Microbiologicamente induzida Calcita Precipitation Mediada por<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

Resumo

Protocols for microbiologically induced calcite precipitation (MICP) using the bacterium Sporosarcina pasteurii are presented here. The precipitated calcium carbonate was characterized through optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM). It is also shown that exposure to MICP increases the compressive strength of sponge.

Resumo

A bactéria em particular sob investigação aqui (S. pasteurii) é única em sua capacidade, sob as condições certas, para induzir a hidrólise da uréia (ureolysis) em que ocorre naturalmente ambientes através da secreção de uma enzima urease. Este processo de ureolysis, através de uma cadeia de reacções químicas, conduz à formação de precipitados de carbonato de cálcio. Isto é conhecido como microbiologicamente Induzida calcite Precipitação (MICP). Os protocolos de cultura adequados para MICP são detalhados aqui. Finalmente, as experiências de visualização sob diferentes modos de microscopia foram realizados para compreender vários aspectos do processo de precipitação. Técnicas como microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e X-Ray Photo-elétron Spectroscopy (XPS) foram empregadas para caracterizar quimicamente o produto final. Além disso, a capacidade destes precipitados para obstruir os poros no interior de um meio poroso natural foi demonstrado através de uma experiência qualitativa onde esponjabarras foram utilizadas para imitar uma poro de rede com uma gama de escalas de comprimento. Uma barra de esponja embebida em meio de cultura contendo as células bacterianas endurece devido ao entupimento dos seus poros resultantes do processo contínuo de precipitação química. Esta barra de esponja endurecida apresenta uma resistência superior quando comparada com uma barra de esponja de controlo que fica comprimido e espremido sob a acção de uma carga externa aplicada, enquanto a barra endurecida é capaz de suportar o mesmo peso com pouca deformação.

Introdução

Sporosarcina pasteurii é uma bactéria gram-positiva capazes de sobreviver em ambientes altamente alcalino (pH ~ 10) ^um e é uma das espécies de bactérias que podem tornar-se um agente causador de um fenómeno chamado microbiologicamente Induzida calcite Precipitação (MICP) ^2-4. MICP é um processo em que a precipitação de carbonato de cálcio é induzida por certos microorganismos sob condições ambientais adequadas. S. pasteurii assumiu importância nos últimos anos devido à sua identificação como possível agente para induzir volumes significativos de MICP sob certas condições. Esta possibilidade resulta do facto de S. pasteurii tem a capacidade única para secretar grandes quantidades de enzima urease. Esta enzima actua como um catalisador, que promove uma lise acelerada de ureia (um composto bioquímico que ocorre naturalmente com o fornecimento generalizada e abundante) na presença de moléculas de água. Através de uma cascata de reacções, neste processo finalLY conduz à geração de iões carbonato carregados negativamente. Estes iões, por sua vez, reagir com os iões de metal como cálcio positivos para finalmente formar precipitados de carbonato de cálcio (calcite); portanto, a etiqueta MICP ^5-9.

O processo de MICP foi conhecida e estudada por várias décadas ^10,11. Ao longo dos últimos anos, MICP foi investigado por uma ampla gama de engenharia e ambientais, incluindo a de baixo para cima construção verde ^12, melhoria de estruturas de grande escala ^13,14 e sequestro e armazenamento de carbono ^15,16.

Por exemplo, Cunningham et ^17. al projetado um reator de fluxo de temperatura moderada alta pressão contendo um núcleo de arenito Berea. O reactor foi inoculado com a bactéria S. fridgidimarina e sob condições de injecção de dióxido de carbono supercrítico de alta pressão, uma acumulação maciça de biomassa no interior do volume de poroumes foi observado, o que levou a uma redução superior a 95% da permeabilidade. Jonkers e Schlangen ¹⁸ estudaram o efeito de certas estirpes de bactérias especiais sobre o processo de auto-cura em concreto. água externa transportados para a rede de poros entrar através dos poros da superfície é esperado para ativar as bactérias dormentes que por sua vez ajudam a resistência estrutural via MICP. Tobler ¹⁹ et al. compararam a atividade ureolítica de S. pasteurii com um subterrâneas ureolítica microcosmo indígena sob condições que favorecem MCIP grande escala e descobriu que S. pasteurii tem uma capacidade consistente para melhorar a precipitação de calcita, mesmo quando as comunidades indígenas não tinham actividade da urease prévio. Mortensen ²⁰ et.al estudaram os efeitos de fatores externos, como o tipo de solo, a concentração de cloreto de amônio, salinidade, concentração de oxigênio e lise de células na MICP. Sua demonstração de que o processo de tratamento biológico é muito robusto com respect a uma grande variação no espaço de parâmetros substancia a aptidão deste processo para várias aplicações de reparação de grande escala proporcionado um processo de enriquecimento adequada para reforçar a bactéria é levada a cabo. Phillips et ^21. al concebido experimentos para estudar as alterações na permeabilidade e força de uma coluna de areia e um núcleo de arenito depois de ser injetado com S. culturas pasteurii. Eles descobriram que enquanto que a permeabilidade diminuída 2 - 4 vezes enquanto que a resistência à fractura aumentou três vezes.

S. pasteurii e seu papel na MICP são tópicos de pesquisa ativa e várias questões relacionadas com o mecanismo de precipitação química ainda não são totalmente compreendidos. À luz disto, é muito importante ter um conjunto de protocolos padronizados consistentes com precisão a cultura um estoque adequadamente enriquecida de S. pasteurii para alcançar MICP. Aqui, descrevemos um protocolo rigoroso, que irá garantir a repetibilidade ea reprodutibilidade. este manuscript descreve os protocolos detalhados para a cultura de S. pasteurii e adequadamente enriquecimento do meio de cultura para induzir a precipitação. O processo é investigada através de várias técnicas microscópicas, tais como óptica e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e X-Ray Photo-elétron Spectroscopy (XPS). O foco do manuscrito está no processo de MICP. Procedimentos como SEM e Sims, sendo os protocolos padrão bem conhecidos, não são descritos separadamente.

Protocolo

NOTA: Execute os protocolos experimentais na ordem descrita abaixo. O protocolo de cultura bacteriana é discutido na Seção 1 (ver também Figura 1). Secção 2 descreve o protocolo para o enriquecimento do meio de cultura utilizando aditivos externos. Seção 3 descreve os protocolos de microscopia multi-modo. Os pesos de todos os componentes individuais podem ser medida utilizando uma balança analítica. O volume de cada solução pode ser medida utilizando um cilindro volumétrico.

NOTA: Os protocolos de biossegurança adequadas devem ser seguidas para Seções 1 - 2. Consulte o escritório de segurança institucional para obter detalhes.

1. Cultura Bacteriana

1. Cultura das bactérias - plac Médio Preparação
   1. Montar equipamento e ingredientes, tais como placas de Petri, frasco, de base Tris, HCl, agar, água Millipore, pH-metro etc.Sterilize todos os recipientes em autoclave a 121 ° C antes da utilização.
   2. Prepare 1 L de 0,1solução aquosa 3 M de Tris-tampão por mistura de 15,75 g de base Tris com 1 L de água Millipore. Para diminuir o nível da solução original (pH 10,4) pH adicionar 2,800 mL de HCl (concentração 50%). Verificar continuamente por meio de um medidor de pH para ajustar o pH = 9.
   3. Dividir a solução tampão de 1 L em duas partes como se segue:
      1. Tome 800 ml desta solução. Divide-se igualmente em duas partes de 400 ml cada. Dissolve-se 8 g de (NH _{4) 2} SO ₄ a uma solução a 16 g de extracto de levedura para a outra solução.
      2. Aqui os restantes (200 ml de) solução e dividi-lo outra vez em duas partes de 100 ml cada. Misturar 2 g de (NH _{4) 2} SO ₄ a uma. Adicionar 4 g de extracto de levedura e 4 g de agar para o outro.
   4. Autoclave as 4 soluções separadamente após o acondicionamento dos respectivos frascos na folha de Al e aderindo fitas de autoclave.
      NOTA: Se uma unidade de bancada autoclave é utilizado, o volume deve ser ajustado para 500 ml (temperatura e pressão automáticocamente especificado como uma função do volume).
   5. Depois de levá-los para fora da autoclave, defina as duas soluções de 400 ml de lado para a etapa 1.3.1 (abaixo). Misturar as duas soluções de 100 ml de ter uma solução de 200 ml. Despeje a mistura em 10 - 12 placas de Petri.
2. Cultura das bactérias - a plac Preparação de amostras
   1. Remova o estoque bacteriana do congelador (-80 ° C) e deixe-o descongelar. Depois de descongelar corretamente, coloque o estoque de bactérias ea placa de agar dentro de uma capa de biossegurança.
   2. Seleccione a micropipeta de menor dimensão disponível (0,5-10 ul é uma boa escolha) para infestar a ponta com o estoque pasteurii Sporosarcina. Streak uma placa de agar com a ponta da micropipeta. Colocar a placa de agar estrias dentro de uma incubadora sem agitação a 31 ° C durante 48 h.
   3. Após 48 horas, retire a placa da incubadora e examinar visualmente a existência de colónias individuais. Se não houver colónias individuais, em seguida, coloque-o em tele incubadora por mais 24 horas.
   4. Repita o processo até que sejam detectadas colónias individuais. Não exceder 7 dias de julgamento.
      NOTA: Se colónias individuais não aparecem mesmo depois de uma semana, então concluiu-se que os passos não têm sido seguido de forma adequada e todo o processo deve ser repetido a partir do passo 1.
3. Cultura das bactérias - Amostra final de preparação
   1. Misturar as duas soluções de 400 ml (tampão de Tris + (NH _{4) 2} SO ₄ e tampão Tris + extracto de levedura (1.5.1) em conjunto para obter uma solução de 800 ml. Transferir 125 ml desta solução para um balão.
   2. Realizar um exame visual da superfície da placa de agar para identificar regiões com elevada concentração de colónias individuais. Gentilmente cutucar e quebrar uma das colônias com uma ponta de micropipeta.
   3. Mergulhar o mesmo ponta da micropipeta para o balão de 125 ml e agita-se cuidadosamente para garantir que esse número suficiente de células para multiplicação robusta ser transferido. Colocar o balão numa incubadora com agitação a 150 rpm, 30 ° C durante 2 - 3 dias. Após 2 - 3 dias, retirar o balão da incubadora.
4. Cultura das bactérias - Contagem de Células final
   1. Efectuar diluições em série da solução de cultura não diluídos utilizando PBS para atingir uma diluição de pelo menos dez milhões (10 ^-7) para assegurar colónias individuais aparecem contáveis. Desenhe sete linhas equidistantes paralelas sobre uma das ágar-placas.
      1. Para fazer isso, o desenho de linhas em negrito na superfície inferior da placa de Petri, proeminente suficiente para ser visível a partir de cima. Gota 3 pequenas gotas de solução não diluída em um segmento. Adicionar 1 ml de solução não diluída a 9 ml de tampão fosfato salino (PBS) para obter uma diluição de 1:10.
   2. Aqui uma pequena alíquota (~ 0,1 ml) desta solução recém diluiu-se com uma pipeta e soltar mais 3 gotas pequenas no próximo segmento. Transferir a solução recentemente diluído para um novo frasco e em seguida diluído dez vezes (10 x) deadicionando PBS. Isto reduz a diluição a 10 ^-2 ou 1: 100.
      1. Utilizar esta solução a 1: 100 no próximo segmento. Repita este processo com ele pequenos volumes de soluções recém-diluídas sucessivamente transferi-los para novos frascos e continuamente diluição de dez vezes (10x) em conjunto com PBS para obter mais e mais amostras diluídas de 10 ^-3 ou 1: 1000 todo o caminho até 10 ^{~ 7} ou 1:10 milhões no último segmento.
   3. Realizar Colony-Forming contagem de unidades (CFU) placa para contar o número de células presentes na placa de agar após incubação da placa durante 1 - 2 dias a 31 ° C. Isto dá uma medida quantitativa da contagem de bactérias na amostra não diluída.
      NOTA: O valor de CFU é medida com base na capacidade do sistema para dar origem a colónias de acordo com as condições específicas de meio nutriente, temperatura e tempo, assumindo que cada colónia é separada e fundada por uma única célula microbiana viável.
   4. Focaas placas de Petri com auto-vedante de filme e armazenar os itens restantes no frigorífico para uso futuro.

2. Protocolo para o enriquecimento de nutrientes para acelerar Precipitation

1. Transferência 9 ml de líquido de cultura preparado (células + meio) em vários tubos de centrífuga esterilizados, cada um de 10 ml de volume.
2. Prepara-se uma solução de 100 ml de caldo de enriquecimento externa que consiste em quatro componentes nas seguintes concentrações em meio fresco: Ureia: 2 g / L, cloreto de amónio: 1 g / L, bicarbonato de sódio: 212 mg / L, cloreto de cálcio: 280 mg /EU. Meça cuidadosamente todos os ingredientes em uma balança analítica e misturar tudo, mas ureia com meio fresco num copo e coloque em autoclave (121 ° C, 15 psi, 15 min).
   1. Após autoclave, misturar a quantidade necessária de ureia (2 mg) com 1 ml de meio fresco e passar através de uma seringa equipada com um filtro de seringa de 0,22? M para completar o processo de enriquecimento.
   2. Adicione 1ml deste meio de enriquecimento com aditivos para os tubos de centrífuga esterilizados contendo 9 ml de líquido de cultura preparado (células + meio) (ver passo 2.1).
      NOTA: De todos estes componentes, ureia sendo degradáveis, a temperaturas elevadas, não pode ser esterilizado em autoclave. Assim, após os outros componentes foram autoclavados (121 ° C, 15 psi, 15 min), a ureia é adicionada em último lugar através de um filtro de seringa de 0,22? M.
3. Vortex cada tubo, cuidadosamente, com um agitador mecânico. Colocar os líquidos enriquecidos (células + aditivos + médias) numa incubadora sem agitação a 30 ° C. Monitorar todas as unidades regularmente para o início da precipitação. Usando um microscópio de luz, uma vez que começam as observações microscópicas início da precipitação é detectada a olho nu. Isto é, geralmente, entre 30 - 36 h após o início das experiências.

3. Protocolo para Multi-Modo de Microscopia

1. Transferir um pequeno volume (~ 1 ml) de fluido para uma alta Magnífication sistema lamela microscopia de câmaras para realizar observações iniciais com o modo de campo claro. Para começar, iniciar todas as observações com o menor aumento (4X). que proporciona uma ampla área de cobertura e, por conseguinte, informação sobre a distribuição mundial de precipitados.
2. Selecione áreas específicas com volumes significativos de precipitação e zoom (20x, 40x, 60x), aumentando progressivamente a ampliação.
   NOTA: Uma vez que é impossível resolver adequadamente as células da substância polimérica extracelular (EPS) sob de campo brilhante (devido a índices de refração muito próximos), ligar o modo de contraste de fase, sempre que necessário. Neste modo, apenas os contornos das membranas celulares (sendo uma fase diferente da de células grandes quantidades) são visíveis, permitindo, assim, a diferenciação visual.
3. Finalmente, manchar algumas câmaras com mancha Live / Morto que tinge seletivamente os componentes vivos como verde, enquanto colorindo os componentes mortos em vermelho. Referem-se a protocolos padrão ^{28 <}/ Sup>.
4. Ligue o modo fluorescente para distinguir adequadamente entre as regiões vermelhas e verdes. Red (cubo de filtro vermelho com Excitação comprimento de onda de 540-580 nm, espelho dicróico de 595 nm e Barreira filtro de 600-660 nm) e (-pass longo GFP Verde cubo de filtro verde com Excitação comprimento de onda de 440-480 nm, espelho dicróico de 505 filtro nm e Barreira de 510 cubos nm) de filtro são usados ​​para facilitar micrografias fluorescentes.
5. Uma vez que todos os dados multi-modo foram recolhidas, selecionar as melhores imagens e sobreposição manualmente (brightfield indivíduo, de contraste de fase e imagens fluorescentes) para obter o melhor contraste e nitidez possível.
6. Realizar SEM nas amostras sólidas secas compreender estruturas cristalinas. Este é um procedimento bem estabelecido e padrão. ²² Realizar XPS para identificar assinaturas químicas dos grupos funcionais (carbonatos). Este é um procedimento bem estabelecido e padrão também. ²³

Resultados

S. pasteurii ser um Alcalifilo ²⁴ podem sobreviver a condições relativamente severas. Quando o protocolo de cultura acima mencionado é seguido, e S. pasteurii é cultivado dentro de uma câmara, as bactérias conduz à precipitação de carbonato de cálcio ao longo do tempo (Figura 2A). A Figura 2 (b) mostra uma imagem de contraste de fase microscópica óptica da população celular bacteriana dentro do meio de cultura. ...

Discussão

Passos críticos: Este manuscrito descreve em detalhes os protocolos para a cultura de uma amostra viável de S. pasteurii. Uma vez que a cultura foi preparado, ele deve ser apropriadamente enriquecido. Este é um passo chave essencial para o sucesso da experiência, pois uma falha para proporcionar o ambiente químico adequado leva a qualquer escala de tempo muito longos de precipitação ou de uma completa falta dela. S. pasteurii é bastante sensível a vários órgãos externos e d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petridish	Fisher Scientific	FB0875712	Petridishes being used as Agar plate
Pyrex Flasks	Fisher Scientific	S63268	Corning Erlenmeyer
Tris-Base	Promega	H5133	being used to make Tris-Buffer
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	H9892	1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture
Agar Powder	Sigma-Aldrich	A1296	microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder
Ammonium Sulphate	Sigma-Aldrich	A4418	for Molecular Biology
Yeast extract powder	Sigma-Aldrich	51475
Measuring Cylinder	Cole-Parmer	CP08559GC	Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk
Analytical Balance	OHAUS	AX124E	being used to measure weight of reagents
Autoclave	Brinkmann	58619000
Autoclave Tape	VWR	52428864
Aluminum Foil	Sigma-Aldrich	Z185140	being used to seal the flask before placing it in Autoclave
Bacterial Stock	Cedarlane	11859	-80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No.
Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume	Biohit	725010	Marketed by VWR under catalog number 14005976
Micropipette Tip	Fisher Scientific	212772B	Used for scratching Agar plates
Incubator	Binder	80079098	Microbiology Incubator,BF Series
Shaking Incubator	VWR	14004300	VWR Signature Benchtop Shaking Incubators
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P7059
BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device	BD Biosciences	357590	Marketed by VWR under catalog number 53106220
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793	Being used to seal Agar plates
Urea	Sigma-Aldrich	U1250	Enrichment for nutrient medium
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S8875	Enrichment for nutrient medium
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016	Enrichment for nutrient medium