العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية

Summary

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Abstract

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Introduction

والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول لفصل الأبواغ الجرثومية من الخلايا البكتيرية الخضري في العينات البيئية. تشكيل الأبواغ البكتيرية هي استراتيجية البقاء على قيد الحياة، تسبب عادة عن طريق التجويع، وجدت في عدد من المجموعات البكتيرية التي تنتمي إلى الأسرة في اللغات افيرميكوتس ^1. ومدروسة البكتيريا المكونة للأبواغ، وذلك بسبب عدد من سلالات هي مسببات الأمراض، وبالتالي من الأهمية الطبية (على سبيل المثال، عصيات الجمرة الخبيثة أو المطثية العسيرة). وقد تم عزل سلالات من البكتيريا البيئية تشكيل أبواغ من كل تقريبا البيئة (التربة والمياه والرواسب والهواء والجليد وأمعاء الإنسان والحيوان الأمعاء، وأكثر) ^1-3. ولذلك، افيرميكوتس هي الثانية الأسرة في اللغات الأكثر وفرة في مجموعات ثقافة ^4.

بسبب هاردي قشرة خارجية ولب واقية البروتينات، ويمكن البقاء على قيد الحياة الأبواغ الظروف البيئية القاسية الاب تتراوحام جفاف للإشعاع عالية، ودرجات الحرارة القصوى والمواد الكيميائية الضارة ^5. هذه المقاومة الرائعة يجعل من التحدي لاستخراج الحمض النووي من الأبواغ ^6-8. هذا على الأرجح ما يفسر لماذا تم التغاضي عنها في دراسة التسلسل البيئي ^9،10. أساليب أخرى، مثل استهداف الأبواغ في عينات بيئية من قبل الأجسام المضادة الفلورسنت ^11، الكمي للحمض dipicolinic (د ب أ) في التربة والرواسب ^{12 13،} وتدفق الخلوي ¹⁴ أو استخدمت البسترة وزراعة اللاحقة ^15،16 لاسترداد أو تحديد الأبواغ في العينات البيئية. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت تسلسل الجينات أبواغ محددة ^10،17-20 طرق استخراج الحمض النووي الأمثل وكذلك الاشعال الجزيئية محددة لاستهداف. وقد ساعد ذلك للكشف عن المزيد من التنوع البيولوجي بين هذه المجموعة من البكتيريا ^21، وأدى أيضا إلى تطبيقات في الصناعة والطب للكشف عن الأبواغعلى سبيل المثال في الحليب المجفف ^19.

ويستند بروتوكول المقدمة هنا على الاختلاف في مقاومة الظروف الفيزيائية الضارة (مثل الحرارة والمنظفات) من الأبواغ الجرثومية قريبة الإنباتي الخلايا. لتدمير الخلايا النباتية في عينة، ونحن نطبق التوالي الحرارة، والليزوزيم وتركيزات منخفضة من المنظفات. وقد تم تحسين الوقت وقوة هذه المعالجات حتى لا تدمر الجراثيم، ولكن لليز جميع الخلايا النباتية. بعض الخلايا في تجمع الخلايا البيئي هي أكثر مقاومة من غيرها، وذلك من أجل زيادة احتمال تدمير كل الخلايا النباتية، ونحن نطبق ثلاثة علاجات مختلفة. ميزة والجدة من هذا الأسلوب هو أن الأبواغ بعد العلاج لا تزال على حالها، ويمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات المصب. وتشمل هذه استخراج الحمض النووي، PCR الكمي (QPCR) وamplicon أو التسلسل metagenomic (تستهدف على وجه التحديد على مجموعة من الأبواغ وبالتالي تقليل دiversity، في حين أن زيادة التغطية). ويمكن أيضا أن تستخدم الأبواغ لزراعة المصب أو الكمي بواسطة المجهر مضان، التدفق الخلوي، أو الكشف عن اتفاق سلام دارفور. سمة هامة من سمات هذا الأسلوب هو أنه بمقارنة عينة غير المعالجة مع عينة المعالجة، يمكن للمرء أن يستنتج كمية وتنوع الأبواغ في عينة بيئية بالإضافة إلى عنصر الموافق الإنباتي الخلايا.

Protocol

1. إعداد مواد كيميائية ومعدات

1. جعل 500 مل من 1٪ فوسفات الصوديوم (SHMP) (نابو _{3) ن} الحل وتعقيم بواسطة التعقيم.
2. تعقيم نتروسليلوز (NC) مرشحات (حجم المسام 0.22 ميكرون، وقطره 47 ملم) من خلال التعقيم في أطباق بتري الزجاج مغلقة.
3. تعقيم الفلاتر NC (حجم المسام 0.22 ميكرون، وقطره 25 ملم) من خلال التعقيم في أطباق بتري الزجاج مغلقة.
4. وزن ولاحظ الوزن الفارغ العقيمة 50 مل أنابيب (مع سقف) (أنبوب واحد لكل عينة).
5. إعداد تريس، EDTA العازلة (TE-عازلة) 1X: جعل الحل من 10 ملي تريس (تريس (hydroxymethyl) aminomethane) و 1 ملي EDTA العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 8 وتعقيم بواسطة التعقيم.
6. يعد حل الليزوزيم (20 ملغ / مل) عن طريق إذابة 0.02 غرام من الليزوزيم في 1 مل TE-العازلة. من الناحية المثالية، وجعل جديدة في كل مرة. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع.
7. يعد حل الفسيولوجية عن طريق إذابة 8 ز / L كلوريد الصوديوم(كلوريد الصوديوم) في الماء المقطر. تعقيم بواسطة التعقيم.

2. فصل الكتلة الحيوية من الرواسب

1. إضافة 3 غرام من عينة الرواسب إلى وزنه مسبقا معقمة 50 مل أنابيب باستخدام المجارف المعدنية ملتهب الإيثانول. تنفيذ هذا في نظيفة، والأشعة فوق البنفسجية تعقيم الوزراء للسلامة الأحيائية لتجنب التلوث.
2. إضافة 15 مل من 1٪ معقم (تعقيمها) حل SHMP إلى العينة باستخدام تخرج العقيمة السحاحة. ويمكن أيضا أن الحل SHMP تتم تصفيته لتجنب التلوث.
3. التجانس الرواسب وحل SHMP مع المفرق السائل / الخالط (على سبيل المثال، الترا Turrax الخالط). 70٪ من الإيثانول تعقيم الأوتوكلاف أو الدوار تشتت قبل استخدامها. تشغيل التجانس لمدة 1 دقيقة في 17500 دورة في الدقيقة. السماح للعينة راحة لمدة 2 دقيقة، وتكرار التجانس لمدة 1 دقيقة في نفس السرعة الدوار.
4. اسمحوا الوقوف العينة لمدة 10 دقيقة. في هذه الخطوة، فإن أثقل الجسيمات (المعادن) تسوية. الخلايا وأي مكون من مكونات العضوية من العينة ولكن ثتبقى سوء في الحل. بعد ذلك، نقل الحل طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية) إلى نظيفة أنبوب 50 مل، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الرواسب.
5. لبيليه الرواسب إضافة مرة أخرى 15 مل من 1٪ معقم (تعقيمها) حل SHMP باستخدام تخرج العقيمة السحاحة. ثم كرر الخطوات من 2.3 و 2.4. هذا التكرار يضمن الفصل بين أكبر قدر ممكن من الخلايا والجزيئات العضوية من المكون المعدنية في الرواسب. طاف من هذا الفصل الثاني يمكن دمجها مع طاف من الفصل الأول.
   ملاحظة: الخطوات التالية تتم كل يوم طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية). المكون المعدني (الرواسب بيليه) يمكن التخلص منها.
6. الطرد المركزي العينة في 20 x ج لمدة 1 دقيقة. هذه الخطوة تزيد من ز-ما يكفي من القوة لتسوية الجزيئات المعدنية الصغيرة في حين أن المواد خلية بيولوجية لا يزال في الحل. بعد الطرد المركزي، ونقل الحل طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية) إلىنظيفة أنبوب 50 مل. تجاهل بيليه المعدنية.
7. تحديد الحجم النهائي من محلول يحتوي على الكتلة الحيوية عن طريق وزن العينة. تحديد الوزن يتجنب الحاجة إلى نقل العينة إلى الاسطوانة، ويقلل من مخاطر التلوث.

3. جمع من الكتلة الحيوية على تصفية غشاء

1. تحضير وحدة الترشيح (47 ملم الأغشية قطر) ومضخة فراغ. تعقيم وحدة الترشيح إما عن طريق التعقيم أو (إذا بيركس زجاج) عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ والمشتعلة ذلك مع موقد بنسن. ندعه يبرد قبل الاستمرار في البروتوكول.
2. إضافة غشاء NC العقيمة إلى وحدة الترشيح باستخدام ملقط ملتهب الإيثانول تعقيمها.
3. إضافة نصف العينة طاف (من الخطوة 2.6) على وحدة الترشيح الغشائي وجمع الخلايا في الغشاء باستخدام مضخة فراغ.
4. عندما اجتاز السائل بالكامل من خلال التصفية، ووقف ضخ فراغ وإزالة الغشاء بعناية باستخدام إيثانرأ اللهب تعقيم الملقط. وضع الغشاء في طبق بتري معقمة.
   1. قطع الغشاء في نصف باستخدام مقص ملتهب الإيثانول تعقيمها. إضافة كل نصف الغشاء إلى منفصل أنبوب 2 مل. وسيتم استخدام نصف من الغشاء لاستخراج الحمض النووي وتحليل المجتمع البكتيريا بكامله. سيتم تخزين النصف الآخر من مرشح في -80 ° C وبمثابة نسخة احتياطية.
5. وضع غشاء NC الجديد على وحدة الترشيح وجمع الكتلة الحيوية من النصف الثاني من حجم العينة (من الخطوة 2.6) باستخدام مضخة فراغ.
6. عندما اجتاز السائل بالكامل من خلال التصفية، ووقف ضخ فراغ وإزالة الغشاء بعناية باستخدام ملقط ملتهب الإيثانول تعقيمها. وضع الغشاء بأكمله إلى منفصل أنبوب 2 مل. وسوف تستخدم هذه العينة لعلاج لفصل الأبواغ من الخلايا النباتية. يمكن تخزين العينة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. تحلل من الخلايا النباتية

1. أداءالعلاج لفصل الأبواغ من الخلايا النباتية على الكتلة الحيوية التي تم جمعها سابقا على غشاء NC (الخطوة 3.6).
   1. إذا تم تجميد الغشاء، وترك الأمر في RT لمدة 10 دقيقة إلى ذوبان الجليد. ثم وضع الغشاء في طبق بتري معقمة وقطع عليه (ما يقرب من 4 مرات) إلى أجزاء أصغر باستخدام مقص ملتهب الإيثانول تعقيمها. ثم ضع كل قطعة فلتر الغشاء في أنبوب معقم 2 مل.
2. إضافة 900 ميكرولتر من 1X TE (تريس، EDTA) العازلة (انظر 1.5) إلى الأنبوب الذي يحتوي على غشاء عينة ومزيج دقيق من قبل دوامة. في هذه الخطوة، تتم إزالة الكتلة الحيوية من الغشاء في حل TE-العازلة.
3. وضع أنبوب في حاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة. بعد ذلك إزالة أنبوب من الحاضنة وندعه يبرد لمدة 15 دقيقة.
4. إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة الليزوزيم (انظر 1.5) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. لا تقم بإضافة الليزوزيم قبل أن تبرد العينة إلى 37 درجة مئوية، وهذا يمكن أن تنكسرادي الانزيم.
5. احتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة، والظروف المثلى لالليزوزيم إلى ليز الخلايا النباتية.
6. بعد تحلل كامل، إضافة 250 ميكرولتر من 3 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) و 250 ميكرولتر من 6٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) حل للعينة. بإضافة هذه، وحجم عينة يبلغ 1.5 مل، وهناك تركيز النهائي من 0.5 N هيدروكسيد الصوديوم وتركيز النهائي من 1٪ SDS.
7. احتضان هذا المزيج في RT لمدة 60 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة. مضيفا القاعدة والمنظفات تساعد في تحلل الخلايا النهائي. وقد تم تحسين تركيز هذه المنظفات حتى لا تضر الأبواغ، بينما الناشر الخلايا النباتية.
8. تحضير وحدة الترشيح العقيمة التي تملك 25 مم الأغشية قطر قبل التعقيم، أو (إذا بيركس زجاج) الرش مع الايثانول 70٪ والمشتعلة ذلك مع موقد بنسن. ندعه يبرد.
9. وضع 0.2 ميكرون NC غشاء (25 مم) على وحدة الترشيح باستخدام ملقط الإيثانول اللهب تعقيمها.
10. إضافة عينة من الخطوة 4.7 على الغشاء وتصفية السائل باستخدام مضخة فراغ. عندما اجتاز السائل من خلال إيقاف مضخة فراغ. في هذه الخطوة، تتم إزالة المواد الخلية النباتية هي lysed، كما لا يتم الاحتفاظ على الغشاء. فقط سوف تبقى الأبواغ على الغشاء.
11. إضافة 2 مل من محلول معقم الفسيولوجية ليغسل المنظفات المتبقية وتصفية السائل باستخدام مضخة فراغ.
12. عندما السائل تمت تصفيتها بالكامل، إيقاف مضخة فراغ. ترك غشاء على وحدة الترشيح.

5. الدناز العلاج

ملاحظة: إجراء العلاج الدناز مباشرة على الغشاء التصفية. من المهم أن وحدة الترشيح لا تسرب ويتم تشغيل المضخة فراغ قبالة.

1. إضافة 450 ميكرولتر من الماء المعقم، 50 ميكرولتر من رد فعل العازلة الدناز (1X) و 0.5 ميكرولتر انزيم الدناز مباشرة على الغشاء مرشح والسماح لها الوقوف لمدة 15 دقيقة. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بذلك الهضم في الغرفة التي هو قليلا الحربمير من المتوسط ​​RT، منذ انزيم يعمل بشكل أفضل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية وما فوق.
   ملاحظة: الحفاظ على موقد بنسن جانبا وحدة الترشيح أيضا يزيد من درجة الحرارة وله فائدة إضافية تتمثل في الحفاظ على البيئة المحيطة عقيمة، وبالتالي تقليص خطر التعرض للتلوث العينات.
2. عند الانتهاء من عملية الهضم الدناز، بدوره على مضخة فراغ لإزالة الانزيم من العينة.
3. يغسل انزيم المتبقية عن طريق إضافة وتصفية 1 مل من محلول فيزيولوجي.
4. إذا اجتاز السائل تماما، إيقاف مضخة الفراغ وإزالة غشاء فلتر تحتوي على الأبواغ باستخدام ملقط معقم ووضعه في طبق بتري معقمة.
   ملاحظة: عينة من الأبواغ فصل مستعدة الآن لتحليل المصب. مخزن في -20 درجة مئوية إذا استخدمت لاستخراج الحمض النووي أو بدلا من ذلك في 4 درجات مئوية إذا تم استخدامها لإنبات وزراعة.

النتائج

وقد نشرت النتائج المقدمة هنا في وقت سابق ^10،21. يرجى الرجوع إلى تلك المواد لتفسير البيئي ومناقشة البيانات.

وتتلخص إجراءات الشامل في الشكل (1) ويتوافق مع ثلاث خطوات رئيسية: أولا، وفصل من الكتلة الحيوية من الرو...

Discussion

واستخدمت المقاومة من الأبواغ إلى العوامل الفيزيائية العدوانية الخارجية (على سبيل المثال، درجة الحرارة أو المنظفات) إلى ابتكار طريقة لفصل الأبواغ الجرثومية من الخلايا النباتية في عينات بيئية. هذا هو الأسلوب الشامل الأول لعزل الأبواغ من العينات البيئية بطر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	powder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic	IKA	3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylene
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich