Protocole d'isolation efficace pour B et les lymphocytes T à partir des amygdales palatines humaines

Résumé

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Résumé

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Introduction

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

Protocole

Le protocole décrit l'isolement de cellules lymphoïdes à partir de matériau patient humain et nécessite donc une approbation éthique. Le travail effectué dans la présente étude a été accordée par le Conseil d'examen éthique Uppsala (DNR. 2013/387).

1. Isolement des cellules mononucléaires (MNC) de amygdales palatines humaines

ATTENTION: Tout le matériel blindé d'origine humaine comme le sang, les tissus ou les fluides corporels doit être considéré comme du matériel potentiellement infecté. Par conséquent, les pratiques de biosécurité recommandées pour la manipulation des tissus humains doivent être suivies.

Remarque: Pour éviter la contamination, toutes les solutions et équipements de culture cellulaire doivent être stériles. Tous les tampons et les solutions doivent être pré-refroidis et conservés dans la glace. Tissus de l'amygdale et cellules isolées doivent être conservées et traitées sur la glace.

1. Obtenir amygdales fraîches provenant de patients ayant subi une amygdalectomie ou amygdalotomie (Figure 2). Plonger la clum de tissusps dans un tube centrifuge de 50 ml rempli d'une solution saline glacée stérile de Hanks équilibrée (HBSS) complétée avec 5% de sérum bovin fœtal (FBS), mM glutamine 10, 0,05 mg / ml de gentamicine et 1% d'antibiotique-antimycotique mélange (Penicillin, streptomycine et amphotéricine B).
2. Gardez les tubes avec les échantillons de tissus des amygdales submergées en tout temps sur la glace. Essayez de traiter les amygdales dès que possible, et au plus tard 3 heures après l'ablation chirurgicale.
3. Placez l'amygdale sur un 60 mm cellule en plastique plaque de culture sur de la glace et de garder le tissu humidifié avec HBSS. Retirer caillots de sang, les tissus conjonctifs et gras avec une pince de nettoyage de la surface des amygdales.
4. Utilisez un nouveau 60 mm plaque de culture cellulaire contenant 5 ml de HBSS. Couper la touffe de tissu d'amygdale en fragments 3-10 mm en utilisant une paire de ciseaux stérile et / ou d'un scalpel.
5. Préparer une nouvelle plaque de 60 mm culture cellulaire contenant 10 ml de HBSS et placer un tamis cellulaire en plastique 100 pm dans la solution HBSS.
6. Transférer les dissfragments d'amygdale échies dans le tamis cellulaire avec un forceps stériles. En utilisant l'extrémité du piston d'une seringue en plastique, presser doucement les fragments de tissus à travers le tamis de la cellule. Assurez-vous que les fragments de l'amygdale sont totalement immergés dans le HBSS.
7. Jeter le tamis cellulaire avec les restes de tissu et transférer la suspension cellulaire obtenue à partir de la plaque de culture cellulaire de 60 mm dans un tube de centrifugation en plastique de 50 ml. Laisser le tube sur la glace tout en procédant à des mesures 1.8 et 1.9.
8. Dans le cas de grandes amygdales, de plus de 2 cm de diamètre (Figure 2), serrer les fragments de l'amygdale dans deux crépines de cellules pour éviter le colmatage de la maille dans la passoire.
9. Pour obtenir le volume final de 35 ml de la suspension cellulaire.
   Remarque: À cette étape, il est possible de préparer la suspension de cellules pour la cryoconservation (voir la section 2).
10. Ajouter 10 ml d'une solution à gradient de densité de Ficoll comme dans un nouveau tube de centrifugation de 50 ml. Superposer délicatement le suspens cellulairesion (étape 1.9) au-dessus de la solution à gradient de densité. Eviter le mélange de la suspension cellulaire et la solution de gradient de densité.
    Remarque: La solution à gradient de densité doit être réchauffé à la température ambiante.
11. Centrifuger la suspension cellulaire dans un rotor swing-out à 700 g pendant 20 min à température ambiante. Ne pas activer la fonction de frein sur la centrifugeuse que le freinage rapide peut perturber le gradient. Aussi, utilisez la fonction d'accélération le plus bas disponible sur la centrifugeuse.
    Note: Après cette étape de centrifugation, d'observer que les MNC une couche duveteuse blanche à l'interface, et les globules rouges (RBC), les fibroblastes et les débris cellulaires comme le sédiment au fond du tube.
12. Recueillir soigneusement la couche de multinationales en utilisant une pipette 10 ml. Placer la suspension de cellules dans un nouveau 50 ml tube de centrifugation.
13. Ajouter 25 ml de PBS glacé à la suspension cellulaire et tourner le tube à 300 g pendant 5 min dans un rotor swing-out à 4 ° C.
14. Eliminer le surnageant en utilisant une pipette 25 mlet répéter culot cellulaire étape de lavage deux fois de plus. Enfin remettre en suspension le culot cellulaire dans 15 ml de PBS.
    Remarque: Après l'étape de lavage final, il est possible de cryoconservation de la suspension cellulaire (voir la section 2).
15. Appliquer 10 pi de suspension de cellules dans la cellule de hémocytomètre chambre de comptage et de compter le nombre de cellules sous un microscope. Distribuer la quantité appropriée de cellules (par exemple, 3.2 x 10 ⁷⁾ dans un tube de centrifugeuse de 15 ml pour la séparation par billes magnétiques ultérieure. Gardez cette aliquote sur la glace jusqu'à l'étape 3.2.

2. La cryoconservation des cellules des amygdales

1. Préparer le milieu de congélation (90% de FBS et 10% de DMSO) et le garder sur la glace. Pour le stockage à long terme tenir les médias de congélation à -20 ° C.
2. Déterminer le nombre total de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules hémocytomètre (étape 1.15). Calculer la quantité nécessaire de milieu de congélation selon la densité cellulaire congelé souhaité (par exemple, 10 ⁷ celluless / ml de milieu de congélation).
3. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min. Décanter le surnageant sans perturber le culot cellulaire et remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu de congélation refroidi à la glace (de l'étape 2.1).
4. Distribuer des aliquotes de 1 ml de la suspension cellulaire dans des flacons stériles destinés à l'entreposage à long terme dans de l'azote liquide. Congeler les flacons dans une chambre de l'isopropanol et de les stocker à -80 ° CO / N. Pour la conservation à long terme de transférer les flacons dans un contenant de l'azote liquide réservoir de stockage ou d'une cellule C congélateur -140 °.
5. Pour décongeler flacons de cellules congelées, réchauffez-les rapidement dans un bain d'eau à 37 C °. Immédiatement lors de la décongélation, disperser la suspension de cellules dans 10 ml de HBSS préchauffé (avec des suppléments, l'étape 1.1) dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. Spin le tube à 300 g pendant 5 min, retirez HBSS et remettre le culot cellulaire à la densité cellulaire souhaitée dans HBSS (avec des suppléments, l'étape 1.1).
   Remarque: La viabilité du multinationales after dégel est d'importance, car la présence de cellules mortes diminuera le rendement final de B et les lymphocytes T purifiés.
   Remarque: Selon notre expérience, la viabilité des cellules moins de 80% permettra de réduire l'efficacité de l'isolement cellulaire.

3. positive Sélection des lymphocytes T de la population à partir des amygdales multinationales

Note 1: Ce protocole est basé sur la sélection positive des lymphocytes humains ^T CD3 + de multinationales amygdales utilisant des billes magnétiques couplées à l'anticorps CD3. Il est possible de commencer cette section de frais (Section 1) ou les (section 2) multinationales congelés.

Note 2: Commencez avec 3 x 10 ⁷ multinationales. Ne pas dépasser ce nombre de cellules, depuis les colonnes de séparation peuvent obstruer et cela permettra de réduire l'efficacité de l'isolement. Utilisez grandes colonnes si plusieurs cellules seront traitées. Les volumes utilisés dans ce protocole ont été expérimentalement optimisé pour le nombre de cellules de noused dans notre dispositif expérimental.

1. Préparer le tampon de séparation [PBS (pH 7,2), 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et de 2 mM d'EDTA]. Filtrez le tampon de séparation à travers un filtre de 0,45 um et stocker à 4 ° C.
2. Spin la suspension des multinationales (étape 1.14) à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension le culot résultant dans des cellules 240 pi (80 pi pour 10 ⁷ cellules) de séparation de tampon glacé. Transférer la suspension cellulaire dans un tube stérile de 2 ml.
3. Ajouter 20 ul d'anticorps CD3 magnétique à la solution de cellules. Incuber les tubes pendant 1 heure à 4 ° C avec agitation douce continue pour maintenir les cellules en suspension.
4. Transférer la totalité de la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml contenant 5 ml séparation tampon de glace froide pour laver les cellules.
5. Centrifuger le tube à 300 g pendant 10 min à 4 ° C dans un rotor swing-out.
6. Pendant ce temps, mettre en place le séparateur magnétique et de la colonne. Fixez le séparateur magnétique à la barre et placez la colonne dans la separteur. Laver la colonne en appliquant 500 ul de tampon de séparation glacée. Jeter l'écoulement à travers.
7. Placer un nouveau tube de collecte de 15 ml au-dessous de la colonne. Garder le tube de collecte sur la glace.
8. Jeter le surnageant (étape 3.5) par pipette et remettre en suspension doucement le culot cellulaire dans 500 pi de tampon de séparation. Appliquer la suspension cellulaire sur le dessus de la colonne de pré-lavés et laisser courir à travers.
   Remarque: amas de cellules peuvent obstruer la colonne et donc de réduire le débit. Pour éviter ce problème, placer un filtre en matière plastique 40 um de la cellule au-dessus de la colonne. Passer les cellules à travers ce maillage sera fortement améliorer l'efficacité de cette méthode.
9. Laver la colonne avec 1,5 fois 4 ml de tampon de séparation (500 ul pour 10 ⁷ cellules). Attendre que le réservoir de la colonne à vide (pas d'liquide doit être observée dans la colonne) avant d'appliquer l'étape de lavage suivante.
   Remarque: Obtenir les cellules non marquées CD3, considérés comme fraction des lymphocytes B, comme elles sontélue dans le tube de collecte.
10. Retirer la colonne du séparateur et la placer dans un nouveau tube de 15 ml de collection. Introduire à la pipette 2 ml de tampon de séparation sur la colonne. Utilisation du plongeur fourni avec la colonne éluer les lymphocytes T sélectionnées positivement, qui sont considérés comme la fraction des lymphocytes T.
11. Déterminer le nombre de cellules purifiées (étape 1.15), si nécessaire. Les suspensions cellulaires sont maintenant prêts pour des expériences en aval.

4. cytométrie de flux de isolé amygdales B et les lymphocytes T

ATTENTION: solution Paraformaldéhyde est irritant et cancérogène suspecté. Porter un vêtement de protection approprié, des gants et une protection des yeux / du visage.

Remarque 1: Ce protocole décrit la méthode de coloration directe de la B et les lymphocytes T isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le but principal de cette étape est d'évaluer la pureté de la cellule isolée populations after CD3 de séparation d'anticorps magnétique. A cet effet B établi et des marqueurs de cellules T, les anticorps monoclonaux fluorophores conjugué CD20-FITC et CD2-APC, sont utilisés. Aussi l'inclusion d'anticorps de contrôle d'isotype est fortement recommandé de distinguer le "fond" liaison non spécifique des anticorps CD2 et CD20 (voir l'étape 4.8).

Remarque 2: Il est possible de conserver les fractions de cellules purifiées dans un paraformaldehyde à 1% (PFA) solution à l'obscurité à 4 ° C jusqu'à ce que le temps de coloration (par exemple, le jour suivant.). De plus, le même procédé est applicable si il existe un écart de temps entre la coloration et une analyse FACS. Rappelez-vous que dans les deux cas, les cellules doivent être lavés correctement avec LNPP (PBS contenant 0,2% de BSA) tampon, avant la coloration ou l'analyse FACS.

1. Sortez 6 x 10 ⁶ cellules des multinationales de l'étape 1.15 (avant d'appliquer à la colonne), fraction des lymphocytes B de l'étape 3.9 et de la fraction des lymphocytes T de l'étape 3.10.
2. Spin la cellulesuspensions à 300 g pendant 5 min à 4 ° C en utilisant un rotor swing-out.
3. Retirer le surnageant avec pipette et laver le culot cellulaire une fois avec 1 ml de glace-froid LNPP. Faites tourner les suspensions de cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant avec pipette et remettre la cellules dans 600 pi de tampon LNPP glacée.
4. Ajouter 100 ul de la suspension de cellules au fond d'un tube FACS.
5. Ajouter 100 pi de PBS contenant du sérum humain inactivé 10% de la chaleur à chaque tube, bien mélanger et laisser incuber pendant ~ 1 min à température ambiante ou 20 min sur la glace.
   Remarque: les lymphocytes B portent des récepteurs Fc. Afin de bloquer les récepteurs Fc des fractions de cellules purifiées sont incubées avec du sérum humain inactivé à la chaleur à 10%. Le sérum humain inactivé à la chaleur est d'une incubation à 56 ° C pendant 1 heure. Diviser le sérum inactivé à la chaleur en petites portions et les conserver congelés à -20 ° C.
6. Centrifuger la suspension de cellules à 300 xg pendant 5 min à 4 ° C dans un swing Rotor.
7. Retirer le surnageant avec pipette et laver le culot de cellules avec 1 ml LNPP. Répéter la centrifugation (300 g pendant 5 min à 4 ° C).
8. Ajouter 100 ul LNPP dans chaque tube sur la glace. Ajouter la quantité appropriée de l'anticorps monoclonal fluorophore conjugué, selon la recommandation du fabricant (par exemple, 20 pi d'anti-CD20 et / ou 5 pi d'anticorps anti-CD2 dans 100 pi de LNPP). Note: Ne pas oublier d'attribuer suffisamment de tubes de contrôle pour l'analyse FACS. Dans ce protocole, les contrôles suivants doivent être inclus: 1) cellules colorées avec les anticorps anti-CD2 et anti-CD20 individuellement, 2) des cellules colorées avec les anticorps anti-CD2 et anti-CD20 contrôle isotypique individuellement et, 3) les cellules sans addition d'anticorps.
9. Brièvement vortex le tube et incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
10. Laver 2 fois avec LNPP. Ajouter 2 ml de solution de PFA à 1% pour les échantillons. Laissez les cellules restent dans la solution PFA à 476; C dans l'obscurité jusqu'à ce que le moment de l'analyse FACS.
11. Immédiatement avant d'exécuter les échantillons dans la machine FACS, laver les cellules 2 fois avec LNPP (300 g pendant 5 min à 4 ° C). Échantillons de remettre en suspension dans 1 ml de PBS et de garder à 4 ° C (ou sur glace), protégé de la lumière, avant la séparation sur le cytomètre de flux.
12. Faites le tri FACS suivant le protocole du cytomètre en flux fabricant.

Détection PCR 5. des adénovirus ADN isolé amygdales B et les lymphocytes T

Note 1: Les amorces de gènes d'hexon d'adenovirus sont AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') et AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Ces amorces génèrent un amplicon de 139 pb. L'hôte gène ARNr 18S peut être détectée avec des amorces tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') et TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). La taille de l'amplimère attendu est de 300 pb.

Note 2: Chaque PCRterme comprend un contrôle négatif (distillée H ₂ O) et un contrôle positif de l'ADN obtenu à partir de la lignée cellulaire B humaine (BJAB) infectés par l'adénovirus de type 5 humain ^12.

1. Extraire l'ADN (d'au moins 1 x 10 ⁶ cellules, étape 3.11) en utilisant une membrane de silice procédé de purification sur la base de la colonne. Extraire l'ARN en utilisant du phénol et de l'isothiocyanate de guanidine ¹³ solution.
2. Ajouter 100 ng d'ADN de lymphocytes B et T à un mélange réactionnel contenant un tampon 1x HF, 0,2 mM de désoxynucléotide triphosphate mélange (dNTP), 0,25 uM de chaque amorce et 1 U de haute fidélité de l'ADN polymerase dans un volume total de 20 ul.
3. Effectuer une amplification par PCR dans les conditions de cyclage suivantes: 30 s de dénaturation à 98 ° C, suivi par 30 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 67 ° C (hexon) ou 58 ° C (ARNr 18S) pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 sec. La réaction PCR a été terminé avec une étape d'extension finale de 7 min à 72 ° C.
4. Séparer l'amplif PCR résultantication produits sur un gel d'agarose à 1,5% dans du tampon TBE 1x et visualiser les bandes attendues par coloration avec du colorant d'acide nucléique.

Résultats

Une séparation efficace des multinationales amygdales résultats dans les sous-populations hautement purifiées de lymphocytes B et T. Cela a été confirmé par analyse FACS en utilisant des anticorps anti-CD2 et CD20 anti-B et pour détecter des populations de lymphocytes T, respectivement (figure 3A). En revanche, une séparation inefficace des MNC résultats dans les fractions cellulaires qui sont un mélange de cellules provenant des deux sous-populations de lymphocytes B et T

Discussion

Un des facteurs les plus importants qui affectent le résultat de ce protocole est l'utilisation de matériel amygdales frais comme le matériau de départ. Par conséquent, les échantillons d'amygdales doivent être traitées dans un délai de 3 heures après la chirurgie. Amygdales peuvent être obtenus à partir de deux adultes et les enfants. Le matériau des amygdales des enfants est généralement plus petit en raison de l'ablation chirurgicale partielle des amygdales (amygdalotomie). Par conséquent,...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain