Isolamento fisico di Endospore da campioni ambientali da mirata Lisi di cellule vegetative

Riepilogo

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Abstract

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Introduzione

L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo per la separazione di endospore batteriche da cellule batteriche vegetative in campioni ambientali. La formazione di endospore batteriche è una strategia di sopravvivenza, di solito innescato da inedia, trovato in un certo numero di gruppi di batteri appartenenti al phylum Firmicutes ^1. Batteri che formano endospore sono ben studiati, soprattutto a causa di un numero di ceppi sono patogeni e quindi di importanza medica (per esempio, il Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Ceppi ambientali di batteri che formano endospora sono stati isolati da praticamente ogni ambiente (suolo, acqua, sedimenti, aria, ghiaccio, intestino umano, gli animali intestino, e altro) ^1-3. Pertanto, Firmicutes sono la seconda phylum più abbondante nel collezioni di colture ^4.

A causa delle loro proteine ​​resistenti corteccia esterna e nucleo protettivo, endospore possono sopravvivere a condizioni ambientali estreme che vanno from essiccazione a radiazioni elevate, temperature estreme e sostanze chimiche nocive ^5. Questo notevole resistenza lo rende una sfida per estrarre il DNA da endospore ^6-8. Questo probabilmente spiega perché sono stati trascurati negli studi di sequenziamento ambientale ^9,10. Altri metodi, come ad esempio il targeting di endospore in campioni ambientali da anticorpi fluorescenti ^11, la quantificazione di acido dipicolinico (DPA) nel suolo e nei sedimenti ^{13 12,} citofluorimetria ^{14 o} la pastorizzazione e la successiva coltivazione ^15,16 sono stati utilizzati per recuperare o quantificare endospores in campioni ambientali. Negli ultimi anni, metodi di estrazione del DNA ottimizzato così come primers molecolari specifici per indirizzare sequenze geniche specifiche endospora sono stati sviluppati ^10,17-20. Ciò ha contribuito a rivelare di più la biodiversità tra questo gruppo di batteri ²¹ e ha portato anche ad applicazioni nell'industria e in medicina per il rilevamento di endospore, Per esempio in latte in polvere ^19.

Il protocollo qui presentata si basa sulla differenza di resistenza alle condizioni fisico-chimiche nocive (quali calore e detergenti) di endospore batteriche relativi alle cellule vegetative. Per distruggere le cellule vegetative in un campione, noi applichiamo consecutivamente calore, lisozima e basse concentrazioni di detergenti. Il tempo e la forza di questi trattamenti sono stati ottimizzati in modo da non distruggere le spore, ma per lisare tutte le cellule vegetative. Alcune cellule in un pool di cellule ambientale sono più resistenti di altre, per cui al fine di aumentare la probabilità di distruggere tutte le cellule vegetative, si applicano tre diversi trattamenti. Il vantaggio e la novità di questo metodo è che i endospore dopo il trattamento sono ancora intatte e possono essere utilizzati per ulteriori analisi a valle. Questi includono l'estrazione del DNA, PCR quantitativa (qPCR) e amplicone o sequenziamento metagenomica (di mira in particolare il gruppo di endospore e riducendo diversity, aumentando la copertura). Le endospore potrebbero essere utilizzati anche per la coltivazione a valle o la quantificazione mediante microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, o il rilevamento di DPA. Una caratteristica importante di questo metodo è che confrontando un campione non trattato con un campione trattato, si può dedurre la quantità e la diversità di endospore in un campione ambientale, oltre alla componente corrispondente al vegetative cellule.

Protocollo

1. Preparazione di prodotti chimici e attrezzature

1. Fare 500 ml di una esametafosfato di sodio all'1% (SHMP) (NaPO _{3) n} soluzione e sterilizzare in autoclave.
2. Sterilizzare nitrocellulosa (NC) filtri (diametro dei pori 0,22 micron, 47 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso Petri.
3. Sterilizzare filtri NC (dimensione dei pori di 0,22 micron, 25 mm di diametro) in autoclave in vetro chiuso piastre di Petri.
4. Pesare e prendere nota del peso a vuoto di sterili provette da 50 ml (con tappo) (un tubo per campione).
5. Preparare Tris-EDTA-buffer (TE-buffer) 1x: rendere la soluzione di 10 mM Tris (tris (idrossimetil) aminometano) e 1 tampone mM EDTA. Regolare il pH a 8 e sterilizzare in autoclave.
6. Preparare la soluzione di lisozima (20 mg / ml) sciogliendo 0,02 g di lisozima in 1 ml di TE-buffer. Idealmente, fare fresco ogni volta. Conservare a 4 ° C per non più di 1 settimana.
7. Preparare la soluzione fisiologica sciogliendo 8 g / l di cloruro di sodio(NaCl) in acqua distillata. Sterilizzare in autoclave.

2. Separazione di biomassa da sedimenti

1. Aggiungere 3 g di campione di sedimento di pre-pesare sterili provette da 50 ml con palline di metallo etanolo fiammato. Eseguire questo in una, UV sterilizzata armadio biosicurezza pulito per evitare la contaminazione.
2. Aggiungere 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% al campione utilizzando una sterile buretta. La soluzione può SHMP inoltre il filtraggio per evitare la contaminazione.
3. Omogeneizzare il sedimento e la soluzione SHMP con un dispersore liquido / omogeneizzatore (ad esempio, Ultra-Turrax omogeneizzatore). 70% di etanolo o sterilizzare in autoclave il rotore di dispersione prima dell'uso. Eseguire l'omogeneizzazione per 1 min a 17.500 rpm. Lasciare riposare campione per 2 minuti e ripetere l'omogeneizzazione per 1 min alla stessa velocità del rotore.
4. Lasciate riposare il campione per 10 min. A questo punto, le particelle più pesanti (minerali) si sistemerà. Le cellule ei componenti organici del campione tuttavia wmalato rimangono in soluzione. Successivamente, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in una provetta pulita da 50 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet sedimento.
5. Per il pellet sedimento aggiungere nuovamente 15 ml di una sterile (autoclave) Soluzione SHMP 1% con una sterile buretta. Poi ripetere i punti 2.3 e 2.4. Questa ripetizione assicura la separazione della quantità massima di cellule e particelle organiche dalla componente minerale del sedimento. Il supernatante di questa seconda separazione può essere fusa con il supernatante dal prima separazione.
   Nota: Le seguenti operazioni sono tutti fatti sul surnatante (contenente biomassa cellulare). La componente minerale (sedimenti pellet) può essere scartato.
6. Centrifugare il campione a 20 xg per 1 min. Questo passaggio aumenta la forza g sufficiente per risolvere piccole particelle minerali mentre il materiale cellula biologica rimane in soluzione. Dopo centrifugazione, trasferire la soluzione surnatante (contenente biomassa cellulare) in unpulito tubo da 50 ml. Eliminare il pellet minerale.
7. Determinare il volume finale della soluzione contenente biomassa pesando il campione. La determinazione del peso evita di dover trasferire il campione ad un cilindro graduato e riduce il rischio di contaminazione.

3. Raccolta di biomassa su membrana filtrante

1. Preparare unità di filtrazione (per 47 mm di membrane di diametro) e pompa del vuoto. Sterilizzare l'unità di filtrazione sia in autoclave o (se Pyrex vetro) spruzzando con il 70% di etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare prima di continuare con il protocollo.
2. Aggiungere sterili membrana NC all'unità di filtrazione con pinze sterilizzate etanolo fiammato.
3. Aggiungere metà del campione surnatante (dal punto 2.6) sul gruppo di filtrazione a membrana e raccogliere le cellule sulla membrana utilizzando la pompa a vuoto.
4. Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana utilizzando ethanol-fiamma pinza sterilizzata. Posizionare la membrana in una piastra di Petri sterile.
   1. Tagliare la membrana a metà con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Aggiungere ogni metà della membrana su un tubo separato 2 ml. Una metà della membrana sarà utilizzata per l'estrazione del DNA e l'analisi dell'intera comunità batterica. L'altra metà del filtro sarà conservato a -80 ° C e serve come backup.
5. Posizionare nuova membrana NC sul gruppo di filtrazione e raccogliere biomassa dalla seconda metà del volume del campione (dal punto 2.6) con la pompa a vuoto.
6. Quando il liquido è completamente passata attraverso il filtro, arrestare la pompa per vuoto e rimuovere con cautela la membrana con pinze sterili etanolo fiammato. Posizionare tutta la membrana in un tubo separato 2 ml. Questo campione verrà utilizzato per il trattamento di separare endospore da cellule vegetative. Il campione può essere conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso.

4. Lisi di cellule vegetative

1. Eseguire latrattamento per separare endospore dalle cellule vegetative sulla biomassa precedentemente raccolto su una membrana NC (passo 3.6).
   1. Se la membrana è stato congelato, lasciarlo a temperatura ambiente per 10 minuti per scongelare. Poi posto la membrana in una piastra di Petri sterile e tagliarlo (circa 4 volte) in pezzi più piccoli con le forbici sterilizzate etanolo fiammato. Poi posto tutti i pezzi del filtro a membrana in una provetta sterile da 2 ml.
2. Aggiungere 900 ml di 1x TE (Tris-EDTA) Buffer (vedi 1.5) per il tubo contenente la membrana campione e mescolare accuratamente vortice. A questo punto, la biomassa viene rimosso dalla membrana nella soluzione TE-buffer.
3. Porre il tubo in un incubatore a 65 ° C per 10 min e 80 rpm. Successivamente rimuovere il tubo dal termostato e lasciarlo raffreddare per 15 minuti.
4. Aggiungere 100 ml di lisozima preparata di fresco (vedi 1.5) per ottenere una concentrazione finale di 2 mg / ml. Non aggiungere il lisozima prima che il campione è raffreddato a 37 ° C, in quanto questo potrebbe degRade l'enzima.
5. Incubare il campione a 37 ° C per 60 min e 80 rpm, le condizioni ottimali per il lisozima di lisare cellule vegetative.
6. Dopo lisi è completa, aggiungere 250 ml di idrossido di 3 N di sodio (NaOH) e 250 ml di soluzione al 6% sodio dodecilsolfato (SDS) al campione. Aggiungendo questo, il volume del campione raggiunge 1,5 ml e vi è una concentrazione finale di 0,5 N NaOH e concentrazione finale di 1% SDS.
7. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 60 min e 80 rpm. Aggiunta la base e detergenti aiuterà nella lisi cellulare finale. La concentrazione di questi detergenti è stato ottimizzato per non danneggiare le endospore, mentre lisi cellule vegetative.
8. Preparare un'unità di filtrazione sterile che contiene 25 mm di diametro membrane in autoclave, o (se Pyrex vetro) spruzzandolo con 70% etanolo e fiamme con un becco Bunsen. Lasciate raffreddare.
9. Posizionare un NC membrana 0,2 micron (diametro 25 mm) in unità di filtrazione con pinze etanolo fiamma sterilizzati.
10. Aggiungere il campione dal punto 4.7 sulla membrana e filtrare il liquido con la pompa a vuoto. Quando il liquido è passato attraverso, spegnere pompa a vuoto. A questo punto, il materiale cellula vegetativa lisato viene rimosso, in quanto non è trattenuto sulla membrana. Solo endospore rimarranno sulla membrana.
11. Aggiungere 2 ml di soluzione fisiologica sterile per lavare detergenti residue e filtrare il liquido con la pompa a vuoto.
12. Quando il liquido è completamente filtrato, spegnere la pompa del vuoto. Lasciare la membrana sul gruppo di filtrazione.

5. Il trattamento DNasi

Nota: eseguire il trattamento DNasi direttamente sulla membrana del filtro. È importante che l'unità di filtrazione non perde e la pompa a vuoto è spento.

1. Aggiungere 450 ml di acqua sterile, 50 ml di tampone di reazione DNasi (1x) e 0,5 microlitri DNasi enzima direttamente sulla membrana del filtro e lasciar riposare per 15 minuti. Se possibile, fare questo digestione in una stanza che è un po 'di guerramer della media RT, poiché l'enzima funziona meglio a temperature di 25 ° C e oltre.
   Nota: Mantenere il becco Bunsen parte l'unità di filtrazione aumenta anche la temperatura e ha il vantaggio di mantenere le frazioni sterile, quindi ridotto rischio di contaminazione dei campioni.
2. Quando la digestione DNasi è terminato, accenda la pompa del vuoto per rimuovere l'enzima dal campione.
3. Lavare enzimatica residua aggiungendo e filtrando 1 ml di soluzione fisiologica.
4. Se del liquido è completamente superato, spegnere pompa del vuoto e rimuovere la membrana filtro contenente endospore con pinza sterile e posizionarlo in una piastra di Petri sterile.
   Nota: Il campione di endospore separati è ora pronto per l'analisi a valle. Conservare a -20 ° C se utilizzato per l'estrazione del DNA oppure a 4 ° C se utilizzato per la germinazione e la coltivazione.

Risultati

I risultati presentati qui sono stati pubblicati in precedenza ^10,21. Si prega di fare riferimento a tali articoli per l'interpretazione ambientale e discussione dei dati.

La procedura generale è riassunto in Figura 1 e corrisponde a tre fasi principali: in primo luogo, la separazione della biomassa da sedimenti o qualsiasi altra matrice ambientale; secondo, la distruzione di cellule vegetative; e terzo, l'analisi a valle delle endospore ...

Discussione

La resistenza di endospore a fattori fisico-chimici aggressivi esterni (ad esempio, temperatura o detergenti) è stato usato per elaborare un metodo per separare endospore batteriche da cellule vegetative in campioni ambientali. Questo è il primo metodo completo per isolare endospore da campioni ambientali in modo non distruttivo. I metodi precedenti per quantificare, rilevare o analizzare endospore in campioni erano basati sulla misurazione delle deleghe specifiche per endospore come l'acido dipicolinico ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	powder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic	IKA	3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylene
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich