بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

Summary

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Abstract

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Introduction

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

Protocol

يصف بروتوكول عزل الخلايا اللمفاوية من المواد البشرية المريض، وبالتالي يتطلب موافقة الأخلاقية. منحت الأعمال المنجزة في هذه الدراسة من قبل أوبسالا مجلس المراجعة الأخلاقية (DNR. 2013/387).

1. عزل الخلايا وحيدة النواة (الشركات المتعددة الجنسيات) من بلاطي اللوزتين الإنسان

وينبغي اعتبار جميع المواد غير المفروزة المنشأ البشري مثل الدم أو الأنسجة أو سوائل الجسم كمادة يحتمل أن تكون مصابة: تنبيه. لذا، ينبغي اتباع ممارسات السلامة الأحيائية الموصى بها لمعالجة الأنسجة البشرية.

ملاحظة: لتجنب التلوث، يجب على جميع الحلول ومعدات زراعة الخلايا تكون عقيمة. جميع مخازن والحلول يجب أن يكون قبل تبريده وأبقى على الجليد. يجب أن تبقى الأنسجة لوزة الحلق والخلايا المعزولة والتعامل معها على الجليد.

1. الحصول على اللوزتين جديدة من المرضى الذين يخضعون لاستئصال اللوزتين أو بضع اللوزة (الشكل 2). يغرق clum الأنسجةملاحظة في أنبوب 50 مل الطرد المركزي مليئة العقيمة هانكس محلول ملحي متوازن المثلج (HBSS) تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 10 ملي الجلوتامين، 0.05 ملغ / مل جنتاميسين و 1٪ مزيج مضادات الحيوية مضاد فطري (البنسلين، الستربتومايسين والامفوتريسين B).
2. إبقاء الأنابيب مع عينات الأنسجة لوزة دفينة في جميع الأوقات على الجليد. محاولة معالجة اللوزتين في أقرب وقت ممكن، وفي موعد لا يتجاوز 3 ساعات بعد الاستئصال الجراحي.
3. وضع لوزة على 60 ملم خلية من البلاستيك لوحة الثقافة على الجليد والحفاظ على نسيج مبلل مع HBSS. إزالة جلطات الدم مرئية، الدهنية والأنسجة الضامة مع ملقط نظيفة من سطح وزة.
4. استخدام جديدة 60 ملم لوحة خلية ثقافة تحتوي على 5 مل HBSS. قطع الأنسجة أجمة وزة إلى 3-10 ملم شظايا باستخدام زوج من مقص معقم و / أو مشرط.
5. إعداد الجديدة 60 ملم لوحة الثقافة خلية تحتوي على 10 مل من HBSS ووضع 100 ميكرون البلاستيكية مصفاة خلية في حل HBSS.
6. نقل ديسشظايا وزة ECTED في مصفاة الخلية مع ملقط معقم. باستخدام نهاية المكبس من حقنة بلاستيكية، ضغط بسلاسة شظايا الأنسجة من خلال مصفاة الخلية. تأكد من أن شظايا وزة مغمورة تماما في HBSS.
7. تجاهل مصفاة الخلية التي تحتوي على بقايا الأنسجة ونقل تعليق الخلية الناتجة عن 60 ملم لوحة خلية ثقافة إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي البلاستيك. ترك الأنبوب على الجليد، مع مواصلة العمل خطوات 1.8 و 1.9.
8. في حالة اللوزتين كبيرة، أكبر من 2 سم في حجم (الشكل 2)، ضغط على شظايا وزة في اثنين من مصافى الخلية لتجنب انسداد شبكة في مصفاة.
9. الحصول على الحجم النهائي من 35 مل من تعليق الخلية.
   ملاحظة: في هذه الخطوة فمن الممكن لإعداد تعليق خلية لحفظ البرودة (انظر القسم 2).
10. إضافة 10 مل من كثافة التدرج حل مثل Ficoll إلى الجديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي. تراكب بلطف suspens الخليةأيون (الخطوة 1.9) على رأس من الحل التدرج الكثافة. تجنب خلط تعليق خلية والحل التدرج الكثافة.
    ملاحظة: الحل التدرج الكثافة أن تكون درجة حرارة تصل إلى RT.
11. الطرد المركزي تعليق خلية في الدوار سوينغ بها في 700 x ج لمدة 20 دقيقة في RT. لا تنشيط وظيفة الفرامل على أجهزة الطرد المركزي كما الكبح سريع قد يؤدي التدرج. أيضا، استخدام أقل وظيفة تسريع المتاحة في أجهزة الطرد المركزي.
    ملاحظة: بعد هذه الخطوة الطرد المركزي، ومراقبة الشركات المتعددة الجنسيات باعتبارها طبقة رقيق أبيض في واجهة، وخلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، الخلايا الليفية والحطام الخلية كما الرواسب في قاع الأنبوب.
12. جمع بعناية طبقة الشركات المتعددة الجنسيات باستخدام 10 مل الماصة. ضع تعليق خلية في 50 مل جديد أنبوب الطرد المركزي.
13. إضافة 25 مل من PBS الجليد الباردة إلى تعليق خلية وتدور الأنبوب في 300 x ج لمدة 5 دقائق في الدوار سوينغ بها في 4 درجات مئوية.
14. إزالة طاف باستخدام الماصة 25 ملوكرر بيليه خلية خطوة الغسيل مرتين أخريين. أخيرا resuspend الكرية خلية في 15 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: بعد الخطوة غسل النهائي، فمن الممكن أن cryopreserve تعليق الخلية (انظر القسم 2).
15. تطبيق 10 ميكرولتر من تعليق خلية في الخلية عدادة الكريات غرفة عد وحساب عدد الخلايا تحت المجهر. الاستغناء عن كمية مناسبة من الخلايا (على سبيل المثال، 2-3 × 10 ⁷⁾ في أنبوب 15 مل الطرد المركزي لفصل لاحق حبة المغناطيسي. إبقاء هذه قسامة على الجليد حتى الخطوة 3.2.

2. الحفظ بالتبريد من الخلايا لوزي

1. إعداد تجميد المتوسطة (90٪ FBS و 10٪ DMSO) ويبقيه على الجليد. للتخزين على المدى الطويل حفاظ على وسائل الإعلام تجميد في -20 ° C.
2. تحديد العدد الكلي للخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا عدادة الكريات (الخطوة 1.15). حساب الكمية المطلوبة من المتوسط ​​تجميد وفقا لكثافة الخلايا المجمدة المطلوب (على سبيل المثال، 10 ^{7 الخلية}ق / مل من تجميد المتوسطة).
3. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق. صب طاف دون الإخلال بيليه الخلية و resuspend بيليه خلية في الجليد الباردة المتوسطة تجميد (من الخطوة 2.1).
4. الاستغناء 1 مل aliquots من تعليق خلية في قارورة معقمة مصممة للتخزين على المدى الطويل في النيتروجين السائل. تجميد قارورة في غرفة الأيسوبروبانول وتخزينها في -80 درجة CO / N. للحفاظ على المدى الطويل نقل قوارير في النيتروجين السائل التي تحتوي على خزان أو -140 ° C الفريزر الخلية.
5. لذوبان الجليد قارورة مع الخلايا المجمدة، تدفئة لهم بسرعة في 37 ° C حمام الماء. على الفور عند إذابة، تفريق تعليق خلية في 10 مل من قبل تحسنت HBSS (مع ملاحق، خطوة 1.1) في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تدور الأنبوب في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة HBSS و resuspend بيليه الخلية في كثافة الخلايا المطلوبة في HBSS (مع ملاحق، خطوة 1.1).
   ملاحظة: صلاحية AF الشركات المتعددة الجنسياتثالثا الذوبان هو من أهمية، حيث إن وجود الخلايا الميتة ويقلل من العائد النهائي من B تنقيته والخلايا اللمفية تي.
   ملاحظة: وفقا لتجربتنا في بقاء الخلية أقل من 80٪ ويقلل من كفاءة العزل الخلية.

3. إيجابي اختيار T الليمفاوية السكان من الشركات المتعددة الجنسيات لوزي

ملاحظة 1: يعتمد هذا البروتوكول على اختيار الإيجابية للالإنسان الخلايا الليمفاوية CD3 ⁺ T من الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية باستخدام الخرز المغناطيسي بالإضافة إلى الأجسام المضادة CD3. فمن الممكن أن يبدأ هذا القسم من جديد (القسم 1) أو المجمدة (القسم 2) الشركات المتعددة الجنسيات.

ملاحظة 2: ابدأ مع 3 × 10 ⁷ الشركات المتعددة الجنسيات. لا تتجاوز هذا الرقم الخليوي، منذ الأعمدة الانفصال قد تسد وهذا سوف يقلل من كفاءة العزل. استخدام الأعمدة أكبر إذا كان سيتم التعامل مع أكثر من الخلايا. وحدات التخزين المستخدمة في هذا البروتوكول تم الأمثل تجريبيا لعدد من الخلايا لناإد في الإعداد التجريبية لدينا.

1. إعداد المخزن المؤقت فصل [PBS (درجة الحموضة 7.2)، و 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 ملي EDTA]. تصفية المخزن المؤقت الانفصال من خلال 0.45 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. تدور تعليق الشركات المتعددة الجنسيات (الخطوة 1.14) في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. resuspend الكرية الناتجة الخلية في 240 ميكرولتر (80 ميكرولتر في 10 ^{7 خلايا)} من العازلة فصل الجليد الباردة. نقل تعليق الخلية في أنبوب معقم 2 مل.
3. إضافة 20 ميكرولتر من CD3 الأجسام المضادة المغناطيسي لحل الخلية. احتضان الأنابيب لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر لطيف للحفاظ على الخلايا في التعليق.
4. نقل عن لتعليق الخلية في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل الجليد الباردة عازلة فصل لغسل الخلايا.
5. أجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار سوينغ بها.
6. وفي الوقت نفسه تعيين ما يصل الفاصل المغناطيسي والعمود. إرفاق فاصل المغناطيسي لموقف ووضع عمود في separator. غسل العمود من خلال تطبيق 500 ميكرولتر من العازلة فصل الجليد الباردة. تجاهل التدفق من خلال.
7. وضع جديد أنبوب جمع 15 مل تحت العمود. الحفاظ على أنبوب جمع على الجليد.
8. تجاهل طاف (الخطوة 3.5) من خلال الماصة و resuspend بلطف بيليه الخلية في 500 ميكرولتر العازلة الفصل. تطبيق تعليق خلية على رأس العمود قبل غسلها والسماح لها من خلال تشغيل.
   ملاحظة: كتل الخلية قد يعوق العمود، وبالتالي يقلل من معدل التدفق. لمنع حدوث هذه المشكلة، ضع مصفاة الخلية البلاستيكية 40 ميكرون على رأس العمود. سوف تمر الخلايا من خلال هذه الشبكة تحسن كبير في كفاءة هذا الأسلوب.
9. غسل العمود 4 مرات مع 1.5 مل من العازلة الفصل (500 ميكرولتر لمدة 10 ⁷ الخلايا). انتظر الخزان العمود ليكون فارغا (يجب أن يلاحظ أي السائل في العمود) قبل تطبيق الخطوة غسل المقبلة.
   ملاحظة: الحصول على الخلايا غير المسماة CD3، تعتبر اللمفاويات B جزء، كما هيمزال في أنبوب جمع.
10. إزالة عمود من الفاصل والمكان إلى الجديد 15 مل أنبوب جمع. ماصة 2 مل من العازلة الفصل على العمود. باستخدام المكبس إمداده العمود أزل الخلايا الليمفاوية T اختيارها بشكل إيجابي، والتي تعتبر T اللمفاويات الكسر.
11. تحديد عدد الخلايا تنقيته (الخطوة 1.15) إذا لزم الأمر. تعليق خلية جاهزة الآن للتجارب المصب.

4. تحليل التدفق الخلوي من سكان المناطق المعزولة لوزي B والخلايا اللمفاوية T

تنبيه: الحل لامتصاص العرق هو مهيج ويشتبه مسرطنة. ارتداء ملابس واقية مناسبة، والقفازات، وحماية العين / الوجه.

ملاحظة 1: يصف هذا البروتوكول طريقة لتلطيخ المباشر للمعزولة B والخلايا T بواسطة الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS) التحليل. والغرض الرئيسي من هذه الخطوة هو تقييم نقاء زنزانة انفرادية السكان AFثالثا CD3 فصل الأجسام المضادة المغناطيسي. لهذا الغرض B ثابتة وعلامات خلية T،-fluorophore مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة CD20-FITC وCD2-APC، وتستخدم. كما ينصح بشدة إدراج الأجسام المضادة isotype السيطرة على التمييز بين "الخلفية" غير محددة ملزمة لCD2 وCD20 الأجسام المضادة (راجع الخطوة 4.8).

ملاحظة 2: من الممكن للحفاظ على الكسور خلية النقاء في امتصاص العرق 1٪ (PFA) حل في الظلام في 4 درجات مئوية حتى وقت تلطيخ (على سبيل المثال، في اليوم التالي). أيضا نفس الإجراء ينطبق إذا كان هناك فجوة زمنية بين تلطيخ وتحليل FACS. تذكر أنه في كلتا الحالتين يجب غسل الخلايا بشكل صحيح مع PBSA (PBS تحتوي على 0.2٪ BSA) العازلة، قبل تلطيخ أو تحليل FACS.

1. اخراج 6 × 10 ⁶ خلايا من الشركات المتعددة الجنسيات من الخطوة 1.15 (قبل تطبيق إلى العمود)، B اللمفاوية جزء من الخطوة 3.9 وT اللمفاويات جزء من الخطوة 3.10.
2. تدور الخليةتعليق في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ بها.
3. إزالة طاف مع الماصة وغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 1 مل من الجليد الباردة PBSA. تدور تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف مع الماصة و resuspend الخلايا في 600 ميكرولتر من الجليد الباردة PBSA العازلة.
4. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أسفل أنبوب FACS.
5. إضافة 100 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10٪ الحرارة المصل البشري المعطل لكل أنبوب، وتخلط جيدا واحتضان ل~ 1 دقيقة في RT أو 20 دقيقة على الجليد.
   ملاحظة: الخلايا الليمفاوية B تحمل مستقبلات لكرة القدم. من أجل منع التيسير مستقبلات يتم تحضين الكسور خلية النقاء مع 10٪ الحرارة المصل البشري المعطل. المصل البشري الحرارة المعطل من قبل الحضانة عند 56 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تقسيم المعطل المصل الحرارة إلى قسامات الصغيرة ومخزن المجمدة في -20 ° C.
6. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في جنوب غربالتدريجي جي الدوار.
7. إزالة طاف مع الماصة وغسل الخلية بيليه مع 1 مل PBSA. كرر الطرد المركزي (300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية).
8. إضافة 100 ميكرولتر PBSA في كل أنبوب على الجليد. إضافة كمية مناسبة من-fluorophore مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وفقا لتوصية الشركة الصانعة (على سبيل المثال، 20 ميكرولتر من مكافحة CD20 و / أو 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD2 في 100 ميكرولتر من PBSA). ملاحظة: لا تنس أن تعيين أنابيب سيطرة كافية لتحليل FACS. في هذا البروتوكول ينبغي أن تدرج الضوابط التالية: 1) الخلايا ملطخة مكافحة CD2 ومعاداة CD20 الأجسام المضادة بشكل فردي، 2) خلايا ملطخة مكافحة CD2 ومعاداة CD20 isotype السيطرة الأجسام المضادة بشكل فردي، و3) خلايا دون إضافة من الأجسام المضادة.
9. لفترة وجيزة دوامة أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
10. غسل 2 مرات مع PBSA. إضافة 2 مل من 1٪ PFA حل للعينات. دعونا لا تزال الخلايا في حل PFA في 476؛ C في الظلام حتى ذلك الوقت من تحليل FACS.
11. مباشرة قبل تشغيل عينات في الجهاز FACS، وغسل الخلايا 2 مرات مع PBSA (300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). عينات resuspend في 1 مل من برنامج تلفزيوني والحفاظ على 4 درجات مئوية (أو على الجليد)، محمية من الضوء، وذلك قبل فصل على قياس التدفق الخلوي.
12. هل الفرز FACS بعد بروتوكول من تدفق الكريات الشركة المصنعة.

5. كشف PCR من اتش DNA في عزل وزي B والخلايا اللمفاوية T

ملاحظة 1: اتش الاشعال الجينات hexon هي AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') وAdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. هذه البادئات تخلق amplicon من 139 سنة مضت. ويمكن الكشف عن المضيف 18S الريباسي الجينات مع الاشعال tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') وtp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3). حجم amplicon المتوقع هو 300 سنة مضت.

ملاحظة 2: كل PCRيشمل المدى لمراقبة سلبية (المقطر H ₂ O) والتحكم DNA الإيجابية التي تم الحصول عليها من خط الخلية B البشري (BJAB) مصاب نوع اتش البشري 5 ^12.

1. استخراج الحمض النووي (من لا يقل عن 1 × 10 ⁶ خلايا، خطوة 3.11) باستخدام غشاء السيليكا طريقة تنقية عمود أساس. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الفينول وغوانيدين ثيوسيانات حل ^13.
2. إضافة 100 نانوغرام DNA من B والخلايا اللمفية تي إلى خليط التفاعل التي تحتوي على 1X HF العازلة، 0.2 ملم من مزيج ثلاثي الفوسفات deoxynucleotide (dNTP)، 0.25 ميكرومتر لكل التمهيدي و1 U من عالية الدقة DNA البلمرة في الحجم الكلي لل20 ميكرولتر.
3. أداء PCR التضخيم في ظل الظروف الدراجات التالية: 30 ثانية تمسخ في 98 ° C، تليها 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، 67 ° C (hexon) أو 58 ° C (18S الريباسي) لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. انتهت تفاعل PCR مع خطوة التمديد النهائي من 7 دقيقة عند 72 ° C.
4. فصل الناتجة PCR amplifمنتجات ication على هلام الاغاروز 1.5٪ في 1X TBE العازلة وتصور العصابات التي يتوقعها تلطيخ مع وصمة عار الحمض النووي.

النتائج

في فصل فعال من نتائج الشركات المتعددة الجنسيات اللوزية فى فئة العالية النقاء من الخلايا الليمفاوية B و T. هذا ما أكده تحليل FACS باستخدام مكافحة CD20 ومكافحة CD2 الأجسام المضادة للكشف B والخلايا اللمفاوية T السكان، على التوالي (الشكل 3A). في المقابل، وفصل غير الفعال ?...

Discussion

واحدة من أهم العوامل التي تؤثر على نتائج هذا البروتوكول هو استخدام المواد اللوز الطازج كمادة البداية. ولذلك، ينبغي معالجة عينات وزة ضمن 3 ساعات بعد الجراحة. يمكن الحصول على اللوزتين من كل من البالغين والأطفال. المواد اللوزية من الأطفال هي عادة ما تكون أصغر بسبب الاست?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain