
   1. Después de autoclave, se mezcla la cantidad requerida de urea (2 mg) con 1 ml de medio fresco y pasar a través de una jeringa equipada con filtro de jeringa de 0,22 micras para completar el proceso de enriquecimiento.
   2. Añadir 1ml de este medio de enriquecimiento con aditivos a los tubos de centrífuga estériles que contienen 9 ml de líquido de cultivo preparada (células + medio) (véase el paso 2.1).
      NOTA: de todos estos componentes, urea ser degradable a temperaturas elevadas, no puede ser esterilizado en un autoclave. Por lo tanto, después de que los otros componentes han sido tratado en autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min), se añade urea pasado a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras.
3. Vortex cada tubo a fondo usando un agitador vorticial mecánica. Coloque los líquidos enriquecidos (células + aditivos + medio) en una incubadora no agitación a 30 ° C. Supervisar todas las unidades con regularidad para la iniciación de la precipitación. El uso de un microscopio de luz, comenzar observaciones microscópicas una vez que se detecta inicio de la precipitación con el ojo desnudo. Esto es por lo general entre 30 - 36 hr después del inicio de los experimentos.

3. Protocolo de Microscopía varios modos de funcionamiento

1. Transferir un volumen pequeño (~ 1 ml) de líquido a una alta magníficatión sistema cubreobjetos microscopio de la recámara para realizar observaciones iniciales con el modo de campo claro. Para empezar, iniciar todas las observaciones con el aumento más bajo (4X). que proporciona una amplia área de cobertura y, por tanto, la información sobre la distribución mundial de precipitados.
2. Seleccionar áreas particulares con volúmenes significativos de precipitaciones y un zoom (20X, 40X, 60X) aumentando progresivamente el aumento.
   NOTA: Ya que es imposible resolver adecuadamente las células de la sustancia polimérica extracelular (EPS) en el marco de campo brillante (debido a los índices de refracción muy cerca), cambiar el modo de contraste de fase siempre que sea necesario. En este modo, sólo los contornos de las membranas celulares (siendo una fase diferente de la célula a granel) son visibles, lo que permite la diferenciación visual.
3. Por último, algunas cámaras de manchar con tinción Live / Dead que tiñe selectivamente los componentes vivos como verde, mientras que la coloración de los componentes de muertos en rojo. Remitirse a los protocolos estándar ^{28 <}/ Sup>.
4. Activar el modo fluorescente para distinguir correctamente entre las regiones rojas y verdes. Rojo (filtro de cubo rojo con la excitación de longitud de onda de 540 - 580 nm, espejo dicroico de 595 nm y Barrera filtro de 600 - 660 nm) y de paso largo GFP verde (filtro de cubo verde con excitación de longitud de onda de 440 - 480 nm, espejo dicroico de 505 nm y filtro de barrera de 510 nm cubos) de filtro se utilizan para facilitar micrografías fluorescentes.
5. Una vez que todos los datos multimodo se han reunido, seleccionar las mejores imágenes y superposición de forma manual (campo claro individual, de contraste de fases y las imágenes fluorescentes) para obtener el mejor contraste y la claridad posible.
6. Realizar SEM de las muestras sólidas secas de entender las estructuras de cristal. Este es un procedimiento bien establecido y estándar. ²² Realizar XPS para identificar las firmas químicas de los grupos funcionales (carbonatos). Este es un procedimiento bien establecido y estándar, así. ²³

Resultados

S. pasteurii ser un Alcalófilo ²⁴ puede sobrevivir en condiciones relativamente duras. Cuando el protocolo de cultivo antes mencionado se siguió, y S. pasteurii se cultiva dentro de una cámara, las bacterias lleva a la precipitación de carbonato de calcio con el tiempo (Figura 2A). La figura 2 (b) muestra una imagen microscópica óptica de contraste de fases de la población de células bacterianas en el medio de cultivo...

Discusión

Los pasos críticos: Este manuscrito describe en detalle los protocolos para el cultivo de una muestra viable de S. pasteurii. Una vez que el cultivo ha sido preparado, que debe ser enriquecida adecuadamente. Este es un paso clave fundamental para el éxito del experimento debido a una falta de proporcionar el ambiente químico adecuado conduce a cualquiera de las escalas de tiempo muy largos de precipitación o una falta completa de la misma. S. pasteurii es bastante sensible a varios...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium