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Method Article
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
这项工作的目的是提供一种协议,用于细菌内生孢子的从营养细菌细胞环境样品中分离。细菌内生孢子的形成是一个生存策略,通常由饥饿触发,在多个属于脊索动物门厚壁菌门1细菌群体的发现。形成内生孢子的细菌被很好的研究,主要是因为一些菌株是病原体,因此医学重要(例如, 炭疽芽孢杆菌或艰难梭菌 )。形成内生孢子菌的环境菌株已分离出几乎所有的环境(土壤,水,沉淀物,空气,冰,人体肠道,内脏动物,和更多)1-3。因此,厚壁菌在培养物保藏4第二个最丰富的门。
由于其耐寒外皮层和保护核心蛋白,内生孢子能够生存极端的环境条件范围FROM干燥高辐射,极端温度和有害化学物质5。这一显着性使它成为一个挑战提取芽孢6-8 DNA。这可能解释了为什么他们被忽视了环境测序研究9,10。其他方法,如环境样品中内生孢子的荧光抗体11靶向,吡啶二羧酸的定量(DPA)中土壤12和沉积物13,流式细胞仪14或巴氏灭菌和随后的培养15,16已被用于在检索或量化生孢子环境样品。在最近几年,优化的DNA提取方法以及具体的分子的引物靶向生孢子特异性基因序列已经被开发10,17-20。这有助于揭示这组细菌21之间更多的生物多样性,并且也导致了内生孢子的检测应用在工业和医药中,例如在奶粉19。
这里介绍的协议是基于到有害的物理化学条件(例如热和洗涤剂)相对于营养细胞细菌内生孢子的电阻的差别。以破坏营养细胞的样品中,我们连续施加热,溶菌酶和低浓度的洗涤剂。这些治疗的时间和强度都得到了优化,以便不破坏孢子,但以裂解所有营养细胞。一些细胞在一个环境室池比其它更耐磨,所以为了提高破坏所有营养细胞的概率,我们应用了三种不同的治疗方法。这种方法的优点和新颖性在于仍保持原样,在处理后的内生孢子可用于进一步下游分析。这些包括DNA提取,定量PCR(qPCR的)和扩增子或宏基因组测序(专门针对组内生孢子的,从而减少ðiversity,同时增加覆盖)。的内生孢子也可以用于下行种植或定量由荧光显微镜,流式细胞仪,或检测DPA的。这种方法的一个重要特征是,通过未处理样品与处理过的样品进行比较,可以推断出内生孢子的数量和多样性环境样品中除了对应于营养细胞的组件。
1.制备化学品和设备
从沉积物2.分离生物质
3.生物质收集在滤膜
4.裂解营养细胞
5. DNA酶处理
注意:直接在过滤膜执行DNase处理。重要的是,过滤部不泄漏是重要的,所述真空泵是关闭的。
这里介绍的结果前面已经10,21公布。请参阅那些条数据的环境解释和讨论。
整体过程总结在图1中,对应于三个主要步骤:首先,从沉淀物或任何其他环境矩阵生物质的分离;第二,营养细胞的破坏;和第三,分离的内生孢子的下游分析。下游分析可以由,例如,DNA提取和扩增子测序以确定多样性。的DNA提取需要优化以保证内生孢子的裂解。在沉积物样品,我?...
内生孢子外部攻击性理化因素 (如温度或清洁剂)的电阻来设计一种方法,从营养细胞环境样品中分离的细菌芽孢。这是第一个全面的方法来隔离环境样品的内生孢子在非破坏性的方式。以前的方法来定量,检测或分析样品中内生孢子是根据特定的代理内生孢子诸如吡啶二羧酸或特定的标记基因的测定。与此相反,与协议这里介绍,比生孢子其他样品组分被去除,所以内生孢子最终仍作为...
作者什么都没有透露。
作者承认瑞士国家科学基金会的批准号:31003A-一分之一十三万二千三百五十八,31003A_152972和No. 151948,和基金会皮埃尔·名士倒拉科学。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich |
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