Mikrobiyolojik Kalsit Yağış Bağlı tarafından Aracılı<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Özet

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Özet

Burada soruşturma kapsamında, özellikle bakteri (S. pasteurii) doğal bir enzim üreaz salgılama yoluyla ortamlarda meydana gelen üre (ureolysis) hidrolizini uyardığı, doğru koşullar altında, kendi yeteneği eşsizdir. ureolysis bu işlem olup, kimyasal reaksiyonlar zinciri yoluyla, kalsiyum karbonat çökeltilerinin oluşmasına neden olur. Bu Mikrobiyolojik Kaynaklı Kalsit Yağış (MICP) olarak da bilinir. MICP için uygun kültür protokolleri burada ayrıntılı. Son olarak, mikroskopi farklı mod altında görselleştirme deneyleri yağış sürecinin çeşitli yönlerini anlamak için yapılmıştır. optik mikroskop gibi teknikleri, Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve X-Işını Foto elektron spektroskopisi (XPS) kimyasal olarak son ürünü karakterize etmek için kullanılmıştır. Dahası, doğal gözenekli ortamın içinde gözeneklerini tıkar bu çökeltilerin yeteneği nerede sünger niteliksel bir deney yoluyla gösterilmiştirçubuklar uzunluk ölçekleri bir dizi olan bir gözenek ağı taklit etmek için kullanıldı. bakteriyel hücreler ihtiva eden kültür ortamı içinde daldırma bir sünger çubuğu nedeniyle kimyasal çöktürme sürekli işlemle elde edilen gözeneklerinin tıkanması sertleşir. sertleştirilmiş çubuk küçük deformasyon ile aynı ağırlığı desteklemek mümkün iken, sıkıştırılmış ve uygulanan bir dış yük altında sıkılmış olur bir kontrol sünger bar karşılaştırıldığında bu sertleştirilmiş sünger çubuk üstün güç sergiler.

Giriş

Sporosarcina pasteurii yüksek alkali ortamlarda (pH ~ 10) ¹ hayatta mümkün gram pozitif bir bakteridir ve (MICP) ^2-4 Mikrobiyolojik Kaynaklı Kalsit Yağış adında bir fenomenin bir etkeni olabilir bakteri türlerinden biridir. MICP kalsiyum karbonat çökelmesi uygun çevre koşulları altında, belirli mikropların neden olduğu bir işlemdir. S. pasteurii nedeniyle belirli koşullar altında MICP önemli miktarlarda uyarılması için olası bir ajan olarak tanımlanması son yıllarda önem kazanmıştır. Bu olasılık aslında kaynaklanıyor S. pasteurii üreaz enzimi bol miktarda salgılar eşsiz bir yeteneği vardır. Bu enzim, su moleküllerinin varlığında, üre hızlandırılmış bir lizis (yaygın ve bol kaynağı ile doğal olarak meydana gelen biyokimyasal bileşiği) teşvik bir katalizör olarak hareket eder. reaksiyon kaskadı, bu işlem nihai sayesindely negatif yüklü karbonat iyonlarının oluşmasına sebep olur. Bu iyonlar, sırayla, son olarak da, kalsiyum karbonat (kalsit) çökeltilerinin oluşturmak üzere kalsiyum gibi artı yüklü metal iyonları ile reaksiyona; dolayısıyla etiket MICP ^5-9.

MICP süreci birkaç on ^10,11 bilinen ve incelenmiştir. Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, MICP mühendislik ve aşağıdan yukarıya yeşil inşaat ^12, büyük ölçekli yapıların ^13,14 ve karbon tutumu ve depolanması ^15,16 artırılması da dahil olmak üzere çevresel geniş bir uygulama yelpazesi için incelenmiştir.

Örneğin, Cunnigham ¹⁷ ve. Al bir Berea kumtaşı çekirdek ihtiva eden yüksek basınçlı bir uygun sıcaklık akış reaktörü tasarlanmıştır. Reaktör bakteri S ile aşılandı fridgidimarina ve yüksek basınçlı süper kritik karbon dioksit, enjeksiyon, gözenek hacim içinde biyokütle büyük birikim koşullarındaumes geçirgenliği fazla% 95 azalmaya yol olan gözlenmiştir. Jonkers ve Schlangen ¹⁸ betonda kendi kendini iyileştirme sürecine bakteri bazı özel suşları etkisini incelediler. yüzey boşluklarının giren gözenekli bir şebeke taşınan Harici su da MICP ile yapısal mukavemet yardımcı atıl bakteri aktive etmesi bekleniyor. Tobler ¹⁹ ve diğ. S. ureolytic aktivitesini karşılaştırdık büyük ölçekli MCIP lehine koşullar altında yerli yeraltı suyu ureolytic mikrokozmos ile pasteurii ve bulundu S. pasteurii yerli topluluklar önce üreaz aktivitesini yoksun bile kalsit yağış artırmak için tutarlı bir yeteneği vardır. Mortensen ²⁰ et.al toprak tipi, amonyum klorür, tuzluluk, oksijen konsantrasyonu ve MICP üzerindeki hücrelerin parçalanması konsantrasyonu gibi dış faktörlerin etkilerini inceledik. Biyolojik tedavi süreci resp ile çok sağlamdır Onların gösteriEKT parametre uzayında geniş bir varyasyon için üstlenilen bakterileri güçlendirmek için uygun bir zenginleştirme sürecini sağlanan çeşitli büyük ölçekli iyileştirme uygulamaları için bu sürecin uygunluk kanıtlar. Phillips ²¹ ve. El S. enjekte edildikten sonra bir kum sütun ve bir kumtaşı çekirdek geçirgenliği ve gücü değişiklikleri incelemek için deneyler tasarlanmıştır pasteurii kültürler. kırılma mukavemeti üç kez artarken 4 kez - Onlar geçirgenlik 2 azalırken bulundu.

S. pasteurii ve MICP rolü aktif bir araştırma ve kimyasal çökelme mekanizması ile ilgili çeşitli konularda konu hala tam olarak anlaşılmış değildir vardır. Bunun ışığında, kadar doğru bir kültür S. uygun bir zenginleştirilmiş stok tutarlı standart protokoller bir dizi olması çok önemlidir MICP elde pasteurii. Burada, tekrarlanabilirlik ve yeniden sağlayacak titiz bir protokol özetlemektedir. bu manuscript S. kültür ayrıntılı protokollerini anlatır pasteurii ve uygun çökelmesine neden olmak için bir kültür ortamı zenginleştirmek. süreç optik ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve X-Işını Foto elektron Spektroskopisi (XPS) gibi çeşitli mikroskobik teknikler sayesinde incelenmiştir. Yazının odak noktası MICP süreci üzerinde olduğunu. köklü standart protokolleri olmak SEM ve SIMS gibi prosedürleri, ayrı ayrı tarif edilmez.

Protokol

NOT: Aşağıda açıklanan sırayla deneysel protokol gerçekleştirin. Bakteri kültürü protokolü Bölüm 1 'de tartışılmıştır (aynı zamanda bakınız Şekil 1). Bölüm 2 harici katkı maddeleri kullanılarak kültür ortamı zenginleştirmek için protokol açıklar. Bölüm 3 multi-mode mikroskopi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm tek tek bileşenlerin ağırlıkları bir analitik terazi kullanılarak ölçülebilir. her solüsyonun hacmi volümetrik bir silindir kullanılarak ölçülebilir.

NOT: - ayrıntılar için kurumsal güvenlik ofisi danışın 2. Uygun biyogüvenlik protokolleri Bölüm 1 için takip edilmelidir.

1. Bakteriyel kültür

1. Kültür Bakteri - Agar Orta Hazırlama Plate
   1. Bu Petri kapları, şişe gibi, ekipmanı ve malzemeleri monte, Tris-bazlı, HCI, ağar, ultra saf su, pH-metre etc.Sterilize kullanılmadan önce, 121 ° C'de otoklavda tutarak tüm kaplar.
   2. 0.1 1 L hazırlanmasıMillipore 1 L su ile 15.75 g Tris-bazlı bir karıştırılmasıyla Tris-tampon 3 M sulu çözeltisi. Orijinal çözeltisi (pH 10.4) pH seviyesini düşürmek için HCI (% 50 konsantrasyon) 2.800 ul ekleyin. PH = 9 ayarlamak için bir pH metre kullanılarak sürekli edin.
   3. aşağıdaki gibi iki kısma 1 L tampon solüsyonu bölün:
      1. Bu çözeltinin 800 ml alın. 400 ml her biri iki kısma eşit olarak bölünür. 8 g _{(NH4) 2 SO4} diğer çözeltiye çözeltisi ve 16 g maya özütü, bir geçiş.
      2. çözeltinin kalan (200 ml) alın ve 100 ml her iki bölüme tekrar bölün. 2 g _{(NH4) 2 SO4} bir ila karıştırın. 4 g maya özütü ve 4 g agar ekleyin.
   4. ayrı ayrı Al folyo ilgili şişeler sarma ve otoklav bantları yapıştırma sonra 4 çözüm otoklavlayın.
      Not: bir tezgah üstü bir otoklav birimi kullanıldığında, birim, 500 ml (sıcaklık ve basınç otomatları ayarlanmalıdırically) hacminin bir fonksiyonu olarak belirtilmiş.
   5. otoklav onları dışarı aldıktan sonra bir kenara adım 1.3.1 (aşağıda) için iki 400 ml çözüm ayarlayın. 200 ml'lik bir çözelti için iki kez 100 mi çözüm karıştırın. 12 Petri kapları - 10 içine karışımı dökün.
2. Kültür Bakteri - Agar Plaka Numune Hazırlama
   1. Dondurucu (-80 ° C), bakteri stok çıkarın ve erimesine izin verir. Düzgün çözündükten sonra, bakteriyel stok ve biyogüvenlik kaput içinde agar plaka koyun.
   2. Sporosarcina pasteurii hisse senedi ile ucu istila - (10 ul iyi bir seçimdir 0.5) en küçük mevcut boyutun mikropipet seçin. Streak mikropipet ucu ile bir agar plakası. 48 saat boyunca 31 ° C'de olmayan bir çalkalama inkübatör içinde çizgili agar plaka yerleştirin.
   3. 48 saat sonra, inkübatör plaka kaldırmak ve tek koloniler varlığını incelemek görsel. Tek bir koloni varsa, o zaman t yerleştirino başka 24 saat için inkübatör.
   4. Tek koloniler tespit edilene kadar işlemi tekrarlayın. deneme 7 gün aşmayın.
      NOT: Tek koloniler bile bir hafta sonra, o adımlar düzgün takip edilmemiş ve tüm süreci adım 1'den tekrarlanması gerektiği sonucuna varılmıştır görünmüyorsa.
3. Kültür Bakteriler - Final Numune Hazırlama
   1. İki 400 mi solüsyon (Tris tamponu + _(NH4) karıştırın _{2 SO4} ve Tris tamponu + maya özütü (1.5.1) birlikte 800 ml solüsyon. Bir şişe içine Bu çözeltiye 125 ml transfer elde edildi.
   2. Tek koloniler, yüksek konsantrasyonlu bölgelerin tespit etmek agar levhasının yüzeyi görsel inceleme yapın. Yavaşça dürtmek ve bir mikropipet ucu ile kolonilerin birini kırmak.
   3. 125 ml'lik bir şişe içine aynı mikropipet ucu batırın ve transfer olsun sağlam çarpma için hücrelerin yeterli sayıda sağlamak için iyice karıştırın. 3 gün - 150 rpm, 2, 30 ° C'de çalkalayıcı bir inkübatör içine yerleştirilir. 2 Sonra - 3 gün, inkübatör şişeyi çıkarın.
4. Kültür Bakteriler - Final Hücre Sayısı
   1. Sayılabilen tek koloniler görünmesini sağlamak için en az on milyon (10 ^-7) bir seyreltme elde etmek için PBS kullanarak olmayan seyreltilmiş kültür çözeltisi seri seyreltme gerçekleştirin. Agar-plakaları birinde yedi paralel eşit çizgiler çizin.
      1. üstten görünür olması için yeterli belirgin Petri kabı, alt yüzeyinde kalın çizgiler çizerek bunu yapın. bir segmentine olmayan seyreltilmiş çözeltinin 3 küçük damla damla. 1:10 seyreltme elde etmek için fosfat tamponlu salin (PBS) 9 ml olmayan sulandırılmış çözeltisi 1 ml.
   2. bir pipet ile bu yeni seyreltilmiş çözeltinin küçük bir kısım (~ 0.1 mi) almak ve bir sonraki bölüm 3 daha fazla küçük damla bırakın. yeni bir balona ve daha fazla seyreltilmiş on kat (10x) tarafından yeni seyreltilmiş çözüm aktarınPBS ekleyerek. Bu 10 ^-2 veya 1 seyreltme aşağı getiriyor: 100.
      1. Bir sonraki segmentte 100 çözüm: bu 1 kullanın. 1000 tüm yol: arka arkaya yeni şişelere aktarılması ve sürekli 10 ^-3 veya 1 den daha seyreltik örnekleri elde etmek PBS ile birlikte on kat (10x) seyreltilmesi o taze seyreltilmiş çözümlerin küçük hacimleri ile işlemek bu işlemi tekrarlayın geçen segmentine aşağı 10 ^-7 veya 01:10 milyon.
   3. 31 ° C'de 2 gün 1 - plaka inkübe edildikten sonra agar plakası içinde bulunan hücrelerin sayısını saymak için birim (CFU) plak sayısı koloni oluşturan gerçekleştirin. Bu sulandırılmamış örnekteki bakteri sayısının nicel ölçü verir.
      NOT: CFU değeri her koloni ayrı ve tek bir canlı mikrobiyal hücre tarafından kurulan olduğunu varsayarak besleyici ortam, sıcaklık ve zaman belirli koşullar altında koloniler meydana getirmesi sistemin kabiliyetine dayanan ölçülür.
   4. mühürfilmin kendi kendine kapanan ve mağaza gelecekteki kullanım için bir buzdolabı içinde aranan kalan petri tabaklarına konulur.

Yağış Hızlandırmak için Besin Zenginleştirilmesi 2. Protokol

1. Aktarım çok steril santrifüj tüplerine hazırlanan kültür sıvısı (hücreler + ortam) 9 mi, 10 ml hacim, her.
2. Üre: 2 g / L, amonyum klorür: taze ortam aşağıdaki konsantrasyonlarda dört bileşenden oluşan dış zenginleşme 100 ml stok çözelti hazırlayın, 1 g / L sodyum bikarbonat: 212 mg / L, kalsiyum klorür: 280 mg / L'dir. Dikkatli bir analitik terazi kullanılarak tüm malzemeyi ölçülmesi ve otoklav taze bir beher içinde, orta ve yer (121 ° C, 15 psi, 15 dk) ile tüm ama üre karıştırılır.
   1. Otoklav sonra, taze ortam 1 ml üre (2 mg), gerekli miktarda karıştırmak ve zenginleştirme işlemi tamamlamak için 0.22 um şırınga filtresi ile donatılmış bir şırınga içinden geçmektedir.
   2. 1 ekleHazırlanan kültür sıvısı (hücreler + ortam) 9 ml ihtiva eden steril santrifüj tüplerine katkı maddeleri ile, bu zenginleştirici ml (adım 2.1).
      Not: Tüm bu bileşenlerin, yüksek sıcaklıklarda bozunur olan üre, bir otoklav içinde sterilize edilemez. Diğer bileşenler otoklavlanmış sonra Böylece, (121 ° C, 15 psi, 15 dk), üre, 0.22 um'lik bir şırınga filtre ile en son eklenmektedir.
3. Vortex her tüp iyice mekanik bir vorteks cihazı kullanılarak. 30 ° C 'de olmayan bir çalkalama inkübatöründe zenginleştirilmiş sıvı (hücreler + ortam + katkı maddeleri) yerleştirin. yağış başlatılması için düzenli olarak tüm birimleri izleyin. çökeltme başlangıcı çıplak gözle tespit sonra hafif bir mikroskop kullanarak mikroskobik gözlemler başlar. deneylerin başlamasından itibaren 36 saat - Bu, genellikle 30 arasındadır.

Çok modlu Mikroskopi 3. Protokol

1. yüksek Magnificat sıvının küçük bir hacim (~ 1 mi) aktarmakiyon parlak bir alan modu ile ilk gözlemler yapmak için coverglass sistemi mikroskopisi odacıklı. Ile başlayan en düşük büyütme (4X) ile tüm gözlemleri başlatın. hangi kapsama alanı ve çökeltilerin dağılımı hakkında dolayısıyla küresel geniş bir bilgi alanı sağlar.
2. yağış önemli hacimlerde özellikle alanları seçin ve giderek büyütmeyi artırarak (20X, 40X, 60X) yakınlaştırmak.
   NOT: Düzgün (nedeniyle çok yakın kırılma endeksleri) Ekstrasellüler Polimer Madde parlak alanının altındaki (EPS) hücreleri gidermek için imkansız yana gerektiğinde, faz-kontrast modunu açın. Bu modda, (toplu hücre farklı bir faz olarak) hücre membranlarının sadece ana hatları böylece görsel farklılaşma sağlayan görebilir.
3. Son olarak, kırmızı ölü bileşenleri boyama yaparken seçici yeşil canlı bileşenleri boyalar Live / Dead leke bazı odaları leke. Standart protokollere ²⁸ Bakınız ^</ Sup>.
4. floresan modu anahtarı düzgün kırmızı ve yeşil bölgeler arasında ayrım. Kırmızı (540 Uyarma dalga boyu ile kırmızı filtre küp - 660 nm - 580 nm, 600 595 nm ve Bariyer filtre Dichroic ayna) - 480 nm Dichroic aynanın 440 Uyarma dalga boyu ile ve Yeşil (GFP Uzun-pass Yeşil filtre küp 510 nm) filtre küp 505 nm ve Bariyer filtresi floresan mikrograflar kolaylaştırmak için kullanılır.
5. Bir kez tüm multi-mode verileri mümkün olan en iyi kontrast ve netlik elde etmek için en iyi görüntü ve elle bindirme (bireysel aydınlık, faz-kontrast ve floresan görüntüleri) seçin, toplanmıştır.
6. Kristal yapıları anlamak için kurutulmuş katı numuneler üzerinde SEM gerçekleştirin. Bu köklü ve standart prosedürdür. ²² fonksiyonel gruplar (karbonatlar) kimyasal imzalarını tespit XPS gerçekleştirin. Bu aynı zamanda köklü ve standart prosedürdür. ²³

Sonuçlar

S. bir alkaliphile ²⁴ nispeten sert koşullar yaşayabilir olmaktan pasteurii. Yukarıda belirtilen kültür protokolü, S. takip edildiğinde pasteurii bakteri zaman (Şekil 2A) üzerinde kalsiyum karbonat çökelmesine yol açar, bir bölme içine yetiştirilir. Şekil 2 (b) kültür ortamı içinde, bakteriyel hücre popülasyonunun bir faz-kontrast optik mikroskopik bir görüntüsünü gösterir. Bireys...

Tartışmalar

Kritik Adımlar: Bu yazının S. uygulanabilir bir örneğini kültürü için detaylı protokolleri açıklar pasteurii. Kültür hazırlandılar sonra, uygun olarak zenginleştirilmiş olmalıdır. Uygun kimyasal ortamı sağlamak için bir başarısızlık ya çok uzun zaman ölçekleri yağış veya bunun tam eksikliği yol açar, çünkü bu deney başarısı için çok önemli bir adımdır. S. pasteurii birkaç dış ajanslar oldukça duyarlıdır ve biyokimyasal sağla...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC;1000ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80°C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium