Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Riepilogo

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Abstract

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Introduzione

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

Protocollo

Il protocollo descrive l'isolamento di cellule linfoidi dal materiale umano paziente e richiede quindi l'approvazione etica. Il lavoro svolto in questo studio è stata concessa dalla Uppsala Ethical Review Board (DNR. 2013/387).

1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da umani Palatine Tonsille

ATTENZIONE: Tutto il materiale non schermati di origine umana come sangue, tessuti o fluidi corporei dovrebbe essere considerato come materiale potenzialmente infetto. Pertanto, pratiche di biosicurezza consigliate per la manipolazione dei tessuti umani devono essere seguite.

Nota: Per evitare contaminazioni, tutte le soluzioni e le attrezzature colture cellulari devono essere sterili. Tutti i tamponi e le soluzioni devono essere pre-raffreddati e tenuti in ghiaccio. Tessuti di tonsille e cellule isolate dovrebbero essere tenuti e gestiti su ghiaccio.

1. Ottenere tonsille fresche da pazienti sottoposti a tonsillectomia o tonsillotomia (Figura 2). Tuffatevi la Clum tessutips in un tubo da centrifuga da 50 ml contenente una soluzione sterile Hanks equilibrata sale ghiacciata (HBSS) supplementato con siero fetale bovino al 5% (FBS), glutammina 10 mM, 0,05 mg / ml di gentamicina e 1% mix antibiotici contro funghi (Penicillina, streptomicina e amfotericina B).
2. Tenere le provette con i campioni di tessuto tonsille sommersi in ogni momento sul ghiaccio. Provare per elaborare le tonsille nel più breve tempo possibile, e comunque entro 3 ore dopo la rimozione chirurgica.
3. Posizionare la tonsilla su una cella di plastica piastra di coltura 60 millimetri su ghiaccio e mantenere il tessuto inumidito con HBSS. Rimuovere coaguli di sangue visibili, adiposo e tessuto connettivo con una pinza pulita dalla superficie tonsille.
4. Utilizzare una nuova piastra di coltura cellulare 60 millimetri contenente 5 ml di HBSS. Tagliare il ciuffo tessuto tonsillare in 3-10 frammenti mm utilizzando un paio di forbici sterili e / o un bisturi.
5. Preparare una nuova piastra di coltura cellulare 60 mm contenente 10 ml di HBSS e posizionare un colino plastica cella 100 micron nella soluzione HBSS.
6. Trasferire i dissframmenti tonsillari rifletteva nel colino cella con una pinza sterile. Usando l'estremità stantuffo di una siringa di plastica, uniformemente spremere i frammenti di tessuto attraverso il filtro cella. Assicurarsi che i frammenti tonsillari sono totalmente immersi nel HBSS.
7. Eliminare il filtro cella con i resti di tessuto e trasferire la sospensione cellulare risultante dalla piastra di coltura cellulare 60 mm in un tubo di plastica da 50 ml centrifuga. Lasciare la provetta in ghiaccio mentre si procede con passo 1.8 e 1.9.
8. Nel caso di grandi tonsille, più grande di 2 cm (Figura 2), spremere i frammenti tonsille in due filtri cellulari per evitare l'intasamento della rete nel filtro.
9. Ottenere il volume finale di 35 ml di sospensione cellulare.
   Nota: A questo punto è possibile preparare la sospensione di cellule per la crioconservazione (vedere la sezione 2).
10. Aggiungere 10 ml di soluzione di gradiente di densità Ficoll come in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml. Sovrapporre delicatamente i suspens cellulariion (passo 1.9) sulla parte superiore della soluzione gradiente di densità. Evitare la miscelazione della sospensione cellulare e la soluzione gradiente di densità.
    Nota: La soluzione di gradiente di densità deve essere riscaldato a temperatura ambiente.
11. Centrifugare la sospensione cellulare in un rotore incernierato a 700 xg per 20 minuti a RT. Non attivare la funzione di freno alla centrifuga come frenata veloce può interrompere il gradiente. Inoltre, utilizzare la funzione di accelerazione più basso sul centrifuga.
    Nota: Dopo questo passo centrifugazione, osservare multinazionali come uno strato bianco soffice all'interfaccia, e globuli rossi (RBC), fibroblasti e detriti cellulari come il sedimento sul fondo della provetta.
12. Raccogliere accuratamente lo strato multinazionali utilizzando una pipetta da 10 ml. Posizionare la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 ml.
13. Aggiungere 25 ml di PBS ghiacciato alla sospensione cellulare e girare il tubo a 300 xg per 5 minuti in un rotore incernierato a 4 ° C.
14. Rimuovere il surnatante con una pipetta 25 mle ripetere pellet cellulare lavaggio passo altre due volte. Infine risospendere il pellet cellulare in 15 ml di PBS.
    Nota: Dopo la fase di lavaggio finale, è possibile crioconservare la sospensione cellulare (vedi capitolo 2).
15. Applicare 10 ml di sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule emocitometro e contare il numero di cellule al microscopio. Distribuire la quantità appropriata di cellule (ad esempio, 2-3 x 10 ⁷⁾ in una provetta da 15 ml per centrifuga successiva separazione magnetica tallone. Tenere questo aliquota in ghiaccio fino al punto 3.2.

2. La crioconservazione delle cellule tonsillare

1. Preparare medio di congelamento (90% FBS e il 10% DMSO) e tenerlo in ghiaccio. Per la conservazione a lungo termine mantenere i mezzi di comunicazione di congelamento a -20 ° C.
2. Determinare il numero totale di cellule utilizzando una camera di conteggio cellulare emocitometro (passo 1.15). Calcolare la quantità di terreno necessaria congelamento secondo la densità cellulare congelato desiderata (ad esempio, 10 ⁷ cellules / ml di media di congelamento).
3. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet cellulare in mezzo congelamento ghiacciato (dal punto 2.1).
4. Dispensare 1 ml aliquote della sospensione cellulare in fiale sterili progettati per lo stoccaggio a lungo termine in azoto liquido. Congelare le fiale in una camera isopropanolo e conservarli a -80 ° CO / N. Per la conservazione a lungo termine trasferire le fiale in azoto liquido contenente serbatoio o di una cella freezer -140 ° C.
5. Per scongelare fiale con cellule congelate, li riscaldare rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ° C. Immediatamente quando scongelato, disperdere la sospensione cellulare in 10 ml di pre-riscaldato HBSS (con supplementi, punto 1.1) in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin il tubo a 300 xg per 5 min, rimuovere HBSS e risospendere il pellet cellulare alla densità cellulare desiderato in HBSS (con supplementi, punto 1.1).
   Nota: La vitalità della multinazionali after scongelamento è di importanza, in quanto la presenza di cellule morte diminuisce la resa finale purificata B e T linfociti.
   Nota: Secondo la nostra esperienza la vitalità cellulare meno 80% ridurrà l'efficienza isolamento delle cellule.

3. selezione positiva di T linfociti Popolazione da tonsillare multinazionali

Nota 1: Questo protocollo si basa sulla selezione positiva di umani linfociti ^T CD3 + da multinazionali tonsillari utilizzando sfere magnetiche accoppiate per l'anticorpo CD3. E 'possibile iniziare questa sezione dal fresco (sezione 1) o congelati (sezione 2) multinazionali.

Nota 2: Iniziare con 3 x 10 ⁷ multinazionali. Non superare questo numero di cellulare, dal momento che le colonne di separazione possono intasare e questo ridurrà l'efficienza di isolamento. Utilizzare le colonne più grandi se verranno trattati più celle. I volumi utilizzati in questo protocollo sono state sperimentalmente ottimizzati per il numero di cellule uscato nel nostro setup sperimentale.

1. Preparare il tampone di separazione [PBS (pH 7,2), lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA]. Filtrare il tampone di separazione attraverso un filtro da 0,45 micron e conservare a 4 ° C.
2. Spin sospensione PTM (passo 1.14) a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere il pellet risultante cellule in 240 microlitri (80 microlitri per 10 ⁷ cellule) di tampone di separazione ghiacciato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 2 ml.
3. Aggiungere 20 ml di anticorpo CD3 magnetica alla soluzione cellulare. Incubare le provette per 1 ora a 4 ° C con continua miscelazione delicata per mantenere le cellule in sospensione.
4. Trasferire tutto di sospensione cellulare in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di tampone di separazione ghiacciata per lavare le cellule.
5. Centrifugare la provetta a 300 xg per 10 min a 4 ° C in un rotore incernierato.
6. Nel frattempo, impostare il separatore magnetico e di colonna. Fissare il separatore magnetico per il supporto e posizionare la colonna nel SEPARator. Lavare la colonna applicando 500 ml di buffer di separazione ghiacciato. Gettare il flusso attraverso.
7. Inserire un nuovo tubo di raccolta 15 ml sotto la colonna. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio.
8. Eliminare il surnatante (passo 3,5) di pipetta e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 500 microlitri tampone di separazione. Applicare la sospensione cellulare sulla sommità della colonna pre-lavata e farlo funzionare attraverso.
   Nota: grumi di cellule possono ostruire la colonna e ridurre la portata così. Per evitare questo problema, inserire un filtro cella 40 micron plastica sulla parte superiore della colonna. Passando le cellule attraverso la maglia sarà altamente migliorare l'efficienza di questo metodo.
9. Lavare la colonna 4 volte con 1,5 ml di tampone di separazione (500 microlitri per 10 ⁷ cellule). Attendere il serbatoio colonna vuota (nessun liquido dovrebbe essere osservato nella colonna) prima di applicare il lavaggio successivo passo.
   Nota: Ottenere le cellule CD3 non marcati, considerati come frazione di linfociti B, in quanto sonoeluito nel tubo di raccolta.
10. Rimuovere la colonna dal separatore e posto in un nuovo tubo di raccolta da 15 ml. Pipettare 2 ml di tampone di separazione nella colonna. Utilizzando il pistone in dotazione con la colonna eluire i linfociti T selezionati positivamente, che sono considerati come la frazione di linfociti T.
11. Determinare il numero di cellule purificate (passo 1.15) se necessario. Sospensioni cellulari sono ora pronti per esperimenti a valle.

4. Citometria a flusso Analisi dei isolata tonsillare linfociti B e T

ATTENZIONE: soluzione Paraformaldeide è irritante e sospetto cancerogeno. Indossare indumenti protettivi, guanti e proteggersi gli occhi / la faccia.

Nota 1: Questo protocollo descrive il metodo per la colorazione diretta del B isolata e le cellule T per fluorescenza cellulare Attivato Ordinamento (FACS) analisi. Lo scopo principale di questa fase è quello di valutare la purezza della cella isolata popolazioni after CD3 anticorpo separazione magnetica. A tal fine stabilito B e marcatori di cellule T, si utilizzano anticorpi monoclonali fluoroforo coniugato CD20-FITC e CD2-APC. Anche l'inserimento di anticorpi di controllo isotipo è altamente raccomandato per distinguere la non specifico "sfondo" legame di anticorpi CD2 e CD20 (vedi punto 4.8).

Nota 2: E 'possibile mantenere le frazioni cellulari purificate in paraformaldeide 1% di soluzione (PFA) al buio a 4 ° C fino al momento della colorazione (ad esempio, il giorno dopo.). Anche la stessa procedura è applicabile se esiste un intervallo di tempo tra la colorazione e l'analisi FACS. Ricorda che in entrambi i casi le cellule devono essere lavati correttamente con PBSA (PBS contenente 0,2% di BSA) tampone, prima della colorazione o l'analisi FACS.

1. Estrarre 6 x 10 ^{6 cellule} delle multinazionali dal punto 1.15 (prima di applicare alla colonna), frazione di linfociti B dal punto 3.9 e la frazione di linfociti T a partire dal punto 3.10.
2. Spin la cellasospensioni a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C con un rotore swing-out.
3. Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare una volta con 1 ml di ghiacciata PBSA. Spin le sospensioni cellulari a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante con pipetta e risospendere il cellule in 600 ml di tampone PBSA ghiacciato.
4. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare al fondo di un tubo FACS.
5. Aggiungere 100 ml di PBS contenente il 10% di calore siero umano inattivato a ciascuna provetta, mescolare bene e incubare per ~ 1 minuti a temperatura ambiente oppure 20 minuti in ghiaccio.
   Nota: i linfociti B trasportano recettori Fc. Per bloccare il recettori Fc frazioni cellulari purificate sono incubati con 10% di siero umano inattivato al calore. Il siero umano inattivato al calore è da incubazione a 56 ° C per 1 ora. Dividete il calore siero inattivato in piccole aliquote e conservare congelati a -20 ° C.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C in un swing-out rotore.
7. Rimuovere il surnatante con pipetta e lavare il pellet cellulare con 1 ml PBSA. Ripetere la centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C).
8. Aggiungere 100 microlitri PBSA in ciascun tubo in ghiaccio. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo monoclonale coniugato fluoroforo, secondo la raccomandazione del costruttore (ad esempio, 20 ml di anti-CD20 e / o 5 ml di anticorpi anti-CD2 in 100 ml di PBSA). Nota: Non dimenticare di assegnare provette di controllo sufficienti per l'analisi FACS. In questo protocollo dovrebbero essere inclusi i seguenti controlli: 1) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 individualmente, 2) cellule colorate con gli anticorpi anti-CD2 e anti-CD20 controllo isotipico singolarmente e, 3) celle senza aggiunta di anticorpi.
9. Brevemente vortice la provetta e incubare per 30 min a 4 ° C al buio.
10. Lavare 2 volte con PBSA. Aggiungere 2 ml di soluzione all'1% PFA ai campioni. Lasciare le cellule rimangono nella soluzione PFA al 476; C al buio fino al momento dell'analisi FACS.
11. Immediatamente prima di eseguire i campioni nella macchina FACS, lavare le cellule 2 volte con PBSA (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Campioni risospendere in 1 ml di PBS e mantenere a 4 ° C (o su ghiaccio), protetto dalla luce, prima della separazione sul citometro a flusso.
12. Fare l'ordinamento FACS secondo il protocollo del citofluorimetro produttore.

5. PCR individuazione del DNA Adenovirus in isolati tonsillare linfociti B e T

Nota 1: Le adenovirus hexon primer gene sono AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') e AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Questi primer generano un amplicone di 139 bp. Il padrone di casa gene 18S rRNA può essere rilevato con primer tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') e TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). La dimensione prevista amplicone è di 300 bp.

Nota 2: Ogni PCRcorsa comprende un controllo negativo (distillata H _{2 O)} e un controllo DNA positivo ottenuto da linea di cellule B umane (BJAB) infettate con il tipo di adenovirus umano 5 ^12.

1. Estrarre il DNA (da almeno 1 x ¹⁰ 6 cellule, passo 3.11) con membrana silicea metodo di purificazione basato su colonne. Estrarre RNA utilizzando fenolo e guanidina isotiocianato soluzione ^13.
2. Aggiungere 100 ng di DNA da linfociti B e T di una miscela di reazione contenente tampone 1x HF, 0,2 mM di mix trifosfato di deossinucleotide (dNTP), 0,25 mM di ciascun primer e 1 U di alta fedeltà polimerasi DNA in un volume totale di 20 microlitri.
3. Eseguire amplificazione PCR con le seguenti condizioni di ciclo: 30 sec di denaturazione a 98 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 10 sec, 67 ° C (hexon) o 58 ° C (18S rRNA) per 30 sec e 72 ° C per 30 sec. La reazione di PCR è stata conclusa con un passo estensione finale di 7 min a 72 ° C.
4. Separare il conseguente amplif PCRprodotti icazione su un gel di agarosio 1,5% in TBE 1x tampone e visualizzare le bande previsti dalla colorazione con colorante acido nucleico.

Risultati

Una separazione efficace dei tonsillari MNC risultati in sottopopolazioni altamente purificate di linfociti B e T. Ciò è stato confermato mediante analisi FACS utilizzando anti-CD20 e anti-CD2 per rilevare B T linfociti popolazioni, rispettivamente (Figura 3A). Al contrario, una separazione efficiente di MNC risultati in frazioni cellulari che sono una miscela di cellule di entrambe le sottopopolazioni di linfociti B e T (Figura 3B).

Il linfociti T

Discussione

Uno dei fattori più importanti che influenzano il risultato di questo protocollo è l'uso di materiale fresco tonsillare come materiale di partenza. Pertanto, i campioni di tonsille devono essere trattati entro 3 ore dopo l'intervento chirurgico. Tonsille possono essere ottenuti da adulti e bambini. Il materiale tonsillare dai bambini è di solito più piccoli a causa della rimozione chirurgica parziale delle tonsille (tonsillotomy). Pertanto, il numero di multinazionali ottenuti da campioni tonsillotomia (1 x ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain