מיקרוביולוגי מושרה קלציט רטיבות בתיווך<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Summary

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Abstract

החיידק המסוים תחת החקירה כאן (pasteurii ס) הוא ייחודי ביכולתו, בתנאים המתאימים, כדי לגרום הידרוליזה של האוריאה (ureolysis) ב טבעי סביבות באמצעות הפרשה של באוראז אנזים. תהליך זה של ureolysis, דרך שרשרת של תגובות כימיות, מוביל להיווצרות של משקעי סידן פחם. תופעה זו ידועה בשם מיקרוביולוגי מושרה קלציט רטיבות (MICP). פרוטוקולי התרבות הראויים MICP מפורטים כאן. לבסוף, ניסויים להדמיה תחת מצבים שונים של מיקרוסקופיה בוצעו להבין היבטים שונים של התהליך המשקע. טכניקות כמו מיקרוסקופיה אופטית, מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM) ו- X-Ray תמונה אלקטרונים ספקטרוסקופיה (XPS) הועסקו לאפיין את המוצר הסופי כימית. יתר על כן, היכולת של משקעים אלה כדי לסתום נקבוביים בתוך מדיום נקבובי טבעי הודגמה באמצעות ניסוי איכותי שבו ספוגברים שימשו לחקות נקבובית-רשת עם מגוון של סולמות אורך. בר ספוג טבול מדיום התרבות המכיל תאי חיידקיים מתקשה בשל סתימת הנקבוביות שלה הנובעים התהליך המתמשך של משקעים כימיים. בר ספוג מוקשה זה מפגין כוח עליון בהשוואה ברה ספוג שליטה אשר הופך דחוס ולחץ תחת הפעולה של עומס חיצוני מיושם, ואילו הבר המוקשה הוא מסוגל לתמוך המשקל הזהה עם עיוות קטנה.

Introduction

Sporosarcina pasteurii הוא חיידק חיובי גרם מסוגל לשרוד בסביבות בסיסיות מאוד (pH ~ 10) ¹ והוא אחד מיני חיידקים שיכולים להיות סוכן סיבתי של תופעה הנקראת מיקרוביולוגי מושרת קלציט רטיבות (MICP) ^2-4. MICP הוא תהליך שבו משקעים של סידן פחמתי הוא המושרה על ידי חיידקים מסוימים בתנאים סביבתיים מתאימים. ס pasteurii מקבלת משנה חשיבות בשנים האחרונות בשל זיהויו כסוכן האפשר גרימת בהיקפים משמעותיים של MICP בתנאים מסוימים. אפשרות זו נובעת מהעובדה ש יש pasteurii את היכולת הייחודית להפריש כמויות עצומות של באוראז האנזים. אנזים זה פועל כזרז, קידום תמוגה מואץ של אוריאה (תרכובת ביוכימית טבעית עם אספקה ​​נרחבת בשפע) בנוכחות של מולקולות מים. דרך מפל של תגובות, תהליך זה אולטימטיביly מוביל לדור של יונים טעונים שלילית קרבונט. יונים אלה, בתורם, מגיב עם יוני מתכת חיוביים כמו הסיד ולבסוף ליצירת משקעים של סידן פחם (קלציט); ומכאן תווית MICP ^5-9.

תהליך MICP כבר ידוע ולמד במשך כמה עשורים ^10,11. במהלך השנים האחרונות, MICP נחקרה על מגוון רחב של הנדסה ויישומים סביבתיים כולל בנייה ירוקה מלמטה למעלה ^12, שיפור של מבנים בקנה מידה גדול ^13,14 ו קיבוע פחמן ואחסון ^15,16.

לדוגמה, et ¹⁷ Cunnigham. אל עצב כור זרימת טמפרטורה מתונה בלחץ גבוה המכיל גרעין חול ברא. הכור היה מחוסן עם החיידקים ס fridgidimarina ובתנאים של הזרקת פחמן דו חמצני סופר קריטי בלחץ גבוה, הצטברות מסיבית של ביומסה בתוך הכרך הנקבוביumes נצפתה, אשר הובילה יותר מ -95% הפחתה חדיר. ¹⁸ Jonkers ו Schlangen בחן את ההשפעה של זנים מיוחדים של חיידקים על תהליך ריפוי עצמי בבטון. מים חיצוניים מועברים לרשת הנקבובית נכנסת הדרך הנקבובית השטח צפוי להפעיל את החיידקים הרדומים אשר בתורו לעזור חוזק מבנים באמצעות MICP. טובלר ¹⁹ et al. השוו את פעילות ureolytic של ס pasteurii עם מיקרוקוסמוס ureolytic תהום הילידים בתנאים לטובת MCIP בקנה מידה גדול ומצא כי ס יש pasteurii יכולת עקבית כדי לשפר ממטרי קלציט גם כאשר קהילות ילידים חסרות פעילות באוראז מוקדמת. Et.al ²⁰ מורטנסן חקרו את ההשפעות של גורמים חיצוניים כמו סוג הקרקע, ריכוז של אמוניום כלוריד, מליחות, ריכוז חמצן תמוגה של תאים על MICP. ההפגנה שלהם כי תהליך הטיפול הביולוגי הוא מאוד חזק עם שו"תect כדי וריאציה רחבה בחלל פרמטר ממחיש את הכושר של תהליך זה עבור יישומי משיקום בקנה מידה גדולה שונים הניתנים תהליך העשרה ראוי לחזק את החיידקים נעשה. Et ²¹ פיליפס. אל תוכנן ניסויים כדי ללמוד את השינויים בחדירות וכוח של טור חול גרעין חול לאחר שהוזרק לו ס תרבויות pasteurii. הם גילו כי בעוד חדירות ירד 2 - 4 פעמים ואילו הכוח לשברים שלוש פעמים.

Pasteurii ס ותפקידה MICP הם נושאים של מחקר פעיל וכמה סוגיות הנוגעות למנגנון של משקעים כימיים עדיין אינם מובנים במלואם. לאור זאת, חשוב מאוד להיות קבוצה של פרוטוקולים סטנדרטיים עקביים במדויק תרבות מניה מועשרת נאות ס pasteurii להשיג MICP. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קפדני שיבטיח דירות ויכולת שחזור. ma זהnuscript מתאר את הפרוטוקולים המפורטים culturing ס pasteurii ובאופן הולם להעשיר את המדיום תרבות להשרות משקעים. התהליך הוא נחקר באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות שונות כגון מיקרוסקופי אלקטרונים אופטיים סורק (SEM) ו- X-Ray תמונת אלקטרוני ספקטרוסקופיה (XPS). ההתמקדות של כתב היד היא על התהליך של MICP. נהלים כמו SEM ו SIMS, להיות פרוטוקולים סטנדרטיים ומבוססים, אינם מתוארים בנפרד.

Protocol

הערה: בצע את פרוטוקולי הניסוי לפי הסדר המתואר להלן. פרוטוקול תרבית החיידקים נדון בסעיף 1 (ראה גם איור 1). סעיף 2 מתאר את פרוטוקול להעשרת התרבות בינוני באמצעות תוספים חיצוניים. סעיף 3 מתאר את הפרוטוקולים למיקרוסקופיה במצב מרובה. משקולות של כל הרכיבים הבודדים ניתן למדוד באמצעות איזון אנליטיים. נפח של כל פתרון ניתן למדוד באמצעות גליל נפח.

הערה: פרוטוקולי בטיחות ביולוגי פרופר חייבת להיות במעקב במשך סעיפי 1 - 2. התייעץ במשרד הבטיחות המוסדי לפרטים.

1. תרבית חיידקים

1. התרבות חיידקים - אגר פלייט הכנה בינוני
   1. להרכיב ציוד וחומרי גלם כגון צלחות פטרי, בקבוק, טריס-בסיס, HCl, אגר, מי Millipore, pH מטר etc.Sterilize כל המכולות על ידי מעוקר ב 121 ° C לפני השימוש.
   2. כן 1 ליטר של 0.13 בתמיסה מימית M של טריס-חיץ על ידי ערבוב 15.75 גרם טריס בסיס עם 1 ליטר מים Millipore. כדי להוריד את רמת ה- pH של התמיסה המקורית (pH 10.4) להוסיף 2,800 μl של HCl (ריכוז 50%). בדוק ברציפות באמצעות מטר pH להגדיר pH = 9.
   3. מחלקים את הפתרון למאגר 1 L לשני חלקים כדלקמן:
      1. קח 800 מ"ל של פתרון זה. מחלקים אותו באופן שווה לשני חלקים של 400 מ"ל כל אחת. ממיסים 8 גרם (NH _{4) 2} SO ₄ על פתרון אחד ותמצית שמרים 16 גרם לפתרון אחרים.
      2. קח את הסכום הנותר (200 מ"ל של) פתרון ומחלקים אותו שוב לשני חלקים של 100 מ"ל כל אחת. מערבבים 2 גרם (NH _{4) 2} SO ₄ לאחד. הוסף 4 גרם תמצית שמרים 4 גרם אגר לקצה השני.
   4. חיטוי 4 הפתרונים בנפרד לאחר גלישת צלוחיות בהתאמה באל רדיד דבק קלטות חיטוי.
      הערה: אם יחידת החיטוי המעבדתיים בשימוש, הנפח צריך להיות מוגדר 500 מיליליטר (טמפרטורה ולחץ אוטומטically שצוין כפונקציה של נפח).
   5. לאחר שלקחו אותם מן החיטוי, להגדיר הפתרונות שני 400 מ"ל בצד צעד 1.3.1 (להלן). מערבבים הפתרונות שני 100 מ"ל יש פתרון 200 מ"ל. יוצקים את התערובת לתוך 10 - 12 צלחות פטרי.
2. תרבות חיידקים - צלחת אגרה הכנת דוגמאות
   1. הסר את המניה חיידקי מהמקפיא (-80 ° C) ולאפשר לו להפשיר. לאחר ההפשרה כראוי, למקם את מניית חיידקי הצלחת אגרה בתוך ברדס biosafety.
   2. בחר את micropipette של ממד הקטן זמין (0.5 - 10 μl הן בחירה טובה) כדי לפשוט את הקצה עם מניית Sporosarcina pasteurii. Streak צלחת אגר עם קצה micropipette. מניח את הצלחת אגרה המפוספסת בתוך חממה שאינה רועדת ב 31 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
   3. אחרי 48 שעות, להסיר את הצלחת מן החממה חזותית לבחון לקיומו של מושבות אחת. אם אין מושבות אחת, ולאחר מכן למקם אותו tהוא חמם עוד 24 שעות.
   4. חזור על התהליך עד מושבות אחת מזוהות. אין לעבור 7 ימי משפט.
      הערה: אם מושבות אחת אינה מופיעות אפילו אחרי שבוע, אז הוא הגיע למסקנה כי הצעדים לא הקפידו כראוי את כל התהליך יש לחזור משלב 1.
3. תרבות חיידקים - מדגם סופי כנה
   1. מערבבים את שני פתרונות 400 מ"ל (טריס חיץ + (NH _{4) 2} SO ₄ ו טריס חיץ + תמצית שמרים (1.5.1) יחד כדי להשיג 800 מ"ל פתרון. העבר 125 מ"ל של פתרון זה לתוך הבקבוק.
   2. בצע בדיקה ויזואלית של פני השטח של הצלחת אגרה לזהות אזורים עם ריכוז גבוה של מושבות אחת. בעדינות דחיפה ולשבור אחת המושבות עם טיפ micropipette.
   3. טובלים אותו קצה micropipette לתוך 125 מ"ל בבקבוק ומערבבים אותו ביסודיות כדי להבטיח כי מספר מספיק של תאים לכפל חזקים מקבלים הועברו. מניחים את הבקבוק בתוך חממה רועד ב 150 סל"ד, 30 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים. לאחר 2 - 3 ימים, להסיר את הבקבוק מן החממה.
4. תרבות חיידקים - ספירת כדוריות סופית
   1. בצע דילול סדרתי של הפתרון לתרבות הלא-מדולל באמצעות PBS להשיג דילול של לפחות עשרה מיליון (10 ^-7) כדי להבטיח מופיעים מושבות אחת מנייה. צייר שבעה קווים מקבילים במרחק שווה על אחד-הצלחות אגרו.
      1. עושים זאת על ידי ציור קווים נועזים על המשטח התחתון של צלחת פטרי, מספיק בולט כדי להיות גלוי מלמעלה. ירידה של 3 טיפות קטנות של פתרון שאינו מדולל לתוך קטע אחד. הוסף 1 מ"ל של פתרון שאינו מדולל ל 9 מ"ל של בופר פוספט (PBS) כדי להשיג דילול 1:10.
   2. קח aliquot קטן (~ 0.1 מ"ל) של פתרון בדילול החדש הזה עם טפטפת ושחרר 3 יותר טיפות קטנות על הקטע הבא. מעביר את הפתרון החדש מדולל בבקבוק חדש ועשר פעמים מדוללות יותר (10x) על ידיהוספת PBS. זה מוריד את הדילול עד 10 ^-2 או 1: 100.
      1. השתמש באפשרות זו 1: פתרון 100 במגזר הבא. חזור על פעולה זו הוא לעבד עם כמויות קטנות של פתרונות בדילול טרי באמצעות העברתם ברציפות צלוחיות חדשים דילול ברציפות פי עשרה (10x) בד בבד עם PBS להשיג יותר דגימות לדלל יותר מ 10 ^-3 או 1: 1,000 כל הדרך עד 10 ^-7 או 1:10 מיליון לתוך הקטע האחרון.
   3. בצע יחידת קולוני-פורמינג (CFU) ספירת צלחת לספור את מספר התאים הנמצאים הצלחת אגרה לאחר דוגרי צלחת 1 - 2 ימים על 31 מעלות צלזיוס. זה נותן מדד כמותי של ספירת החיידקים במדגם החי.
      הערה: ערך CFU נמדד בהתבסס על היכולת של המערכת כדי להצמיח מושבות בתנאים הספציפיים של מזין בינוני, טמפרטורה וזמן בהנחה שכל מושבה הוא נפרד שנוסד על ידי תא מיקרוביאלי יחיד קיימא.
   4. חותםצלחות פטרי עם עצמי איטום סרט ולאחסן פריטים שנותרו במקרר לשימוש עתידי.

פרוטוקול 2. להעשרה של מזון כדי להאיץ רטיבות

1. העברה 9 מיליליטר של נוזל התרבות המוכן (תאים + בינוני) לתוך צינורות צנטריפוגות כמה מעוקרים, כל אחד 10 מיליליטר נפח.
2. כן פתרון מניות 100 מיליליטר של ההעשרה החיצונית מורכב מארבעת מרכיבים בריכוזים הבאים מדיום חדש: אוריאה: 2 g / L, אמוניום כלוריד: 1 גר '/ ל, סודיום ביקרבונט: 212 מ"ג / L, כלוריד סידן: 280 מ"ג / L. בזהירות למדוד את כל המרכיבים באמצעות איזון אנליטיים לערבב את כל אבל אוריאה עם מדיום חדש בכוס ומניחים החיטוי (121 ° C, 15 psi, 15 דק ').
   1. בעקבות החיטוי, לערבב את הסכום הדרוש של אוריאה (2 מ"ג) עם 1 מ"ל של מדיום חדש ולהעביר באמצעות מזרק מצויד עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר כדי להשלים את תהליך ההעשרה.
   2. הוסף 1מ"ל של מדיום העשרה זה עם ותוספות צינורות צנטריפוגה מעוקר המכיל 9 מ"ל של נוזל תרבות מוכן (תאים + בינוני) (ראה שלב 2.1).
      הערה: מבין כל המרכיבים הללו, אוריאה להיות מתכלה בטמפרטורות גבוהות, לא ניתן לעקר ב החיטוי. לפיכך, לאחר הרכיבים האחרים כבר autoclaved (121 ° C, 15 psi, 15 דק '), אוריאה מתווסף האחרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.
3. וורטקס צינור אחד באמצעות vortexer מכני ביסודיות. מניח את הנוזלים המועשרים (תאים + תוספות + בינוניות) חממה שאינה רועדת ב 30 ° C. ניטור כל היחידות באופן קבוע עבור חניכה של משקעים. באמצעות מיקרוסקופ אור, להתחיל תצפיות מיקרוסקופיות פעם התפרצות של משקעים מזוהה עם בעין בלתי מזוינת. זה בדרך כלל בין 30 ל - 36 שעות לאחר תחילת הניסויים.

3. פרוטוקול למיקרוסקופיה Multi-mode

1. העבר נפח קטן (~ 1 מ"ל) של נוזל אל-מגניפיקט גבוההיון מיקרוסקופיה-תאי במערכת coverglass לבצע תצפיות ראשוניות עם מצב שדה בהיר. כדי להתחיל עם, להתחיל כל התצפיות עם ההגדלה הנמוכה ביותר (4X). אשר מספקת שטח רחב של כיסויים ומכאן מידע הגלובלי על חלוקת משקעים.
2. בחר אזורים מסוימים עם כמויות משמעותיות של משקעים זום (20X, 40X, 60X) על ידי הגדלת הגדלה בהדרגה.
   הערה: מאחר שאי אפשר לפתור את התאים כמו שצריך שעשויים מהחומרים פולימריים התאי (EPS) תחת בהיר שדה (בשל מדדים שבירים קרובים מאוד), לעבור על מצב שלב בניגוד לפי צורך. במצב זה, רק את קווי המתאר של קרום התא (להיות בפאזה שונה מאשר התא בתפזורת) גלויים, ובכך לאפשר בידול ויזואלי.
3. לבסוף, להכתים כמה תאים עם כתם Live / Dead באופן סלקטיבי צבענים הרכיבים לחיות כפי ירוק ואילו צביעת המרכיבים מת באדום. עיין פרוטוקולים סטנדרטיים ^{28 <}/ Sup>.
4. הפעל מצב פלורסנט להבחין כראוי בין האזורים האדומים וירוקים. האדום (קובייה מסננת אדומה עם גל עירור של 540 - 580 ננומטר, מראה Dichroic של 595 ננומטר גדר מסננת של 600 - 660 ננומטר) וגרין (קוביית מסנן GFP הארוך לעבור הירוק עם גל עירור של 440 - 480 ננומטר, מראה Dichroic של 505 ננומטר הגדר מסנן של 510 ננומטר) מסנן קוביות משמשים כדי להקל micrographs ניאון.
5. לאחר שכל נתוני המצב מרובה נאספו, בחרו את התמונות הטובות ביותר ואת הכיסוי ידני (brightfield פרט, שלבו בניגוד ותמונות ניאון) כדי להשיג את הניגוד הטוב ביותר האפשרי ובהירות.
6. בצע SEM על הדגימות המוצקות היבשות להבין מבנים גבישיים. זהו הליך ומבוסס סטנדרטי. ²² בצעו XPS לזהות חתימה כימית של קבוצות פונקציונליות (קרבונטים). זהו הליך ומבוסס סטנדרטי גם כן. ²³

תוצאות

ס pasteurii להיות ²⁴ alkaliphile יכול לשרוד בתנאים קשים יחסית. כאשר פרוטוקול התרבות הנ"ל מלווה, וס ' pasteurii הוא גדל בתוך חדר, החיידקים מובילים המשקע של סידן פחם לאורך הזמן (איור 2 א). איור 2 (ב) מראה תמונה מיקרוסקופית אופטית שלב ...

Discussion

קריטי שלבים: כתב יד זה מתאר בפירוט את הפרוטוקולים עבור culturing מדגם קיימא של ס pasteurii. לאחר בתרבות כבר הכינה, זה חייב להיות מועשר כראוי. זהו צעד מפתח חיוני להצלחת הניסוי בגלל חוסר היכולת לספק את הסביבה הכימית הנכונה מוביל או קשקשי זמן רבים מאוד של משקעים או ח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium