식물 세포의 표적으로 용해하여 환경 시료에서 내생 포자의 물리적 분리

요약

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

초록

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

서문

이 연구의 목적은 환경 시료에서 식물 세균 세포에서 세균 내생 포자의 분리를위한 프로토콜을 제공하는 것이다. 박테리아 내생 포자의 형성은 문 후벽 균 ¹ 그룹에 속하는 박테리아의 수에서 발견 생존 전략, 보통 기아에 의해 유발된다. 내생 포자 형성 세균이 잘 균주의 수는 병원균 따라서 의료의 중요성 (예를 들어, 탄저균이나 클로스 트리 디움 디피)의 주로하기 때문에, 연구한다. 내생 포자 형성 박테리아의 환경 균주는 거의 모든 환경 (토양, 물, 퇴적물, 공기, 얼음, 인간의 직감, 동물의 창자 등) ^1-3에서 고립되었다. 따라서, 후벽 균 배양 컬렉션 ^(4)에서 두 번째로 가장 풍부한 문이다.

때문에 튼튼한 외부 피질 및 보호 핵심 단백질, 내생 포자는 FR에 이르기까지 극단적 인 환경 조건을 견딜 수높은 방사선, 극한의 온도 및 유해 화학 물질 ⁵ 옴 탈수. 이 놀라운 저항은 내생 포자 ^6-8에서 DNA를 추출하는 도전한다. 그들은 환경 시퀀싱 연구 ^9,10에서 간과 된 이유는 가능성을 설명합니다. 형광 항체 ^(11)에 의해 환경 시료의 내생 포자의 대상과 같은 다른 방법, 토양 ^12, 퇴적물 ¹³ dipicolinic 산의 정량 (DPA)은 ¹⁴ 유동 세포 계측법 또는 저온 살균 이후 재배 ^{(15, 16)는에} 내생 포자를 검색하거나 정량화하는데 사용되어왔다 환경 시료. 최근, 최적화 된 DNA 추출 방법뿐만 아니라, 특정 분자 프라이머 내생 포자 특정 유전자 서열은 ^{10,17-20 개발} 된 타겟팅한다. 이 박테리아 ^(21)이 그룹들 사이에서 더 많은 생물 다양성을 나타 내기 위해 도움이 또한 내생 포자의 검출을위한 산업 및 의학에 응용하게되었다, 우유 분말 ^(19)의 예를 들어.

여기에 제시된 프로토콜은 식물 세포에 대하여 내생 포자의 세균 (예 : 열 및 세제 등) 유해한 물리 화학적 조건에 저항의 차이에 기초한다. 샘플에서 식물 세포를 파괴하기 위해, 우리는 연속적으로 열, 리소자임과 세제의 낮은 농도를 적용합니다. 포자를 파괴하지만, 모든 식물 세포를 용균하지 않도록 이러한 치료의 시간과 강도를 최적화되었다. 환경 세포 풀의 일부 셀들은 다른 것보다 더 내성이므로, 모든 식물 세포 파괴의 확률을 증가시키기 위해, 우리는 세 가지 다른 치료를 적용한다. 이 방법의 장점 및 신규성은 치료 후 내생 포자는 그대로이며, 하류의 분석에 이용 될 수 있다는 것이다. 이들은 D를 감소 따라서 DNA 추출, 정량 PCR (qPCR에) 및 앰플 리콘 또는 특히 내생 포자의 그룹을 대상으로 metagenomic 시퀀싱 (및 포함iversity) 범위 증가한다. 또한 하류 내생 포자 배양 또는 형광 현미경으로 정량에 사용될 수있는, 유동 세포 계측법, 또는 DPA의 검출. 이 방법의 중요한 특징은 처리 된 샘플과 미처리 샘플과 비교하여, 하나의 셀에 대응하는 식물 성분 외에 환경 샘플에서 내생 포자의 양과 다양성을 추론 할 수 있다는 점이다.

프로토콜

화학 물질 및 장비의 1. 준비

1. 1 %의 나트륨 헥사 (SHMP) (나포 _{3) N} 용액 500 mL로하고 고압 증기 멸균에 의해 소독.
2. 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 멸균 니트로 셀룰로오스 (NC) 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 47mm).
3. 폐 유리 페트리 접시에서 고압 증기 멸균에 의해 NC 필터 (기공 크기 0.22 μm의 직경 25mm)를 소독.
4. 무게 (에 캡) 멸균 50 ㎖ 튜브의 빈 무게 (샘플 당 하나의 튜브를) 참고.
5. EDTA 트리스 완충액 (TE 버퍼) (1X)를 준비 : 10 mM 트리스 (트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄) 및 1 mM의 EDTA 완충액 용액을 만든다. 8 산도를 조정하고 고압 증기 멸균에 의해 소독.
6. 1 ㎖의 TE 완충액에 리소자임 0.02 g을 용해하여 리소자임 용액 (20 ㎎ / ㎖)을 제조. 이상적으로, 때마다 신선한합니다. 더 이상 1 이상 주 4 ℃에서 보관하십시오.
7. 8g / L 염화 나트륨을 용해시켜 용액을 제조 생리증류수 (염화나트륨). 고압 증기 멸균에 의해 소독.

퇴적물에서 바이오 매스 2. 분리

1. 퇴적물 시료 3 g을 에탄올 골조 금속 국자를 사용하여 50 ㎖ 튜브를 멸균 무게를 사전에 추가합니다. 오염을 방지하기 위해 깨끗하고 자외선 살균 바이오 안전성 캐비닛에이를 수행합니다.
2. 멸균이 뷰렛을 졸업 사용하여 샘​​플에 1 % 살균 (멸균) SHMP 솔루션의 15 ML을 추가합니다. SHMP 용액은 오염을 방지하기 위해 필터링 될 수있다.
3. 액체 분산기 / 균질 (예를 들어, 울트라 타락 균질)와 침전물과 SHMP 솔루션을 균질화. 70 % 에탄올 소독 또는 사용하기 전에 분산 로터를 압력솥. 17,500 rpm에서 1 분간 균질화를 실행합니다. 2 분 동안 샘플 나머지를하자 같은 회 전자 속도에서 1 분 동안 균질화를 반복합니다.
4. 샘플은 10 분 동안 서 보자. 이 단계에서 가장 무거운 입자 (미네랄) 해결됩니다. 그러나 세포와 w 샘플 중 유기 성분병이 용액에 남아 있습니다. 퇴적물 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 그 후, 깨끗한 50 ML 튜브에 뜨는 용액 (포함하는 세포 바이오 매스)을 전송합니다.
5. 침전물 펠릿에 멸균이 뷰렛을 졸업하여 1 % 살균 (멸균) SHMP 솔루션 다시 15 ml를 추가합니다. 그런 다음 반복 2.3 및 2.4 단계를 반복합니다. 이 반복은 퇴적물의 미네랄 성분으로부터 세포 및 유기 입자의 최대 양의 분리를 보장한다. 이 제 2 분리의 상등액을 제 1 분리에서 상등액과 병합 될 수있다.
   주 : 다음 단계는 모든 (셀 바이오 매스를 포함) 상층 액에서 수행된다. 미네랄 성분 (퇴적물 펠렛) 폐기 될 수있다.
6. 1 분 20 XG에서 샘플을 원심 분리기. 생물 세포 물질은 여전히​​ 용액에 남아있는 동안이 단계는 작은 광물 입자를 해결하기에 충분 G-힘을 증가시킨다. 원심 분리 후, 상청에 용액 (세포 함유 매스)를 전송할깨끗한 50 ML 튜브. 미네랄 펠렛을 폐기하십시오.
7. 샘플을 계량하여 바이오 매스를 함유하는 용액의 최종 부피를 결정한다. 가중치 결정 눈금 실린더에 시료를 전송하는 데 및 오염의 위험을 감소 피한다.

필터 멤브레인에 바이오 매스의 3 컬렉션

1. 여과 장치 (47mm 직경 멤브레인) 및 진공 펌프를 준비합니다. 고온 가압 멸균하여 70 % 에탄올을 분무 분젠 버너로 타오르는 그래피 (파이렉스 유리의 경우) 중 여과 부 소독. 이 프로토콜을 계속하기 전에 식혀 보자.
2. 에탄올 골조 멸균 집게를 사용하여 여과 장치에 멸균 NC 멤브레인을 추가합니다.
3. 진공 펌프를 사용하여 멤브레인에 세포 막 여과 장치에 (단계 2.6)에서 시료의 상층 액의 절반을 첨가하고 수집한다.
4. 액체가 완전히 필터를 통과 한 경우, 진공 펌프를 정지하고 이단을 사용하여 조심스럽게 제거 막OL-불꽃 집게를 소독. 멸균 페트리 접시에 막 놓습니다.
   1. 에탄올 골조 멸균 가위를 사용하여 반으로 막을 잘라. 별도의 2 ML 튜브에 막의 각각의 절반을 추가합니다. 멤브레인의 절반은 DNA 추출 및 사회 전체 박테리아의 분석을 위해 사용된다. 필터의 다른 절반은 -80 ° C에서 저장 및 백업의 역할을한다.
5. 여과 유닛 상에 새로운 NC 멤브레인을두고 진공 펌프를 사용하여 (단계 260)에서 샘플 볼륨의 후반에서 미생물을 모은다.
6. 액체가 완전히 필터를 통과 한 경우, 진공 펌프를 정지하고 신중 에탄올 골조 멸균 집게를 사용하여 멤브레인을 제거한다. 별도의 2 ML 튜브로 전체 막 놓습니다. 이 샘플은 식물 세포로부터 내생 포자를 분리하는 처리를 위해 사용될 것이다. 시료를 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 될 수있다.

식물 세포의 용해 (4)

1. 수행치료 이전에 NC 막 (단계 3.6)에 수집 된 바이오 매스에 식물 세포에서 내생 포자를 분리합니다.
   1. 멤브레인이 동결 된 경우 해동 실온에서 10 분 동안두고. 그런 다음 멸균 페트리 접시에서 막을 배치하고 에탄올 골조 멸균 가위를 사용하여 작은 조각으로 (약 4 배)를 잘라. 그런 다음 멸균 2 ML 튜브에 모든 멤브레인 필터 조각을 배치합니다.
2. 샘플 멤브레인을 포함하는 튜브에 1X TE (트리스 - EDTA) 버퍼의 900 μl를 (1.5 참조) 추가 소용돌이에 의해 철저하게 섞는다. 이 단계에서, 바이오 매스-TE 완충액으로 막으로부터 제거된다.
3. 10 분 80 rpm으로 65 ° C에서 인큐베이터에서 튜브를 놓습니다. 그 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 15 분 동안 냉각 수 있습니다.
4. 2 mg / ml의 최종 농도에 도달하기 위해 새로 제조 라이소자임 (1.5 참조) 100 ㎕를 추가한다. 샘플을 37 ℃로 냉각되기 전에이 내지 수 있기 때문에, 라이소자임를 추가하지 마십시오효소 rade.
5. 리소자임에 대한 최적 조건은 식물 세포를 용해시키기 위하여, 60 분, 80 rpm으로 37 ℃에서 샘플을 배양한다.
6. 용해가 완료되면, 3 N 수산화 나트륨 (NaOH) 샘플 6 % 도데 실 황산나트륨 (SDS) 용액을 250 μL의 250 μL를 추가한다. 이 첨가에 의해, 시료 부피는 1.5 ㎖에 도달하여, 0.5 N NaOH를 최종 농도 1 % SDS의 최종 농도가있다.
7. 60 분 80 rpm으로 실온에서이 믹스를 품어. 베이스와 세제를 추가하면 최종 세포 용해에 도움이 될 것입니다. 식물 세포를 용균 동안 이러한 세제의 농도는, 내생 포자를 해치지하도록 최적화되어있다.
8. (파이렉스 유리의 경우) 70 % 에탄올로 분무하고 분젠 버너 화염을 오토 클레이브에 의해 직경 25mm 막을 보유, 또는 멸균 여과 유닛을 준비한다. 이 식히십시오.
9. 에탄올 화염 멸균 집게를 사용하여 여과 유닛에 0.2 μm의 NC 막 (25mm 직경)을 배치했다.
10. 멤브레인 상 단계 4.7에서 샘플을 추가하고, 진공 펌프를 사용하는 액체 필터. 액체가 통과되면, 진공 펌프의 전원을 끄십시오. 이 막 상에 유지되지 않기 때문에이 단계에서 분해 된 식물 세포의 재료가 제거된다. 만 내생 포자는 막에 남아있을 것이다.
11. 잔류 세제를 씻어 진공 펌프를 사용하여 액체를 필터링하는 멸균 생리 용액 2 ㎖를 추가한다.
12. 액체가 완전히 여과되면, 진공 펌프의 전원을 끄십시오. 여과 장치의 멤브레인을 남겨주세요.

5. DNase의 치료

주 : 여과막에 직접 D​​Nase의 처리를 수행한다. 이 여과 장치가 누출되지 않는 것이 중요하고, 진공 펌프는 턴 오프된다.

1. 필터 막에 멸균 물 450 μL, 직접 D​​Nase의 반응 버퍼 (1X) 0.5 μL DNase의 효소의 50 μl를 추가하고 15 분 동안 서 보자. 가능하면, 약간 전쟁 방에서이 소화 할평균 RT보다 르, 효소는 위의 25 ° C에서의 온도에서 잘 작동하기 때문이다.
   주 : 분젠 버너를 늘리지 따로 여과 장치는 또한 온도가 증가하고 무균 환경을 유지하는 추가적인 장점을 가지며, 따라서 샘플의 오염의 위험을 감소시켰다.
2. DNase의 분해가 완료되면, 샘플로부터 효소를 제거하기 위해 진공 펌프를 켜.
3. 추가 및 생리 액 1ml를 필터링하여 잔여 효소를 씻어 내십시오.
4. 액체가 완전히 통과 한 경우, 진공 펌프를 끄고 멸균 집게를 사용하여 멸균 페트리 접시에 배치 내생 포자가 들어있는 필터 멤브레인을 제거합니다.
   주 : 분리 내생 포자의 샘플을 지금 다운 스트림 분석을위한 준비가되어 있습니다. 발아와 재배에 사용되는 경우 -20 ° C에서 보관은 DNA 추출을 위해 또는 다른 4 ° C에서 사용합니다.

결과

여기에 제시된 결과는 이전 ^10,21 발표되었다. 데이터의 환경 적 해석과 설명은 해당 문서를 참조하십시오.

전체 절차를도 1에 요약 및 세 개의 주요 단계에 해당된다 : 첫째, 침전물 또는 다른 환경적인 행렬에서의 바이오 매스의 분리; 둘째, 식물 세포의 파괴; 그리고 세 번째, 분리 된 내생 포자의 하류 분석. 하류 분석 다양성을 결정하는 DNA 추출 및 앰플...

토론

외부 공격적인 물리 화학적 요인 (예를 들면, 온도 또는 세제)에 내생 포자의 저항은 환경 시료에서 식물 세포에서 세균 내생 포자를 분리하는 방법을 고안 하였다. 이것은 비파괴 방식으로 환경 시료로부터 내생 포자를 분리하는 제 광범위한 방법이다. , 양을 감지하거나 샘플 내생 포자를 분석하는 이전 방법 등 dipicolinic 산 또는 특정 마커 유전자와 같은 내생 포자에 대한 특정 프록시의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	powder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic	IKA	3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylene
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich