ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

要約

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

要約

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

概要

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

プロトコル

プロトコルは、ヒト患者材料からのリンパ球様細胞の単離を記載し、したがって、倫理的な承認を必要とします。本研究で行われた作業は、ウプサラ倫理審査委員会（DNR。387分の2013）によって付与されました。

ヒトパラティーノ扁桃腺から単核細胞（MNCを）の1の単離

注意：血液、組織または体液のようなヒト由来の全てのシールドの材料は、感染した可能性材料とみなされるべきです。したがって、ヒト組織を処理するための推奨されるバイオセーフティ慣行に従うべきです。

注：汚染を避けるために、全ての溶液及び細胞培養装置は、無菌でなければなりません。全ての緩衝液および溶液は、事前に冷却し、氷上に保持する必要があります。扁桃組織および単離した細胞を保持し、氷上で処理する必要があります。

1. 扁桃摘出やへんとう切除（図2）を受けた患者からの新鮮な扁桃腺を取得します。組織clumプランジ氷冷滅菌ハンクス平衡塩溶液を充填した50 ml遠心管（HBSS）、5％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、10 mMのグルタミン、0.05 mg / mlのゲンタマイシンおよび1％抗生物質 - 抗真菌ミックス（ペニシリン、にPSストレプトマイシン及びアンホテリシンB）。
2. 氷の上に常時水没扁桃組織サンプルを用いてチューブを保管してください。できるだけ早く扁桃腺を処理しようとせず、遅くとも3時間よりも外科的除去後。
3. 氷上で60ミリメートルのプラスチック細胞培養プレートに扁桃腺を置き、HBSSで湿らせたティッシュを維持します。扁桃表面からのきれいなピンセットで目に見える血液凝固、脂肪および結合組織を除去します。
4. 5ミリリットルのHBSSを含む新しい60ミリメートルの細胞培養プレートを使用してください。はさみおよび/またはメスの無菌のペアを使用して3〜10ミリメートルの断片に扁桃組織の塊をカットします。
5. HBSS 10mlのを含む新しい60ミリメートルの細胞培養プレートを準備し、HBSS溶液中に100μmのプラスチック製セルストレーナーを配置します。
6. ディス転送滅菌ピンセットを用いて細胞ストレーナーに扁桃腺フラグメントをected。プラスチックシリンジのプランジャの端を使用して、スムーズにセルストレーナーを介して組織片を絞ります。扁桃腺断片が完全にHBSS中に浸漬されていることを確認します。
7. 組織が残存して細胞ストレーナーを廃棄し、50mlプラスチック遠心管に60 mmの細胞培養プレートから得られた細胞懸濁液を移します。ステップ1.8および1.9を進めながら、氷上でチューブを残します。
8. 大きさが2cm（ 図2）よりも大きい扁桃腺の場合には、ストレーナメッシュの目詰まりを回避するために、2つのセルストレーナーで扁桃腺断片を絞ります。
9. 細胞懸濁液を35 mlの最終容積を得ます。
   注：このステップでは、凍結保存（セクション2を参照）の細胞懸濁液を調製することが可能です。
10. 新しい50ml遠心管にフィコール等密度勾配溶液10mlを加えます。静か細胞suspensをオーバーレイイオン密度勾配液の上に（ステップ1.9）。細胞懸濁液および密度勾配溶液の混合を避けます。
    注：密度勾配溶液を室温まで加温しなければなりません。
11. RTで20分間、700×gで、スイングアウトローター中で細胞懸濁液を遠心。勾配が中断される可能性があり、高速ブレーキとして遠心分離機のブレーキ機能をアクティブにしないでください。また、遠心分離器で利用可能な最低の加速関数を使用します。
    注：この遠心分離工程の後、チューブの底に沈殿物として界面でふわふわした白色層、および赤血球（RBC）、線維芽細胞および細胞残屑などのMNCを観察します。
12. 慎重に10ミリリットルピペットを用いて、多国籍企業層を収集します。新しい50ミリリットルの遠心管に細胞懸濁液を置きます。
13. 細胞懸濁液に氷冷PBS 25 mlを加え、4℃でスイングアウトローター中で5分間300×gでチューブをスピン。
14. 25ミリリットルピペットを用いて上清を削除細胞ペレットの洗浄工程をさらに2回繰り返します。最後のPBS 15mlに細胞ペレットを再懸濁します。
    注：最後の洗浄工程の後に、（セクション2を参照）の細胞懸濁液を凍結保存することが可能です。
15. 血球計数器細胞計数室に10μlの細胞懸濁液を適用し、顕微鏡下で細胞数をカウントします。後続の磁気ビーズ分離に15 mlの遠心管中の細胞の適切な量（例えば、2-3×10 ^7）を分注します。ステップ3.2まで氷上にこのアリコートを保管してください。

扁桃細胞の凍結保存2.

1. 凍結培地（90％FBSおよび10％DMSO）を準備し、氷の上に保管してください。長期保存のために-20℃で凍結メディアを保持します。
2. 血球計数器の細胞計数室（ステップ1.15）を用いて細胞の総数を決定します。希望の凍結細胞密度に応じて凍結媒体の必要量を計算する（例えば、10 ^7細胞凍結培地のS / mlで）。
3. 5分間300×gで細胞懸濁液を遠心。細胞ペレットを乱すことなく上清を除去し、（ステップ2.1から）を氷冷凍結培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
4. 液体窒素中で長期保存のために設計され、滅菌バイアル中に細胞懸濁液1mlのアリコートを分配します。イソプロパノール室でバイアルを凍結し、-80°のCO / Nでそれらを格納します。長期保存のために貯蔵タンクまたは-140℃の細胞冷凍庫を含む液体窒素中にバイアルを転送します。
5. 凍結細胞とのバイアルを解凍し、37℃の水浴中で急速にそれらを暖めます。解凍した直後と、15mlの遠心管中で（サプリメント、ステップ1.1）、予め温めておいたHBSS 10mlの中に細胞懸濁液を分散させます。 、5分間300×gでチューブをスピンHBSSを除去し、（サプリメントと、ステップ1.1）HBSS中の所望の細胞密度で細胞ペレットを再懸濁。
   注意：多国籍企業AFの実行可能性をター解凍は死細胞の存在は、精製されたBおよびTリンパ球の最終収率が低下するので、重要です。
   注：細胞単離の効率を低下させる、細胞生存率が80％、次に我々の経験によります。

扁桃多国籍企業からのTリンパ球の人口の3ポジティブ選択

注1：このプロトコルは、CD3抗体に結合された磁気ビーズを使用して、扁桃多国籍企業からのヒトCD3 ^{+ Tリンパ球の}正の選択に基づいています。これは、新鮮な（セクション1）又は冷凍（セクション2）多国籍企業から、このセクションを開始することが可能となります。

注2：3×10 ⁷の多国籍企業から開始します。分離カラムが詰まることがあり、これは、分離効率が低下するので、この細胞数を超えないようにしてください。より多くの細胞が処理される場合は、より大きな列を使用します。このプロトコルで使用されるボリュームは、実験的に細胞たちの数のために最適化されています私たちの実験で編。

1. 分離緩衝液[PBS（pH7.2）中、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および2mM EDTA]を準備します。 4℃で0.45μmフィルターとストアを介して分離バッファをフィルタリングします。
2. 4℃で5分間、300×gでのMNC懸濁液（ステップ1.14）をスピン。氷冷分離緩衝液の240μlの（10 ⁷個の細胞あたり80μl）をで得られた細胞ペレットを再懸濁します。無菌の2mlチューブに細胞懸濁液を転送します。
3. 細胞溶液にCD3磁気抗体20μlのを追加します。懸濁液中の細胞を維持するために連続的に穏やかに混合しながら4℃で1時間、チューブをインキュベートします。
4. 細胞を洗浄し、5 mlの氷冷分離緩衝液を含む15 mlのチューブに細胞懸濁液の全てを転送します。
5. スイングアウトローターで4℃で10分間300×gでチューブを遠心。
6. 一方、磁気分離と列を設定します。スタンドに磁気分離器を取り付け、SEPARで列を配置レータ。氷冷分離緩衝液500μlを適用することにより、カラムを洗浄。フロースルーを捨てます。
7. 列の下に新しい15ミリリットルのコレクションチューブを置きます。氷の上にコレクションチューブを保管してください。
8. ピペットで上清（ステップ3.5）を破棄し、ゆっくりと500μlの分離バッファで細胞ペレットを再懸濁します。予め洗浄したカラムの上に細胞懸濁液を適用し、それを介して、実行してみましょう。
   注：細胞塊は、カラムを詰まらせるので、流量を減少させることができます。この問題を回避するには、列の上に40μmのプラスチック製セルストレーナーを配置します。このメッシュを通して細胞を渡すと、非常にこの方法の効率を改善します。
9. 分離緩衝液1.5mlの（10 ^{7個の細胞}のための500μl）を用いてカラムを4回洗浄します。次の洗浄工程を適用する前に、（液体が列で観察されるべきではない）空に列リザーバのを待ちます。
   注：Bリンパ球画分としてみなさCD3非標識細胞を得る、そのままコレクションチューブに溶出しました。
10. 新しい15ミリリットルのコレクションチューブにセパレーターと場所から列を削除します。ピペットカラムに分離緩衝液2mlの。 Tリンパ球画分としてみなされる正に選択されたTリンパ球を、溶出カラム付属のプランジャーを使用して。
11. 必要に応じて精製された細胞（ステップ1.15）の数を決定します。細胞懸濁液は現在、下流の実験の準備ができています。

単離した扁桃BおよびTリンパ球の4フローサイトメトリー分析

注意：パラホルムアルデヒドソリューションは、刺激物と疑われる発がん性物質です。適切な保護衣、手袋、眼/顔面用の保護具を着用します。

注1：このプロトコルは、（FACS）分析を蛍光活性化細胞選別によって分離されたB細胞およびT細胞を直接染色する方法が記載されています。この工程の主な目的は、単離された細胞集団のAFの純度を評価することですターCD3抗体磁気分離。 BおよびT細胞マーカー、フルオロフォア結合モノクローナル抗体CD20-FITCおよびCD2-APC確立し、この目的のために、使用されています。また、アイソタイプコントロール抗体を含めることが非常にCD2とCD20抗体（ステップ4.8を参照）の非特異的結合 "背景"を区別することをお勧めします。

注2：これは、染色時まで4℃で暗所で1％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液に精製された細胞画分を維持することが可能である（例えば、次の日。）が。染色およびFACS分析の間の時間間隔がある場合にも同じ手順が適用可能です。どちらの場合も、細胞が染色前またはFACS分析にPBSA（0.2％BSAを含有するPBS）緩衝液で適切に洗浄する必要があることを覚えておいてください。

1. ステップ1.15からの多国籍企業の6×10 ^{6個の細胞} （前の列に適用する）、ステップ3.9およびステップ3.10からのTリンパ球画分からのBリンパ球画分を取り出し。
2. 細胞をスピンスイングアウトローターを用いて4℃で5分間、300×gで懸濁液。
3. ピペットで上清を除去し、氷冷PBSA 1mlで一度細胞ペレットを洗浄します。 4℃で5分間、300×gで細胞懸濁液をスピン。ピペットで上清を除去し、再懸濁 氷冷PBSAバッファー600μlの細胞。
4. FACSチューブの底に100μlの細胞懸濁液を追加します。
5. 各チューブに、10％の熱不活性化ヒト血清を含む100μlのPBSを加え、よく混ぜ、氷上に〜RTで1分または20分間インキュベートします。
   注：Bリンパ球は、Fc受容体を運びます。 Fcをブロックするために精製された細胞画分を、10％熱不活性化ヒト血清と共にインキュベートした受容体。ヒト血清を1時間56℃でインキュベーションすることにより熱不活性化です。 -20℃で凍結小分けとストアへの熱不活性化血清を分割します。
6. SWで4℃で5分間、300×gで細胞懸濁液を遠心るアウトローター。
7. ピペットで上清を除去し、1mlのPBSAで細胞ペレットを洗浄します。遠心分離（4℃で5分間、300×gで）を繰り返します。
8. 氷の上に各チューブに100μlのPBSAを追加します。製造業者の推奨に従って、フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体の適切な量を追加します（例えば、抗CD2020μlのおよび/ ​​またはPBSA100μlの抗CD2抗体を5μl）。注意：FACS分析のために十分な制御管を割り当てることを忘れないでください。このプロトコルでは、次のコントロールが含まれるべきである：1）細胞は、個々に、抗CD2および抗CD20抗体で染色し、抗CD2で染色した2）細胞と抗CD20アイソタイプ対照抗体単独で及び、3）細胞を添加していません抗体の。
9. 簡単に説明すると、チューブをボルテックスし、暗所で4℃で30分間インキュベートします。
10. PBSAで2回洗浄します。サンプルに1％PFA溶液2mlを追加します。細胞は4でPFA溶液中に残ってみよう76; C暗所でのFACS分析時まで。
11. 直ちにFACS機でサンプルを実行する前に、（4℃で5分間、300×gで）をPBSAで細胞を2回洗浄します。 1mlのPBSと再懸濁サンプルを前に、フローサイトメーター上で分離し、光から保護し、4℃（または氷上）で保ちます。
12. メーカーフローサイトメーターからのプロトコルに従って、FACSソーティングを行います。

単離した扁桃BおよびTリンパ球におけるアデノウイルスDNAの5 PCR検出

注1：アデノウイルスヘキソン遺伝子プライマーはAdRJC1（5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 '）及び^{AdRJC2（5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3'）11}です。これらのプライマーは、139塩基対のアンプリコンを生成します。ホスト18S rRNA遺伝子を、プライマーtp206（5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 '）及びtp207（5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3'）を用いて検出することができます。予想されるアンプリコンサイズは300 bpです。

注2：すべてのPCRランは、陰性対照（蒸留H _{2 O）}およびヒトアデノウイルス5型¹²に感染したヒトB細胞株（BJAB）から得られた陽性DNAコントロールを含んでいます。

1. シリカ膜ベースのカラム精製法を用いて、（少なくとも1×10 ^{6個の細胞} 、ステップ3.11から）のDNAを抽出します。フェノールとグアニジンイソチオシアネート液^13を用いてRNAを抽出します。
2. 20μlの総容量で、1×HF緩衝液を含む反応混合物にBおよびTリンパ球からの100ngのDNAを加えるデオキシヌクレオチド三リン酸混合物（のdNTP）の0.2mMの各プライマーの0.25μMと高忠実度DNAポリメラーゼの1 U。
3. 以下のサイクル条件でPCR増幅を実行します。30秒、72℃10秒、67℃（ヘキソン）または58℃（18S rRNAの）98℃の30サイクル、続いて98℃で30秒の変性、 30秒間。 PCR反応は、72℃で7分間の最終伸長工程で終了しました。
4. 得られたPCR amplifを分離1×TBE中の1.5％アガロースゲル上でication製品は、緩衝液及び核酸染色で染色することによって期待されるバンドを可視化します。

結果

BおよびTリンパ球の高度に精製された亜集団における扁桃のMNC結果の効率的な分離。これは、（ 図3A）は、それぞれ、BおよびTリンパ球集団を検出するために、抗CD20および抗CD2抗体を用いたFACS分析によって確認しました。 BおよびTリンパ球の亜集団（ 図3B）の両方からの細胞の混合物である細胞画分中のMNCの結果とは対照的に、非効率的な分離。

ディスカッション

このプロトコルの結果に影響を与える最も重要な要因の一つは、出発原料として、新鮮な扁桃体の使用です。したがって、扁桃サンプルは手術後3時間以内に処理しなければなりません。扁桃腺は、大人と子供の両方から得ることができました。子供から扁桃物質が原因で扁桃腺（へんとう切除）の部分的な外科的除去に通常小さいです。そのため、多国籍企業の数が少ない扁桃摘出サンプル...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain