O isolamento físico do Endospores de amostras ambientais por alvejado Lise de células vegetativas

Resumo

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Resumo

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Introdução

O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a separação de esporos bacterianos, a partir de células bacterianas vegetativas em amostras ambientais. A formação de esporos bacterianos é uma estratégia de sobrevivência, geralmente desencadeado pela inanição, encontrado num número de grupos de bactérias pertencentes ao filo Firmicutes ^1. Bactérias formadoras de Endospore são bem estudadas, principalmente porque um número de cepas são agentes patogênicos e, portanto, de importância médica (por exemplo, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Estirpes ambientais de bactérias formadoras de endospore foram isolados a partir de praticamente qualquer ambiente (solo, água, sedimentos, o ar, gelo, intestino humano, animais intestino, e mais) ^1-3. Portanto, Firmicutes são a segunda filo mais abundante em coleções de cultura ^4.

Por causa de suas proteínas córtex externo e do núcleo de protecção resistentes, endospores podem sobreviver a condições ambientais extremas que vão from dessecação à alta radiação, temperaturas extremas e produtos químicos prejudiciais ^5. Este notável resistência torna-se um desafio para extrair DNA de endósporos ^6-8. Isso provavelmente explica por que eles têm sido negligenciados nos estudos de sequenciamento ambiental ^9,10. Outros métodos, tais como a concentração de endósporos em amostras ambientais por anticorpos fluorescentes ^11, a quantificação de ácido dipicolínico (DPA) no solo e nos sedimentos ^{13 12,} por citometria de fluxo ¹⁴ ou a pasteurização e cultivo subsequente ^15,16 têm sido usados ​​para obter ou quantificar em endosporos amostras ambientais. Em anos recentes, os métodos de extracção de ADN optimizada, bem como iniciadores moleculares específicos para sequências alvo específicas do gene endospore foram desenvolvidos ^10,17-20. Isto tem ajudado a revelar mais biodiversidade entre este grupo de bactérias e ²¹ também levou a aplicações na indústria e medicina para a detecção de endospores, Por exemplo, em leite em pó ^19.

O protocolo aqui apresentado é baseado na diferença em resistência às condições físico-químicas prejudiciais (tais como o calor e detergentes) de endosporos bacterianos relativos a células vegetativas. Para destruir as células vegetativas em uma amostra, consecutivamente aplicar calor, lisozima e baixas concentrações de detergentes. O tempo e a força destes tratamentos foram optimizadas de forma a não destruir os esporos, mas de lisar todas as células vegetativas. Algumas células em uma piscina de células ambiental são mais resistentes do que outros, por isso, a fim de aumentar a probabilidade de destruir todas as células vegetativas, aplicamos três tratamentos diferentes. A novidade e vantagens deste método é que os endosporos após o tratamento ainda estão intactas e podem ser utilizados para outras análises a jusante. Estes incluem a extração de DNA, PCR quantitativo (qPCR) e amplicon ou seqüenciamento metagenomic (visando especificamente o grupo de endospores e, assim, reduzindo diversity, enquanto o aumento da cobertura). Os endosporos também poderia ser utilizada para o cultivo ou a jusante quantificação por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, ou a detecção de DPA. Uma característica importante deste método é que, ao comparar uma amostra não tratada com uma amostra tratada, pode-se deduzir a quantidade e diversidade de endósporos em uma amostra ambiental, além do componente que corresponde a células vegetativas.

Protocolo

1. Preparação de produtos químicos e equipamentos

1. Adicione 500 ml de um 1% de hexametafosfato de sódio (SHMP) _{(NaPO3) n} solução e esterilizar em autoclave.
2. Esterilizar de nitrocelulose (NC) (filtros de tamanho de poro de 0,22 um, 47 mm diâmetro) em autoclave de vidro em placas de Petri fechada.
3. Esterilizar filtros NC (dimensão do poro de 0,22 um, 25 mm de diâmetro) em autoclave de vidro em placas de Petri fechada.
4. Pesar e anotar o peso vazio da estéreis tubos de 50 ml (com tampa em) (um tubo por amostra).
5. Prepare de Tris-EDTA-tampão (tampão TE) 1x: preparar uma solução de Tris 10 mM (tris (hidroximetil) aminometano) e tampão de EDTA 1 mM. Ajustar o pH para 8 e esterilizar em autoclave.
6. Preparar solução de lisozima (20 mg / ml) por dissolução de 0,02 g de lisozima em 1 ml de tampão TE. Idealmente, fazer fresco o tempo todo. Armazenar a 4 ° C durante não mais de uma semana.
7. Preparar solução fisiológica por dissolução de cloreto de sódio 8 g / L(NaCl) em água destilada. Esterilizar em autoclave.

2. Separação de Biomassa de Sedimentos

1. Adicionar 3 g de amostra de sedimento para pré-pesado estéril tubos de 50 ml usando colheres de metal inflamado a etanol. Execute isso em um, UV esterilizado gabinete de biossegurança limpo para evitar a contaminação.
2. Adicionar 15 ml de uma solução estéril (autoclavada) solução SHMP 1% para a amostra usando uma bureta graduada estéril. O SHMP solução também pode ser filtrada para evitar a contaminação.
3. Homogeneizar o sedimento e SHMP solução com um dispersor líquido / homogeneizador (por exemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). 70% de etanol em autoclave ou esterilizar o rotor dispersão antes da utilização. Executar a homogeneização durante 1 minuto a 17.500 rpm. Deixe o resto da amostra durante 2 minutos e repetir a homogeneização durante 1 min à mesma velocidade do rotor.
4. Deixe a amostra repousar durante 10 min. Neste passo, as partículas mais pesadas (minerais) vai assentar. As células e os componentes orgânicos da amostra no entanto Wdoentes permanecem em solução. Em seguida, transferir a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) para um tubo limpo 50 ml, enquanto tomando cuidado para não perturbar o pellet sedimento.
5. Para o sedimento sedimentos adicionar novamente 15 ml de uma (autoclavada) solução SHMP 1% estéril usando um estéril bureta graduada. Em seguida, repita os passos 2.3 e 2.4. Esta repetição assegura a separação da quantidade máxima de células e partículas orgânicas do componente mineral do sedimento. O sobrenadante desta segunda separação pode ser mesclado com o sobrenadante da primeira separação.
   Nota: Todos os passos seguintes são feitas no sobrenadante (contendo biomassa celular). O componente mineral (sedimento sedimento) pode ser descartado.
6. Centrifugar a amostra a 20 xg durante 1 min. Esta etapa aumenta o g-força suficiente para resolver partículas minerais pequenas enquanto o material biológico celular ainda permanece em solução. Após centrifugação, transferir a solução sobrenadante (contendo biomassa celular) numlimpo tubo de 50 ml. Descartar o sedimento mineral.
7. Determinar o volume final da solução contendo biomassa por pesagem da amostra. A determinação do peso evita a necessidade de transferir a amostra para um cilindro graduado e reduz o risco de contaminação.

3. Cobrança de Biomassa no filtro de membrana

1. Prepare unidade de filtração (por 47 mm de diâmetro membranas) e bomba de vácuo. Esterilizar a unidade de filtração quer por autoclavagem ou (se vidro Pyrex) por aspersão com etanol a 70% e em chamas com um bico de Bunsen. Deixe-o esfriar antes de continuar com o protocolo.
2. Adicionar membrana NC estéril para a unidade de filtração usando uma pinça esterilizados inflamado a etanol.
3. Adicionar metade da amostra de sobrenadante (a partir do passo 2.6) para a unidade de filtração por membrana e recolher as células sobre a membrana usando a bomba de vácuo.
4. Quando o líquido tiver totalmente passado através do filtro, parar a bomba de vácuo e cuidadosamente remover a membrana utilizando etanol-chama fórceps esterilizado. Colocar a membrana em uma placa de Petri esterilizada.
   1. Corte a membrana ao meio com uma tesoura esterilizada inflamado a etanol. Adicionar cada metade da membrana para um tubo separado de 2 ml. Uma metade da membrana vai ser utilizado para a extracção do ADN e análise de toda a comunidade bacteriana. A outra metade do filtro vai ser armazenado a -80 ° C e serve como uma cópia de segurança.
5. Coloque nova membrana de NC para a unidade de filtração e recolha de biomassa a partir da segunda metade do volume da amostra (a partir do passo 2.6), utilizando a bomba de vácuo.
6. Quando o líquido está totalmente passou através do filtro, parar a bomba de vácuo e retire cuidadosamente a membrana com a pinça esterilizados inflamado a etanol. Coloque toda a membrana, para um tubo separado de 2 ml. Este exemplo vai ser utilizada para o tratamento de separar os esporos a partir de células vegetativas. A amostra pode ser armazenada a -20 ° C até à sua utilização.

4. Lise de células vegetativas

1. Execute otratamento para separar endosporos de células vegetativas da biomassa previamente recolhidas numa membrana de NC (passo 3.6).
   1. Se a membrana foi congelado, deixá-lo à TA durante 10 min para descongelar. Em seguida, coloque a membrana em uma placa de Petri estéril e cortá-la (aproximadamente 4 vezes) em pequenos pedaços com uma tesoura esterilizada inflamado a etanol. Em seguida, coloque todas as peças filtro de membrana em um tubo estéril 2 ml.
2. Adicionar 900 ul de 1x TE (Tris-EDTA) tampão (ver 1.5) para o tubo contendo a amostra de membrana e homogeneiza-se por vortex. Neste passo, a biomassa é removida a partir da membrana para a solução de tampão TE.
3. Colocar o tubo em uma incubadora a 65 ° C durante 10 min e 80 rpm. Depois retire o tubo da incubadora e deixe-o esfriar por 15 min.
4. Adiciona-se 100 ul de lisozima preparada de fresco (ver 1.5) para atingir uma concentração final de 2 mg / ml. Não adicione a lisozima antes de a amostra ter arrefecido até 37 ° C, pois isso poderia degRade a enzima.
5. Incubar a amostra a 37 ° C durante 60 min e 80 rpm, as condições óptimas para a lisozima para lisar as células vegetativas.
6. Após a lise estar completa, adicionar 250 ul de 3 N de hidróxido de sódio (NaOH) e 250 uL de solução a 6% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) para a amostra. Ao adicionar este, o volume da amostra atinge 1,5 ml e há uma concentração final de NaOH 0,5 N e a concentração final de 1% de SDS.
7. Incubar esta mistura à TA durante 60 min e 80 rpm. Adicionando a base e detergentes vai ajudar na lise celular final. A concentração destes detergentes foi otimizado para não prejudicar os endospores, enquanto lisar células vegetativas.
8. Prepara-se uma unidade de filtração estéril, que contém as membranas 25 mm de diâmetro por autoclavagem, ou (se vidro Pyrex) pulverizando-o com etanol a 70% e em chamas com um bico de Bunsen. Deixe-o esfriar.
9. Coloque uma membrana NC 0,2 m (25 mm de diâmetro) na unidade de filtração usando uma pinça etanol chama-esterilizados.
10. Adicionar a amostra a partir do passo 4.7 sobre a membrana e filtrar o líquido através da bomba de vácuo. Quando o líquido passou por, desligar a bomba de vácuo. Neste passo, o material de célula vegetativa lisadas é removido, uma vez que não é retida na membrana. Apenas endospores permanecerá na membrana.
11. Adicionar 2 ml de solução fisiológica estéril para lavar detergentes residuais e filtrar o líquido através da bomba de vácuo.
12. Quando o líquido foi totalmente filtrado, desligar a bomba de vácuo. Deixar a membrana da unidade de filtração.

5. O tratamento DNase

Nota: realizar o tratamento com DNase directamente na membrana de filtro. É importante que a unidade de filtração não se escapa e a bomba de vácuo é desligada.

1. Adicionar 450 uL de água estéril, 50 ul de tampão de reacção de ADNase (1x) e 0,5 ul de enzima ADNase directamente sobre a membrana de filtro e deixar repousar durante 15 min. Se possível, fazer isso digestão em uma sala que é ligeiramente guerramer que a média RT, uma vez que a enzima funciona melhor a temperaturas de 25 ° C e acima.
   Nota: Mantendo o bico de Bunsen de lado da unidade de filtração também aumenta a temperatura e tem o benefício adicional de manter o ambiente estéril, por conseguinte, um risco reduzido de contaminação das amostras.
2. Quando a digestão de DNase é acabado, em vez da bomba de vácuo para remover o enzima a partir da amostra.
3. Lavar enzimática residual por filtragem e adicionando 1 ml de solução fisiológica.
4. Se algum líquido tiver passado completamente, desligar a bomba de vácuo e remover a membrana de filtro endosporulante usando uma pinça estéril e colocá-lo em uma placa de Petri estéril.
   Nota: A amostra de endospores separados está agora pronto para análise a jusante. Armazenar a -20 ° C quando é usado para a extracção de ADN ou, alternativamente, a 4 ° C quando é usado para a germinação e cultivo.

Resultados

Os resultados aqui apresentados foram publicados anteriormente ^10,21. Por favor, consulte os artigos para a interpretação ambiental e discussão dos dados.

O processo global está resumida na Figura 1 e corresponde a três passos principais: em primeiro lugar, a separação da biomassa a partir de sedimentos ou qualquer outra matriz ambiental; Em segundo lugar, a destruição de células vegetativas; e em terceiro lugar, a análise a jusante dos...

Discussão

A resistência de endósporos a factores físico-químicos agressivos externos (por exemplo, temperatura ou detergentes) foi utilizado para conceber um método para separar os esporos bacterianos a partir de células vegetativas em amostras ambientais. Este é o primeiro método global para isolar os esporos a partir de amostras ambientais de uma maneira não destrutiva. Os métodos anteriores para quantificar, detectar e analisar os esporos foram em amostras com base na medição de proxies específicos para e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	powder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic	IKA	3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylene
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich