İnsan Palatine Bademcikler B ve T Lenfosit için Verimli İzolasyon Protokolü

Özet

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Özet

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Giriş

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

Protokol

Protokol, insan hasta malzemeden lenfoid hücrelerin izolasyonu açıklar ve bu nedenle etik onayı gerekiyor. Bu çalışmada yapılan çalışmalar Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (DNR. 2013/387) tarafından verildi.

İnsan Palatine Bademcikler dan Mononükleer Hücreleri (ÇUŞ) 1. İzolasyonu

UYARI: kan, doku veya vücut sıvıları gibi insan kaynaklı tüm elenmemiş malzeme potansiyel enfekte materyal olarak kabul edilmelidir. Bu nedenle, insan dokuları işlemek için önerilen biyogüvenlik uygulamaları takip edilmelidir.

Not: kontaminasyonunu önlemek için, her çözeltiler ve hücre kültürü ekipmanları steril olması gerekmektedir. Tüm tamponlar ve solüsyonlar önceden soğutulmuş ve buz üzerinde tutulmalıdır. Tonsil dokular ve izole hücreler tutulur ve buz üzerinde tutulmalıdır.

1. Tonsillektomi veya tonsillotomy (Şekil 2) uygulanan hastalarda taze bademcikler edinin. Doku clum Plunge% 5 fetal sığır serumu (FBS), 10 mM Glutamin, 0,05 mg / gentamisin ve% 1 antibiyotik antimikotik karışımı ml (penisilin buz soğukluğunda steril Hanks ile dengelenmiş tuz çözeltisi (HBSS) ile dolu bir 50 ml'lik santrifüj tüpüne ps Streptomisin ve Amfoterisin B).
2. Buz üzerinde her zaman batık bademcik dokusu örnekleri ile tüpleri tutun. En kısa sürede bademcik işlemek için çalışın, ve en geç cerrahi müdahaleden sonra 3 saat daha.
3. Buz üzerinde 60 mm plastik hücre kültür plaka üzerinde bademcik yerleştirin ve HBSS ile nemlendirilmiş doku tutun. Bademcik yüzeyinden temiz bir forseps ile görünür kan pıhtılarını, yağlı ve bağ dokuları çıkarın.
4. 5 ml HBSS içeren yeni 60 mm hücre kültürü plakası kullanın. Makas ve / veya bir neşter steril bir çifti kullanılarak 3-10 mm parçalara bademcik dokusu yığın kesin.
5. HBSS 10 ml içeren yeni 60 mm hücre kültürü tabak hazırlayın ve HBSS çözeltisi içinde 100 mikron plastik hücre süzgeç yerleştirin.
6. Diss aktarınSteril forseps ile hücre süzgecinden içine yansıtılmaktadır bademcik fragmanları. Plastik şırınga pistonu ucunu kullanarak, sorunsuz hücre süzgecinden doku parçaları sıkın. Bademcik fragmanları tamamen HBSS dalmış emin olun.
7. Doku kalıntıları hücre süzgecinden atın ve bir 50 ml plastik bir santrifüj tüpüne 60 mm hücre kültür plakasından elde edilen hücre süspansiyonu aktarın. Adımlar 1.8 ve 1.9 ile devam ederken buz üzerinde tüp bırakın.
8. Büyük bademcikler durumunda, boyutu 2 cm'den büyük (Şekil 2), süzgeç örgü tıkanmasını önlemek için iki hücre süzgeçler de bademcik parçaları sıkın.
9. Hücre süspansiyonu 35 ml'lik nihai hacim elde edilir.
   Not: Bu aşamada, dondurarak saklama (bakınız bölüm 2) hücre süspansiyonu hazırlamak mümkündür.
10. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne Ficoll gibi yoğunluk gradyan çözeltisi 10 ml ekleyin. Yavaşça hücre Suspens bindirmeİyon yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine (aşama 1,9). Hücre süspansiyonu ve yoğunluk dereceli çözeltisinin karıştırılması kaçının.
    Not: yoğunluk gradyan çözeltisi, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı gerekir.
11. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 700 xg'de bir salıncak-out rotor hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Degrade bozabilir hızlı frenleme olarak santrifüj fren işlevini etkinleştirmek etmeyin. Ayrıca, santrifüj mevcut olan en düşük ivme işlevini kullanın.
    Not: Bu santrifüj aşamasından sonra, tüpün alt kısmında tortu bir ara yüzeyde kabarık beyaz tabaka ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC), fibroblastlar ve hücre kalıntıları olarak ÇUŞ'larına dikkate alınmalıdır.
12. Dikkatlice 10 ml pipet kullanarak ÇUŞ'ları katmanı toplamak. Yeni bir 50 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu yerleştirin.
13. Hücre süspansiyonuna buz soğukluğunda PBS 25 ml ilave edilir ve 4 ° C 'de dışarı salınan bir rotor 5 dakika boyunca 300 x g'de tüp spin.
14. 25 ml'lik bir pipet kullanarak süpernatantıve hücre pelet yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, PBS, 15 ml hücre pelletini.
    Not: Son yıkama aşamasından sonra, hücre süspansiyonu (bakınız bölüm 2) cryopreserve mümkündür.
15. Hemositometre hücre sayım bölmesi içinde hücre süspansiyonu 10 ul uygulayın ve bir mikroskop altında hücre sayısını. Hücreler uygun miktarda dağıtın (örneğin, 2-3 x 10 ⁷⁾ takip eden manyetik boncuk ayrılması için bir 15 ml'lik santrifüj tüpüne. Adım 3.2 kadar buz üzerinde bu kısım tutun.

Tonsil Hücre 2. Kryoprezervasyon

1. Donma orta (% 90 FBS ve% 10 DMSO) hazırlayın ve buz üzerinde tutmak. Uzun süreli depolama için -20 ° C'de donma medyayı tutmak.
2. Bir hemositometre hücre sayım odasını (adım 1.15) ile hücrelerin toplam sayısını belirler. İstenen donmuş hücre yoğunluğuna göre dondurma orta gerekli miktarını hesaplayın (örneğin, 10 ^{7 hücre}s dondurma ortamı / ml).
3. 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Hücre topaklarını bozmadan süpernatantı boşaltacaktır ve (aşama 2.1) buz gibi soğuk dondurma ortamı içinde hücre pelletini.
4. Sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolama için tasarlanmış steril şişelere hücre süspansiyonu 1 ml'lik numuneler koyun. Bir izopropanol odasında şişeleri dondurun ve -80 ° CO / N saklayın. Uzun süreli korunması için depolama tankı veya -140 ° C hücre dondurucu içeren bir sıvı azot içine şişeleri aktarın.
5. Dondurulmuş hücreler şişeleri çözülme için, 37 ° C su banyosu içinde hızla onları sıcak. Çözülmüş hemen zaman (takviyeleri ile 1.1 adım a) önceden ısıtılmış HBSS 10 ml hücre süspansiyonu dispers 15 ml santrifüj tüpüne. (1.1 adım takviyeleri ile), 5 dakika boyunca 300 x g'de tüp Spin HBSS çıkarın ve HBSS, istenen hücre yoğunluğuna hücre pelletini.
   Not: ÇUŞ af canlılığınıter çözme Ölü hücrelerin varlığı saflaştınldı B ve T lenfositleri nihai verim düşecektir, önem taşımaktadır.
   Not: hücre izolasyon verimi azaltacaktır hücre canlılığı az% 80 daha sonra bizim deneyim göre.

Tonsil ÇUŞ'larının T Lenfosit Nüfus 3. Pozitif Seçimi

Not 1: Bu protokol, CD3 antikoru bağlanmış manyetik boncuklar kullanılarak Tonsiller çok uluslu insan ^CD3 + T lenfositlerinin pozitif seçimi dayanmaktadır. Taze (Bölüm 1) veya dondurulmuş (Bölüm 2) çok uluslu şirketler bu bölümü başlatmak mümkündür.

Not 2: 3 x 10 ⁷ uluslu şirketler ile başlayın. Ayırma sütunları tıkayabilir ve bu izolasyon verimi azaltacaktır çünkü, bu hücre sayısı aşmayın. Daha fazla hücre ele alınacak olursa büyük sütunları kullanın. Bu protokolde kullanılan hacimleri deneysel hücrelerin bize sayısı için optimize edilmiştirBizim deneysel kurulum ed.

1. Ayırma tamponu [PBS (pH 7.2),% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA] hazırlayın. 4 ° C'da bir 0.45 um filtre ve mağaza boyunca ayırma tamponu filtre.
2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de ÇUŞ'ları süspansiyonu (basamak 1,14) dönerler. Buz soğukluğunda ayırma tamponu 240 ul ile sonuçlanan hücre pelletini (10 ⁷ hücre başına 80 ul) yeniden süspanse edin. Steril 2 ml'lik bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın.
3. Hücre çözeltisine, CD3 manyetik antikorun 20 ul ekle. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin durumda tutmak için sürekli hafifçe karıştırılarak, 4 ° C 'de 1 saat süre ile inkübe edin.
4. Hücreleri yıkamak için 5 mi, buzla soğutulmuş ayırma tamponu ihtiva eden 15 ml'lik bir tüp içine hücre süspansiyonu her aktarın.
5. Dışarı salınan bir rotor, 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin tüp.
6. Bu arada manyetik ayırıcı ve sütun kurdu. Stand manyetik ayırıcı takın ve Separ sütun yerator. Buz soğukluğunda ayırma tamponu 500 ul uygulayarak sütun yıkayın. Akışını atın.
7. Sütunun altında yeni bir 15 ml toplama tüpü yerleştirin. Buz üzerinde toplama tüpü bulundurun.
8. Pipet ile süpernatantı (adım 3.5) atın ve yavaşça 500 ul ayırma tampon içinde hücre pelletini. Önceden yıkanmış sütunun üstüne hücre süspansiyonu uygulayın ve içinden çalıştırın.
   Not: Hücre kümeleri sütun yapışmasına neden olabilir ve bu şekilde akış hızını azaltabilir. Bu sorunu önlemek için, kolonun tepesinde bir 40 um plastik hücre süzgeci yerleştirin. Bu örgü sayesinde hücreleri Passing çok bu yöntemin etkinliğini artıracaktır.
9. Ayırma tamponu, 1.5 ml (10 ⁷ hücreleri için 500 ul) ile sütun 4 kez yıkayın. Bir sonraki yıkama adımı uygulamadan önce (hiçbir sıvı sütununda dikkat edilmelidir) boş sütun rezervuar bekleyin.
   Not: B lenfosit kısmıyla olarak kabul CD3 etiketsiz hücreleri elde, oldukları gibitoplama tüpüne yıkandı.
10. Yeni 15 ml toplama tüpüne ayırıcı ve yerden sütun çıkarın. Pipet kolonuna ayırma tamponu 2 mi. T lenfosit fraksiyonu olarak kabul edilmektedir olumlu seçilmiş T lenfositleri, Zehir sütununda verilen piston kullanma.
11. Saflaştırılmış hücreler (adım 1.15) Gerekirse sayısını belirler. Hücre süspansiyonları, artık aşağı doğru deneyler için hazırdır.

İzole 4. Akım Sitometri Analizi Tonsil B ve T Lenfositler

DİKKAT: Paraformaldehit çözüm tahriş edici ve kanserojen olabilir. Çalışırken uygun koruyucu giysi, eldiven ve göz / yüz koruyucusu kullanın.

Not 1: Bu protokol (FACS) analizi Kontrol THP izole edilmiş B ve T hücrelerinin doğrudan boyanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu adımın amacı popülasyonları af izole hücre saflığını değerlendirmek içinter CD3 manyetik antikor ayırma. Bu amaçla kurulan B ve T hücre belirteçleri için fluorofor konjuge monoklonal antikorlar CD20-FITC ve CD2-APC kullanılır. Ayrıca izotip kontrol antikorları dahil yüksek CD2 ve CD20 antikorlarının (adım 4.8) arasında spesifik olmayan bağlanma "arka plan" ayırt önerilir.

Not 2: Bu boyama zamanına kadar 4 ° C 'de bir% 1 paraformaldehid içinde karanlıkta (PFA) çözeltisi saflaştırılmış hücre fraksiyonları tutmak mümkündür (örneğin, ertesi gün).. Boyama ve FACS analizi arasında bir zaman boşluğu olduğu takdirde de aynı prosedür uygulanabilir. Her iki durumda da hücreler PBSA lekelenme veya FACS analizi öncesinde tamponu (PBS% 0.2 BSA ihtiva eden) ile düzgün yıkanmalıdır unutmayın.

1. Adım 3.10 aşama 3.9 ve T lenfosit fraksiyonu, B lenfosit kısmını (önceki sütuna uygulamadan) aşama 1.15 den çok uluslu şirketler 6 ^x 10 6 hücre çıkar.
2. Hücreyi Spindışarı salınan bir rotor kullanılarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de süspansiyonlar.
3. Pipetle Süpernatantı ve buz gibi soğuk PBSA'da 1 ml ile bir kez hücre pelet yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonları dönerler. Pipetle Süpernatantı ve tekrar süspansiyon buz soğukluğunda PBSA tampon 600 ul hücre.
4. FACS tüpün alt hücre süspansiyonu 100 ul ekle.
5. PBS, her tüpe,% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ihtiva eden 100 ul eklenir, iyice karıştırılır ve oda sıcaklığında ~ 1 dakika veya buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
   Not: B lenfositleri Fc reseptörleri taşıyan. Fc bloke etmek için saflaştırılmış hücre fraksiyonları% 10 ısı ile inaktive edilmiş insan serumu ile inkübe edilir reseptörleri. Insan serumu, 1 saat boyunca 56 ° C'de inkübe edilerek inaktive ısıdır. -20 ° C'de dondurulur, küçük kısımlar ve mağaza, ısı ile inaktive edilmiş serum bölün.
6. Bir sw 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj hücre süspansiyonuing-out rotor.
7. Pipetle Süpernatantı ve 1 ml PBSA'da hücre pelet yıkayın. Santrifüj (4 ° C 'de 5 dakika süre ile 300 x g) tekrarlayın.
8. Buz üzerinde, her bir tüpe 100 ul PBSA ekleyin. Üreticinin tavsiyesine göre, florofor konjuge monoklonal antikorun uygun miktarda ekleme (örneğin, anti-CD20 20 ul ve / veya albümin 100 ul anti-CD2 antikorlarının 5 ul). Not: FACS analizi için yeterli kontrol tüpleri atamak unutmayın. Bu protokol, aşağıdaki kontroller dahil edilmelidir: ayrı ayrı anti-CD2 ve anti-CD20 antikorlar ile boyandı 1) hücreler, ek olarak bireysel olarak, anti-CD2 ve anti-CD20 izotip kontrol antikorları ve 3) hücreleri ile boyanmış 2) hücreleri Antikorların.
9. Kısaca tüp vorteks ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
10. PBSA'da 2 kez yıkayın. Örnekler 1,% PFA çözeltisi 2 ml ilave edilir. Hücreler 4 ° C'de PFA çözeltide kalır edelim76; FACS analizi zaman kadar karanlıkta C.
11. Hemen FACS makinesinde örnekleri çalıştırmadan önce, (4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g), albümin ile hücreler 2 kez yıkayın. 1 ml PBS ile yeniden süspanse Numuneler akış sitometresi üzerinde ayırma, ışıktan korunan, 4 ° C'de (ya da buz üzerinde) tutmak.
12. Üretici sitometresi akışından protokolü aşağıdaki FACS sıralama yapın.

İzole Tonsil B ve T Lenfositlerindeki Adenovirüs DNA'nın 5. PCR Algılama

Not 1: adeno virüs hekson geni primerleri AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') ve AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'), ^11. Bu primerler, 139 bp'lik bir amplikon üretir. Ev sahibi 18S rRNA gen primerler tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') ve tp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3') ile tespit edilebilir. Beklenen Amplikon boyutu 300 bp olduğunu.

Not 2: Her PCRÇalışma bir negatif kontrol (damıtılmış _H2O) ve insan adenovirüs tip 5 ¹² ile enfekte edilmiş insan B hücre çizgisi (BJAB) elde edilen bir DNA pozitif kontrolü içerir.

1. Silika membran bazlı kolon arıtma yöntemi kullanılarak (en az 1 ^x 10 6 hücre, adım 3.11) DNA ayıklayın. Fenol ve guanidin izotiyosiyanat çözeltisi ¹³ kullanarak, RNA yı ekstrakte edin.
2. 1x HF tamponu, deoksinükleotid trifosfat karışımı 0.2 mM (dNTP), 0.25, her bir primerden uM ve 20 ul bir toplam hacim içinde Yüksek Fidelity DNA polimeraz 1 U ihtiva eden bir reaksiyon karışımına, B ve T lenfositleri 100 ng DNA ekleyin.
3. Aşağıdaki çevrim koşulları altında PCR amplifikasyonu yapın: 10 sn, 67 ° C (hekson) ya da 58 ° C (18S rRNA) 30 sn için ve 72 ° C sıcaklıkta 98 ​​° C 30 döngü, ardından 98 ° C'de 30 saniye denatürasyon, 30 sn. PCR reaksiyonu, 72 ° C'de 7 dakikalık son bir uzatma aşaması ile sona erdirildi.
4. Elde edilen PCR amplif Ayrı1x TBE içinde% 1.5 agaroz jeli üzerinde ication ürünleri tampon ve nükleik asit boyası ile boyandı, beklenen şeritleri görselleştirmek.

Sonuçlar

B ve T lenfositlerinin yüksek oranda saflaştırılmış alt popülasyonlannda tonsil uluslu şirketlerin sonuçların verimli bir ayırma. Bu B ve T lemfosit popülasyonları sırasıyla (Şekil 3A) tespit etmek için bir anti-CD20 ve anti-CD2 antikorları kullanılarak FACS analizi ile teyit edilmiştir. Bunun aksine, B ve T lenfosit alt (Şekil 3B) hem de bir hücre karışımı hücre fraksiyonlarında uluslu şirketlerin sonuçların etkisiz bir ayrılması.

Tartışmalar

Bu protokolün sonucunu etkileyen en önemli faktörlerden biri başlangıç ​​malzemesi olarak taze tonsil malzeme kullanılmasıdır. Bu nedenle, bademcik örnekleri ameliyat sonrası 3 saat içinde işlenmelidir. Bademcikler yetişkinler hem de çocuklar elde edilebilir. Çocuklar bademcik malzeme nedeniyle bademcik (tonsillotomy) kısmi cerrahi olarak çıkarılması genellikle küçüktür. Bu nedenle, çok uluslu sayısı az tonsillektomi örneklerinde (1 x 10 ⁸ -2 x 10 ⁹⁾ karşılaştır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain