Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Резюме

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Аннотация

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Введение

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

протокол

Протокол описывает выделение лимфоидных клеток из человеческого материала пациента и, следовательно, требует этическим нормам. Проделанная работа в данном исследовании был предоставлен Упсалы этического наблюдательного совета (DNR. 2013/387).

1. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из небных миндалин человека

ВНИМАНИЕ: Все неэкранированный материалы человеческого происхождения, такие как кровь, ткани или жидкости организма должны рассматриваться как потенциально инфицированным материалом. Таким образом, рекомендуемые практики биобезопасности для обработки тканей человека должны быть соблюдены.

Примечание: Чтобы избежать загрязнения, все решения и оборудование для культивирования клеток, должны быть стерильными. Все буферы и растворы должны быть предварительно охлаждены, и хранили на льду. Миндалины тканей и изолированных клеток должны храниться и обрабатываться на льду.

1. Получить свежие миндалины из пациентов тонзиллэктомии или удаление миндалин (рисунок 2). Окунитесь в ткани ClumPS в 50 мл центрифужную пробирку, наполненную ледяной стерильной сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 10 мМ глутамина, 0,05 мг / мл гентамицина и 1% антибиотиков-противогрибковое смеси (пенициллин, стрептомицина и амфотерицин).
2. Держите трубки с погруженными образцами тканей миндалин во все времена на льду. Попробуйте обрабатывать миндалины, как только возможно, и не позднее, чем 3 часа после хирургического удаления.
3. Поместите миндалину на 60 мм пластик клеток культуры пластины на льду и держать ткань, смоченную HBSS. Удалить видимые сгустки крови, жировой и соединительной ткани с чистыми щипцами с поверхности миндалин.
4. Использование нового 60 мм культуральный планшет, содержащий 5 мл HBSS. Вырезать ткани миндалин комок в 3-10 мм фрагментов с использованием стерильного ножницы и / или скальпель.
5. Подготовьте новый 60 мм культуральный планшет, содержащий 10 мл HBSS и поместить пластиковый клеточный фильтр 100 мкм в растворе HBSS.
6. Передача DISSected миндалин фрагментов в ячейки фильтра стерильной щипцами. Использование конец плунжера пластиковый шприц, плавно сжать фрагментов ткани через ячейки сетчатого фильтра. Убедитесь, что фрагменты миндалины полностью погружены в HBSS.
7. Отменить клеточный фильтр с тканью остатки и передавать полученную клеточную суспензию из 60 мм культуральный планшет в 50 мл пластиковые центрифужные пробирки. Оставьте пробирку на льду, а исходя с шагом 1,8 и 1,9.
8. В случае больших миндалин, больше, чем 2 см в диаметре (Рисунок 2), выжать фрагменты миндалин в двух сотовых сетчатых, чтобы избежать засорения сетки в сито.
9. Получение конечного объема 35 мл клеточной суспензии.
   Примечание: На этом этапе можно приготовить суспензию клеток для криоконсервации (см раздел 2).
10. Добавьте 10 мл в градиенте плотности раствором, таким как Ficoll в новую 50 мл центрифужную пробирку. Аккуратно наложить клеточных suspensион (шаг 1,9) в верхней части градиента плотности раствора. Избегать смешивания клеточной суспензии и в градиенте плотности раствора.
    Примечание: градиент плотности раствора должен быть разогрет до комнатной температуры.
11. Центрифуга клеточной суспензии в поворотно-откидной ротор 700 мкг на 20 мин при комнатной температуре. Не активируйте функцию тормоза на центрифуге в быстрого торможения может нарушить градиент. Кроме того, использовать низкие функцию ускорения доступной на центрифуге.
    Примечание: После этого стадии центрифугирования, наблюдается МНК в виде пушистого белого слоя на границе, и эритроцитов (эритроцитов), фибробласты и клеточного дебриса в качестве осадка на дне пробирки.
12. Осторожно собрать слой МНК с помощью 10 мл пипетки. Поместите клеточной суспензии в новый 50 мл центрифужную пробирку.
13. Добавить 25 мл охлажденной льдом PBS к клеточной суспензии, и спина трубки при 300 х г в течение 5 мин в поворотно-откидной ротор при 4 ° С.
14. Удалить супернатант, используя 25 мл пипеткии повторить осадок клеток стиральной шаг два раза больше. Наконец ресуспендируют осадок клеток в 15 мл PBS.
    Примечание: После окончательного этапа промывки, можно криоконсервируют клеточной суспензии (см раздел 2).
15. Применить 10 мкл клеточной суспензии в гемоцитометр клеток Счетной палаты и подсчитать количество клеток под микроскопом. Не включать соответствующее количество клеток (например, 2-3 х 10 ⁷⁾ в 15 мл центрифужную пробирку для последующего разделения борта магнитного. Держите эту аликвоту на льду до шага 3.2.

2. Криоконсервация клеток миндалин

1. Подготовьте среду замораживания (90% FBS и 10% ДМСО) и держать его на льду. Для долговременного хранения держать замораживания средств массовой информации при -20 ° С.
2. Определить общее количество клеток с использованием подсчета клеток гемоцитометр камеру (этап 1.15). Рассчитать необходимое количество замерзания среды в соответствии с требуемой плотностью замороженной клеточной (например, 10 ⁷ клетокс / мл морозильной среде).
3. Центрифуга клеточной суспензии в 300 мкг в течение 5 мин. Слейте супернатант, не нарушая клеточный осадок и ресуспендируют осадок клеток в ледяной замерзания среды (со стадии 2.1).
4. Разливают по 1 мл аликвоты клеточной суспензии в стерильные флаконы, предназначенных для длительного хранения в жидком азоте. Замораживание ампул в изопропанол камеры и хранить их при температуре -80 ° CO / N. Для долгосрочного хранения передать флаконов в жидком азоте, содержащей резервуар или -140 ° C морозильник клеток.
5. Для таять флаконы с замороженных клеток, согреть их быстро в С на водяной бане 37 °. Сразу при оттаивании, разогнать клеточной суспензии в 10 мл подогретого HBSS (с добавками, шаг 1.1) в 15 мл центрифужную пробирку. Спин трубку при 300 х г в течение 5 мин, удалить HBSS и ресуспендируют осадок клеток в желаемой плотности клеток в HBSS (с добавками, шаг 1.1).
   Примечание: жизнеспособность AF МНКтер оттаивания имеет значение, так как присутствие мертвых клеток снизится окончательный выход очищенного В и Т-лимфоцитов.
   Примечание: В соответствии с нашим опытом жизнеспособность клеток менее 80% снизит эффективность изоляции клеток.

3. Положительный Выбор Т-лимфоцитов из миндалин населения МНК

Примечание 1: Этот протокол основан на позитивной селекции человеческих ^CD3 + Т-лимфоцитов из миндалин МНК с использованием магнитных шариков, соединенных с антителом CD3. Можно начать этот раздел из свежих (раздел 1) или замороженных (раздел 2) МНК.

Примечание 2: Начните с 3 х 10 ⁷ МНК. Не превышать это число клеток, так как разделительные колонны могут засорить и это приведет к снижению эффективности изоляции. Используйте большие колонки, если больше клеток будут обработаны. Объемы, используемые в этом протоколе были экспериментально оптимизирована для количества клеток насред в нашей экспериментальной установки.

1. Подготовка буфера разделения [PBS (рН 7,2), 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 2 мМ ЭДТА]. Фильтр буфер разделения через фильтр и хранят 0,45 мкм при 4 ° С.
2. Спин подвеску МНК (шаг 1,14) при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Ресуспендируют полученный осадок клеток в 240 мкл (80 мкл на 10 ⁷ клеток) охлажденного льдом буфера разделения. Передача клеточной суспензии в стерильную пробирку 2 мл.
3. Добавьте 20 мкл антител CD3 магнитного к раствору клеток. Инкубировать пробирки в течение 1 часа при 4 ° С при непрерывном осторожном перемешивании, чтобы клетки в суспензии.
4. Передача всех клеточной суспензии в 15 мл пробирку, содержащую 5 мл охлажденного льдом буфера разделения мыть клетки.
5. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С в поворотно-откидной ротор.
6. Между тем создание магнитного сепаратора и колонны. Прикрепите магнитный сепаратор к подставке, и поместите колонку в SEPARАТОР. Промыть колонку с применением 500 мкл охлажденного льдом буфера разделения. Откажитесь от потока через.
7. Поместите новую пробирку 15 мл колонке ниже. Держите пробирку на льду.
8. Удалите супернатант (этап 3.5) по пипетки и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл буфера разделения. Применение клеточной суспензии в верхней части предварительно промытой колонке и пусть это проходит через.
   Примечание: скопления клеток может засорить колонку и тем самым уменьшить расход. Чтобы избежать этой проблемы, место 40 мкм пластиковый клеточный фильтр в верхней части колонны. Прохождение клеток через этот сетки будет весьма повысить эффективность этого метода.
9. Промыть колонку 4 раза с 1,5 мл буфера для разделения (500 мкл в течение 10 ⁷ клеток). Подождите водохранилища столбца, чтобы быть пустым (жидкость не должна наблюдаться в колонке) перед нанесением следующего стиральной шаг.
   Примечание: Получите немеченые клетки CD3, считаются лимфоцитов фракции, так как ониэлюировали в пробирки.
10. Удалить столбец из сепаратора и места в новой 15 мл пробирку. Пипетка 2 мл буфера для разделения на колонку. Использование поршень, прилагаемый к колонке элюирования положительно выбранные Т-лимфоциты, которые рассматриваются в качестве фракции лимфоцитов Т.
11. Определить количество очищенных клеток (шаг 1,15), если это необходимо. Клеточные суспензии теперь готовы для последующих экспериментов.

4. проточной цитометрии изолированных миндалин B и Т-лимфоциты

ВНИМАНИЕ: Параформальдегид решение раздражителем и канцероген. Носить соответствующую защитную одежду, перчатки и средства защиты глаз / лица.

Примечание 1: Этот протокол описывает способ прямого окрашивания изолированной В- и Т-клеток с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS анализ). Основная цель этого этапа является оценка чистоты изолированной камере населения AFтер CD3 разделение магнитного антитела. Для этого, установленном В- и Т-клеточных маркеров, флуорофорные-сопряженных моноклональных антител CD20-FITC и CD2, APC-используются. Также включение управления изотипу антител рекомендуется различать неспецифический «фон» связывания антител CD2 и CD20 (см шаг 4,8).

Примечание 2: Можно не держать очищенные фракции клеточных в 1% параформальдегидом (PFA) раствор в темноте при 4 ° С до момента окрашивания (например, на следующий день.). Также же процедура применяется, если есть промежуток времени между окрашиванием и анализа FACS. Следует помнить, что в обоих случаях клетки должны быть вымыты должным образом с PBSA (PBS, содержащий 0,2% BSA) буфер перед окрашиванием или анализа FACS.

1. Выньте 6 х 10 ⁶ клеток МНК шагом 1,15 (перед нанесением на колонку), B-лимфоцитов фракции из стадии 3.9 и Т-лимфоцитов фракции со стадии 3.10.
2. Спин ячейкиСуспензии при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С с использованием откидную ротора.
3. Удалить супернатант с пипетки и мыть осадок клеток один раз 1 мл ледяного PBSA. Спин клеточные суспензии при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант с пипетки и ресуспендируют Клетки в 600 мкл охлажденного льдом буфера. PBSA
4. Добавить 100 мкл клеточной суспензии в нижней части трубки FACS.
5. Добавить 100 мкл PBS, содержащего 10% инактивированной нагреванием человеческую сыворотку в каждую пробирку, хорошо перемешать и инкубировать в течение ~ 1 мин при комнатной температуре или 20 минут на льду.
   Примечание: B-лимфоциты несут рецепторы Fc. Для того, чтобы блокировать Fc рецепторы очищенные фракции клеток инкубируют с 10% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека. Сыворотки человека является инактивированной нагреванием инкубированием при 56 ° С в течение 1 часа. Разделите термоинактивированной сыворотку в малых аликвоты и хранить замороженные при -20 ° С.
6. Центрифуга клеточной суспензии в 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С в SWИн-из ротора.
7. Удалить супернатант с пипетки и мыть осадок клеток с 1 мл PBSA. Повторите центрифугирования (300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С).
8. Добавить 100 мкл PBSA в каждую пробирку на льду. Добавить соответствующее количество флуорофора-сопряженных моноклональных антител, в соответствии с рекомендациями производителя (например, 20 мкл анти-CD20 и / или 5 мкл анти-CD2 антитела в 100 мкл PBSA). Примечание: Не забудьте установить достаточно трубы управления для анализа FACS. В этом протоколе должны быть включены следующие элементы управления: 1) клетки окрашивали антителами к CD2 и анти-CD20-отдельности, 2) клетки, окрашенные анти-CD2 и анти-CD20-контроля изотипа антител в отдельности и, 3) клетки без добавления антител.
9. Кратко вихрь трубку и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
10. Вымойте 2 раза PBSA. Добавляют 2 мл 1% раствора PFA с образцами. Пусть клетки остаются в растворе при 4 PFA76; С в темноте до момента анализа FACS.
11. Непосредственно перед запуском образцов в машине FACS, промыть клетки 2 раза PBSA (300 мкг в течение 5 мин при 4 ° C). Образцы Ресуспендируйте в 1 мл PBS и держать при 4 ° С (или на льду), защищенном от света месте, до разделения на цитометра.
12. Сделайте сортировку FACS следующий протокол от цитометра производителя.

5. ПЦР обнаружения аденовируса ДНК в изолированных миндалин B и Т-лимфоциты

Примечание 1: аденовирусные генные праймеры Hexon являются AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') и AdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. Эти праймеры генерируют ампликон 139 б.п.. Хост гена рРНК 18S могут быть обнаружены с праймерами tp206 (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') и TP207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'). Ожидаемый размер ампликона составляет 300 б.п..

Примечание 2: Каждый ПЦРпробег включает в себя отрицательный контроль (дистиллированная _H 2 O) и положительный контроль ДНК, полученной из клеточной линии человеческого (BJAB) инфицированного человека типа аденовируса 5 ^12.

1. Извлечение ДНК (по крайней мере, 1 ^× 10 6 клеток, шаг 3.11) с использованием диоксида кремния мембраны способ очистки колонки на основе. Извлечение РНК с помощью фенола и гуанидинизотиоцианата решение ^13.
2. Добавить 100 нг ДНК из В- и Т-лимфоцитов в реакционной смеси, содержащей 1х HF буфер, 0,2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов смеси (дНТФ), 0,25 мкМ каждого праймера и 1 ед Высококачественное ДНК-полимеразы в общем объеме 20 мкл.
3. Выполнение ПЦР-амплификации при следующих условиях велосипедных: 30 сек денатурация при 98 ° С, затем 30 циклов 98 ° С в течение 10 сек, 67 ° С (Hexon) или 58 ° C (18S рРНК) в течение 30 сек и 72 ° С в течение 30 сек. Реакцию ПЦР закончился конечной стадии расширения 7 мин при 72 ° С.
4. Отделите полученный ПЦР amplification изделия на 1,5% агарозном геле в 1X TBE буфер и визуализировать ожидаемых диапазонов окрашиванием красителем нуклеиновых кислот.

Результаты

Эффективный разделение миндалин МНК приводит высокоочищенных субпопуляций В и Т-лимфоцитов. Это было подтверждено с помощью анти-CD20 и анти-CD2 антитела для выявления В- и Т-лимфоцитов популяции соответственно (фиг.3А) с помощью анализа FACS. В противоположность этому, неэффективн?...

Обсуждение

Один из самых важных факторов, влияющих на исход этого протокола является использование свежего материала миндалин в качестве исходного материала. Таким образом, образцы миндалины должны быть обработаны в течение 3 ч после операции. Миндалины могут быть получены из взрослых, так и дет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain