פרוטוקול בידוד יעיל עבור B ו- T לימפוציטים משקדי הפלטין אדם

Summary

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Abstract

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Introduction

Tonsils are collections of incompletely encapsulated lymphoid tissues that lie under, and in contact with, the epithelium in the upper aero-digestive tract. Usually the term “tonsils” refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. The paired palatine tonsils together with the nasopharyngeal tonsil (adenoid), paired tubal tonsils and lingual tonsils constitute the so-called “Waldeyer´s ring”. The latter is responsible for the initial contact between inhaled or ingested pathogens and the lymphoid tissues of the aerodigestive tract^1,2. Indeed, numerous reports have shown that both bacterial and viral antigens can be detected in palatine tonsil tissue samples^2-6.

The palatine tonsils are composed of dense lymphoid tissue covered by a stratified squamous non-keratinising epithelium. The tonsils have numerous crypts, epithelial invaginations, which penetrate the parenchyma increasing the surface area. Histologically, the palatine tonsils contain numerous lymphoid follicles with germinal centers, which are the sites for B cell maturation and differentiation (B-cell areas). Likewise, the palatine tonsils encompass T cells, which are mainly located in the extrafollicular regions (T-cell areas). In addition to the B and T cells, also various follicular dendritic cells can be detected in palatine tonsils^1,2.

Due to their anatomic location, the palatine tonsils are easily accessible by surgical interventions. For example, surgical removal of tonsils, known as tonsillectomy, is routinely carried out worldwide⁷. In children with tonsillar hyperplasia, a partial surgical removal of the tonsils (tonsillotomy) is sometimes used, causing less postoperative pain to the patients. Considering the accumulation of various pathogens in tonsils, surgically removed tonsils provide a unique opportunity to study the influence of viral and bacterial agents on tonsillar lymphocyte functions^2,8. Furthermore it is possible to study if some pathogens prefer to reside in specific cell subpopulations⁹. In addition, as the tonsils are rich source of B lymphocytes, isolated tonsillar B lymphocytes can be efficiently used to study the activity of different B cell subpopulations¹⁰. However, as the palatine tonsils contain a mixture of cell types an efficient method to separate the different cell subpopulations is needed.

Here, we describe a simple method for efficient and rapid isolation of tonsillar B and T cell populations from human palatine tonsils by using a magnetic-activated cell separation technique (Figure 1). The method described here is useful for scientists who want to assess the role of different infectious agents in human lymphoid organs such as palatine tonsils.

Protocol

הפרוטוקול מתאר את הבידוד של תאי הלימפה מחומר מטופל אנושי ולכן דורש אישור אתי. נעשתה במחקר הנוכחי העבודה ניתנה על ידי המועצה לביקורת האתית אופסלה (DNR. 2013/387).

1. בידוד של תאי mononuclear (MNCs) משקדי הפלטין אדם

זהירות: כל חומר unscreened ממקור אנושי כמו דם, רקמות או נוזלי גוף צריכה להיחשב כחומר שעלול להיות נגוע. לכן, צריכים להיות אחרי נהלי בטיחות ביולוגית מומלצים לטיפול ברקמות האנושיות.

הערה: כדי למנוע זיהום, כל הפתרונות וציוד תרבית תאים חייבים להיות סטרילי. כל המאגרים והפתרונות צריכים להיות מראש מקוררים ושמרו על קרח. רקמות שקדים ותאים מבודדים צריכים להישמר וטיפלו על קרח.

1. השג שקדים טריים מחולים שעברו כריתת שקדים או tonsillotomy (איור 2). לצלול clum הרקמהנ.ב. לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר מלא פתרון קר כקרח סטרילי הנקס המאוזן מלח (HBSS) בתוספת 5% בסרום שור עוברי (FBS), 10 מ"מ גלוטמין, 0.05 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין ו -1% תערובת אנטיביוטיקת antimycotic (פניצילין, סטרפטומיצין וAmphotericin B).
2. שמור את הצינורות עם דגימות רקמת שקדים שקועות בכל העת על קרח. נסה לעבד את השקדים בהקדם האפשרי, ולא יאוחר מאשר 3 שעות לאחר הסרה כירורגית.
3. מניחים את השקדים בצלחת תרבית תאי פלסטיק 60 מ"מ על קרח ולשמור על הרקמה טבולה בHBSS. הסר קרישי דם גלויים, שומן ורקמות חיבור עם מלקחיים נקיים ממשטח השקדים.
4. השתמש בצלחת תרבית תאים חדשה 60 מ"מ המכילה 5 מיליליטר HBSS. חותך את גוש רקמת שקדים לתוך 3-10 ברי מ"מ בעזרת זוג מספריים סטרילי ו / או אזמל.
5. הכן צלחת תרבית תאים חדשה 60 מ"מ המכילה 10 מיליליטר של HBSS ולמקם 100 מיקרומטר מסננת תא פלסטיק בפתרון HBSS.
6. העבר את dissשברי שקדים השתקפו למסננת התא עם מלקחיים סטריליות. שימוש בסוף הבוכנה של מזרק פלסטיק, בצורה חלקה לסחוט את שברי רקמות דרך מסננת התא. ודא שברי השקדים שקועים לחלוטין בHBSS.
7. מחק את מסננת התא עם שרידי הרקמה ולהעביר את ההשעיה תא וכתוצאה מצלחת תרבית תאי 60 מ"מ לתוך צינור צנטריפוגות פלסטיק 50 מיליליטר. השאר את הצינור על קרח בזמן שתמשיך בצעדים 1.8 ו -1.9.
8. במקרה של שקדים גדולים, גדול מ- 2 סנטימטר בגודלם (איור 2), שברי השקדים לסחוט בשתי מסננות תא כדי למנוע סתימה של הרשת במסננת.
9. השג את הנפח הסופי של 35 מיליליטר של ההשעיה התא.
   הערה: בשלב זה ניתן להכין את ההשעיה התא להקפאה (ראה סעיף 2).
10. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות כגון Ficoll לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש. בעדינות שכבת suspens התאיון (שלב 1.9) על גבי פתרון שיפוע צפיפות. הימנע ערבוב של ההשעיה התא ופתרון שיפוע צפיפות.
    הערה: פתרון שיפוע הצפיפות יש חימם עד RT.
11. צנטריפוגה ההשעיה התא בהרוטור את נדנדה ב 700 XG במשך 20 דקות ב RT. לא להפעיל את פונקצית הבלם בצנטריפוגות כמו בלימה מהירה עלולים לשבש את השיפוע. כמו כן, להשתמש בפונקצית התאוצה הנמוכה ביותר זמינה בצנטריפוגה.
    הערה: לאחר שלב זה צנטריפוגה, להתבונן MNCs כשכבת רכה לבנה בממשק, ותאי דם אדומים (RBCs), fibroblasts ופסולת תא כמשקעים בתחתית של התחתית.
12. לאסוף בזהירות את שכבת MNCs באמצעות pipet 10 מיליליטר. מניחים את ההשעיה התא לתוך צינור צנטריפוגות 50 מיליליטר חדש.
13. להוסיף 25 מיליליטר של PBS קר כקרח להשעית התא ולסובב את הצינור ב XG 300 במשך 5 דקות בהרוטור את נדנדה על 4 מעלות צלזיוס.
14. הסר את supernatant באמצעות pipet 25 מיליליטרוחזור על שלב כביסה תא גלולה פעמים נוספות. לבסוף resuspend התא גלולה ב 15 מיליליטר של PBS.
    הערה: לאחר שלב הכביסה האחרון, אפשר cryopreserve ההשעיה התא (ראה סעיף 2).
15. החל 10 μl של השעיה תא לתא ספירת תאי hemocytometer ולספור את מספר התאים תחת מיקרוסקופ. לוותר את הכמות המתאימה של תאים (לדוגמא, 2-3 x 10 ⁷⁾ בצינור 15 מיליליטר צנטריפוגות להפרדת חרוז מגנטי שלאחר מכן. שמור aliquot זה על קרח עד שלב 3.2.

2. Cryopreservation של תאי שקדים

1. להכין מדיום הקפאה (FBS 90% ו -10% DMSO) ולשמור אותו על קרח. לאחסון לטווח ארוך לשמור על תקשורת ההקפאה ב -20 ° C.
2. לקבוע את המספר הכולל של תאים באמצעות תא ספירת תאי hemocytometer (שלב 1.15). לחשב את הכמות הנדרשת של מדיום הקפאה בהתאם לצפיפות התאים קפואים הרצוי (למשל, 10 ⁷ תאs / מיליליטר של מדיום הקפאה).
3. צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות. למזוג supernatant מבלי להפריע גלולה התא וresuspend התא גלולה במדיום הקפאה קר כקרח (משלב 2.1).
4. לוותר על 1 מיליליטר aliquots של ההשעיה התא לתוך צלוחיות סטריליים המיועדות לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי. להקפיא את הבקבוקונים בתא isopropanol ולאחסן אותם ב -80 CO ° / N. לשימור לטווח ארוך להעביר את הבקבוקונים לחנקן נוזלי המכיל מיכל אחסון או מקפיא תא C ° -140.
5. להפשיר צלוחיות עם תאים קפואים, לחמם אותם במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מייד כשהפשיר, לפזר את ההשעיה התא לתוך 10 מיליליטר של HBSS המחומם מראש (עם תוספים, שלב 1.1) בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. לסובב את הצינור ב XG 300 במשך 5 דקות, להסיר את HBSS וresuspend התא גלולה בצפיפות תאים הרצויה בHBSS (עם תוספים, שלב 1.1).
   הערה: הכדאיות של AF MNCsהפשרת ter היא בעל חשיבות, שכן הנוכחות של תאים מתים תקטין את התשואה הסופית של B מטוהר ולימפוציטים מסוג T.
   הערה: על פי הניסיון שלנו כדאיות תא פחות 80% יפחית את יעילות בידוד תא.

3. חיובי בחירה של T לימפוציטים אוכלוסייה מMNCs השקדים

הערה 1: פרוטוקול זה מבוסס על סלקציה חיובית של לימפוציטים CD3 ⁺ T האנושי מMNCs שקדים באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים את נוגדן CD3. אפשר להתחיל מסעיף זה טרי (סעיף 1) או (2 סעיף) MNCs הקפוא.

הערה 2: התחל עם 3 x 10 ⁷ MNCs. לא יעלה על מספר תא זה, מאז עמודות ההפרדה עלולות לסתום וזה יפחית את יעילות הבידוד. השתמש בעמודות גדולות יותר אם יותר תאים יטופלו. כרכי שימוש בפרוטוקול זה כבר מותאם באופן ניסיוני למספר תאינואד בהגדרת הניסוי שלנו.

1. הכן את חיץ ההפרדה [PBS (pH 7.2), 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 2 מ"מ EDTA]. סנן את חיץ ההפרדה דרך פילטר 0.45 מיקרומטר ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
2. ספין ההשעיה MNCs (שלב 1.14) ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולה וכתוצאה מכך התאים ב240 μl (80 μl לכל 10 ⁷ תאים) של חיץ הפרדה קר כקרח. מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי.
3. הוסף 20 μl של נוגדן מגנטי CD3 לפתרון התא. דגירה הצינורות עבור שעה 1 ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציף כדי לשמור על תאים בתרחיף.
4. להעביר את כל ההשעיה התא לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 5 מיליליטר חיץ הפרדה קר כקרח כדי לשטוף את התאים.
5. צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בהרוטור את נדנדה.
6. בינתיים הקים את המפריד ועמודה המגנטיים. צרף את המפריד המגנטי לדוכן ומניח את הטור בseparator. לשטוף את העמודה על ידי החלת 500 μl של חיץ הפרדה קר כקרח. מחק את הזרימה דרך.
7. מניחים צינור איסוף חדש 15 מיליליטר מתחת לעמודה. שמור את צינור האיסוף על קרח.
8. בטל supernatant (שלב 3.5) על ידי pipet ועדינות resuspend התא גלולה ב500 חיץ הפרדת μl. החל ההשעיה התא על גבי הטור מראש שטף ולתת לו לרוץ דרך.
   הערה: גושים סלולריים עלולים להדביק את הטור ובכך להקטין את קצב הזרימה. כדי למנוע בעיה זו, להציב מסננת תא פלסטיק 40 מיקרומטר בראש הטור. עובר תאים דרך רשת זה יהיה מאוד לשפר את היעילות של שיטה זו.
9. לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 1.5 מיליליטר של חיץ הפרדה (500 μl 10 ⁷ תאים). חכה למאגר הטור להיות ריק (לא נוזלי יש לשים לב בעמודה) לפני יישום שלב הכביסה הבא.
   הערה: השג את התאים ללא תווית CD3, נחשבים כחלק B לימפוציטים, כפי שהםeluted לתוך צינור האיסוף.
10. הסר את העמודה מהמפריד והמקום לתוך צינור איסוף 15 מיליליטר חדש. פיפטה 2 מיליליטר של חיץ הפרדה על הטור. באמצעות הבוכנה מסופקת עם הטור elute לימפוציטים מסוג T חיובי שנבחר, אשר נחשבים לחלק הלימפוציטים T.
11. לקבוע את מספר התאים מטוהרים (שלב 1.15) במידת צורך. השעיות תא מוכנות לניסויים במורד הזרם עכשיו.

4. ניתוח תזרים Cytometry של מבודד השקדים B ו- T לימפוציטים

זהירות: פתרון Paraformaldehyde הוא גירוי ומסרטן חשוד. ללבוש בגדים מתאימים מגן, כפפות, ועיניים / פנים הגנה.

הערה 1: פרוטוקול זה מתאר שיטה לצביעה ישירה של B המבודד ותאי T-ידי תא קרינה המופעל מיון ניתוח (FACS). המטרה העיקרית של שלב זה היא להעריך את טוהר של התא המבודד אוכלוסיות AFter CD3 הפרדת נוגדן מגנטי. לB זה המטרה הוקם וסמני תא T, נוגדנים חד שבטיים fluorophore מצומדות CD20-FITC וCD2-APC, משמשים. גם ההכללה של נוגדני שליטת אלוטיפ מומלץ מאוד להבחין "הרקע" שאינו ספציפי מחייב של נוגדני CD2 וCD20 (ראה שלב 4.8).

הערה 2: אפשר לשמור על שברי תאים המטוהרים בparaformaldehyde 1% פתרון (PFA) בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד למועד מכתים (למשל, למחרת.). גם באותו ההליך ישים אם קיים פער זמן בין הצביעה וניתוח FACS. זכור כי בשני המקרים יש לשטוף תאים כראוי עם PBSA (PBS המכיל 0.2% BSA) חיץ, לפני מכתים או ניתוח FACS.

1. קח את 6 x 10 ⁶ תאים של MNCs מצעד 1.15 (לפני החלת לעמודה), חלק ב 'הלימפוציטים מצעד 3.9 וחלק הלימפוציטים T מצעד 3.10.
2. ספין התאהשעיות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות הרוטור את נדנדה.
3. הסר את supernatant עם pipet ולשטוף את התא גלולה פעם אחת עם 1 מיליליטר של PBSA קר כקרח. ספין השעיות תא XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם pipet וresuspend תאים ב600 μl של חיץ PBSA קר כקרח.
4. להוסיף את ההשעיה תא 100 μl לתחתית צינור FACS.
5. להוסיף של PBS המכיל סרום אנושי מומת 10% חום לכל צינור 100 μl, מערבב היטב ודגירה ~ 1 דקות ב RT או 20 דקות על קרח.
   הערה: לימפוציטים מסוג B נושא קולטנים Fc. כדי לחסום קולטני Fc השברים התא המטוהרים מודגרת עם סרום אנושי מומת 10% חום. הסרום האנושי הוא חום מומת על ידי דגירה על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. מחלקים את סרום החום מומת לaliquots הקטן וחנות קפוא ב -20 ° C.
6. צנטריפוגה ההשעיה התא XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס בSWing-את הרוטור.
7. הסר את supernatant עם pipet ולשטוף את התא גלולה עם 1 מיליליטר PBSA. חזור על צנטריפוגה (300 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס).
8. הוספת 100 PBSA μl לתוך צינור אחד על קרח. מוסיף את הכמות המתאימה של נוגדנים חד שבטיים fluorophore מצומדות, על פי המלצת היצרן (לדוגמא, 20 μl של אנטי-CD20 ו / או 5 μl של נוגדנים-CD2 אנטי בPBSA של 100 μl). הערה: אל תשכח להקצות מספיק צינורות שליטה לניתוח FACS. בפרוטוקול זה יש לכלול את הפקדים הבאים: 1) תאים מוכתמים בנוגדנים נגד CD2 ואנטי-CD20 בנפרד, 2 תאים) מוכתמים הנוגדנים נגד CD2 ואנטי-CD20 שליטת אלוטיפ בנפרד ו, 3) תאים ללא תוספת של נוגדנים.
9. בקצרה מערבולת צינור דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
10. לשטוף 2 פעמים עם PBSA. הוסף 2 מיליליטר של 1% פתרון PFA לדגימות. בואו התאים להישאר בפתרון PFA ב 476; C בחושך עד שהזמן של ניתוח FACS.
11. מייד לפני הפעלת הדגימות במכונה FACS, לשטוף את התאים 2 פעמים עם PBSA (300 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס). דגימות Resuspend ב 1 מיליליטר של PBS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס (או על קרח), מוגנות מפני אור, לפני ההפרדה על cytometer את הזרימה.
12. האם מיון FACS הבא הפרוטוקול מcytometer זרימת היצרן.

5. PCR איתור של Adenovirus DNA במבודד השקדים B ו- T לימפוציטים

הערה 1: פריימרים גן hexon אדנווירוס הם AdRJC1 (5'-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3 ') וAdRJC2 (5'-CCGGCTGAGAAGGGTGTGCGCAGGTA-3') ^11. פריימרים אלו ליצור amplicon של 139 נ"ב. גן 18S rRNA המארח יכול להיות מזוהה עם tp206 פריימרים (5'-CCCCTCGATGCTCTTAGCTG-3 ') וtp207 (5'-TCGTCTTCGAACCTCCGACT-3 "). גודל amplicon הצפוי הוא 300 נ"ב.

הערה 2: בכל PCRטווח כולל שליטה שלילית (H ₂ O מזוקק) ושליטה חיובית DNA המתקבלת מקו B תא האנושי (BJAB) נגועה בסוג אדנווירוס האנושי 5 ^12.

1. תמצית ה- DNA (מלפחות x 1 10 ⁶ תאים, צעד 3.11) בשיטת טיהור טור מבוססת קרום סיליקה. לחלץ RNA באמצעות פנול וisothiocyanate guanidine פתרון ^13.
2. הוספת 100 DNA ng מ- B ולימפוציטים מסוג T לתערובת תגובה המכילה מאגר 1x HF, 0.2 מ"מ של תערובת אדנוזין deoxynucleotide (dNTP), 0.25 מיקרומטר של כל צבע יסוד ו1 U של האיכות הגבוהה DNA פולימרז בהיקף כולל של 20 μl.
3. בצע הגברה PCR בתנאי הרכיבה על אופניים הבאים: 30 שניות בdenaturation 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 30 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 67 ° C (hexon) או 58 ° C (18S rRNA) למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. תגובת PCR הסתיימה בצעד ארכה סופי של 7 דק 'ב 72 מעלות צלזיוס.
4. הפרד את מחזקי PCR וכתוצאה מכךמוצרי ication על 1.5% agarose ג'ל ב1x TBE חיץ ולדמיין להקות הצפויות על ידי צביעה עם כתם חומצות גרעין.

תוצאות

הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שקדים בתת אוכלוסיות נקיות במיוחד של לימפוציטים B ו- T. זה אושר על ידי ניתוח FACS באמצעות אנטי CD20 ואנטי-CD2 נוגדנים לזהות B והלימפוציטים T אוכלוסיות, בהתאמה (איור 3 א). לעומת זאת, הפרדה יעילה של תוצאות MNCs שבברי תאים שהם תערובת של תאים משני תת-או...

Discussion

אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על התוצאה של פרוטוקול זה הוא השימוש בחומר שקדים טרי כחומר מוצא. לכן, צריכים להיות מעובד דגימות השקדים בתוך 3 שעות לאחר ניתוח. ניתן להשיג שקדים משני מבוגרים וילדים. חומר השקדים מהילדים הוא בדרך כלל קטן יותר עקב הסרה כירורגית החלקית של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175-053	Contains 5% fetal bovine serum (FBS), 10 mM Glutamine,   0.05 mg/ml Gentamicin and 1% Antibiotic-Antimycotic mix
Freezing medium			90% FBS and 10% DMSO
MACS buffer			PBS (pH 7.2), 0.5% BSA and 2mM EDTA
PBSA			PBS containing 0.2% BSA
PFA			PBS containing 1% paraformaldehyde (PFA). Make fresh. PFA is suspected carcinogen. Wear gloves and goggles.
Antibiotic-Antimycotic mix	Gibco	15240-062
60 mm Petridish	Nunc	150326
Dissecting foreceps	Fisher Scientific	1381241
Straight iris scissors	Fisher Scientific	12912055
disposable scalpels	Swann-Morton	REF 0501
100 μm plastic cell strainer	Corning Life Sciences	352360
40 μm plastic cell strainers	Corning Life Sciences	352340
2 ml plastic syringe	BD Biosciences	300185
15 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62554502
50 ml conical centrifuge tubes	SARSTEDT	62547254
Low-speed centrifuge with fixed-angle or swinging-bucket rotor	Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R
Ficoll–Hypaque	Sigma-Aldrich	F5415-50ML	Ficoll solution
Fetal calf serum	Biological industries	040071A
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	SIGMA	D2650-5X5ML
MACS MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
MACS human CD3 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-092-881
MACS separator (Octo MACS)	Miltenyi Biotec	130-042-109
Bovine Serum Albumin (BSA)	Merck Millipore	1120180100
EDTA	AnalaR NORMAPUR	20302.293
CD2 conjugated to allophycocyanin (CD2-APC)	BD Biosciences	560642
CD20 conjugated to fluorescein isothiocyanate (CD20-FITC)	BD Biosciences	556632
Human serum	Rockland Immunochemicals	D119-0100
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F-530L
FACS tubes	BD Falcon	352003
Cryotube	SARSTEDT	72379
BD LSRII flowcytometer	BD Biosciences
BD FACSDiva 4.1 software	BD Biosciences
Nucleospin Blood	Macherey-Nagel	740951.50	DNA isolation kit
TRIzol  reagent	Life technologies	15596	RNA isolation reagent
Hemocytometer	The Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	0610030	cell counter device
GelRed	Biotium	41003	Nucleic acid gel stain