El aislamiento físico de endosporas de muestras ambientales por Targeted lisis de las células vegetativas

Resumen

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Resumen

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Introducción

El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para la separación de las endosporas bacterianas a partir de células bacterianas vegetativas en muestras ambientales. La formación de endosporas bacterianas es una estrategia de supervivencia, por lo general desencadenada por la inanición, que se encuentra en una serie de grupos de bacterias pertenecientes a la phylum Firmicutes ^1. Bacterias que forman endosporas están bien estudiados, principalmente debido a que un número de cepas son patógenos y, por tanto, de importancia médica (por ejemplo, Bacillus anthracis o Clostridium difficile). Cepas ambientales de bacterias formadoras de endosporas se han aislado de prácticamente cualquier entorno (suelo, agua, los sedimentos, el aire, hielo, intestino humano, animales intestino, y más) ^1-3. Por lo tanto, Firmicutes son el segundo phylum más abundante en las colecciones de cultivos ^4.

Debido a sus proteínas de la corteza externa y el núcleo de protección resistentes, endosporas pueden sobrevivir en condiciones ambientales extremas que van from desecación de alta radiación, temperaturas extremas y sustancias químicas nocivas ^5. Este notable resistencia hace que sea un reto para extraer el ADN de las endosporas ^6-8. Esto probablemente explica por qué se les ha pasado por alto en los estudios de secuenciación del medio ambiente ^9,10. Otros métodos, tales como la orientación de endosporas en muestras ambientales por anticuerpos fluorescentes ^11, la cuantificación de ácido dipicolínico (DPA) en el suelo ¹² y el sedimento ^13, citometría de flujo ¹⁴ o pasteurización y posterior cultivo de ^15,16 se han utilizado para recuperar o cuantificar en endosporas muestras ambientales. En los últimos años, los métodos de extracción de ADN optimizada, así como cebadores moleculares específicos a secuencias diana de genes-endosporas específica se han desarrollado ^10,17-20. Esto ha ayudado a revelar más biodiversidad en este grupo de bacterias ²¹ y también ha dado lugar a aplicaciones en la industria y la medicina para la detección de endosporas, Por ejemplo en la leche en polvo ^19.

El protocolo que aquí se presenta se basa en la diferencia de resistencia a las condiciones físico-químicas nocivas (como el calor y detergentes) de endosporas bacterianas en relación con las células vegetativas. Para destruir las células vegetativas en una muestra, que consecutivamente aplicar calor, lisozima y bajas concentraciones de detergentes. El tiempo y la fuerza de estos tratamientos han sido optimizados a fin de no destruir las esporas, pero para lisar todas las células vegetativas. Algunas células en una piscina de células del medio ambiente son más resistentes que otros, por lo que con el fin de aumentar la probabilidad de destruir todas las células vegetativas, se aplican tres tratamientos diferentes. La ventaja y novedad de este método es que las endosporas después del tratamiento están todavía intactos y pueden ser utilizados para otros análisis aguas abajo. Estos incluyen la extracción de ADN, PCR cuantitativa (qPCR) y amplificación o secuenciación metagenómica (dirigido específicamente al grupo de endosporas y por lo tanto la reducción dIVERSIDAD, al tiempo que aumenta la cobertura). Las endosporas también podrían utilizarse para el cultivo de aguas abajo o cuantificación por microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, o detección de DPA. Una característica importante de este método es que mediante la comparación de una muestra no tratada con una muestra tratada, se puede deducir la cantidad y diversidad de endosporas en una muestra ambiental, además de la componente correspondiente a las células vegetativas.

Protocolo

1. Preparación de los productos químicos y equipo

1. Hacer 500 ml de una hexametafosfato de sodio 1% (SHMP) _{(NaPO3) n} solución y esterilizar en autoclave.
2. Esterilizar nitrocelulosa (NC) Filtros (tamaño de poro de 0,22 m, diámetro 47 mm) por autoclave en platos de cristal cerrado Petri.
3. Esterilizar filtros NC (tamaño de poro de 0,22 m, 25 mm de diámetro) en autoclave en platos de vidrio cerrado de Petri.
4. Pesar y anotar el peso en vacío de 50 ml tubos estériles (con tope a) (un tubo por muestra).
5. Preparar Tris-EDTA-buffer (tampón TE) 1x: hacer una solución de Tris 10 mM (tris (hidroximetil) aminometano) y EDTA 1 mM tampón. Ajustar el pH a 8 y esterilizar en autoclave.
6. Preparar la solución de lisozima (20 mg / ml) disolviendo 0,02 g de lisozima en 1 ml de tampón TE. Lo ideal es hacer fresco cada vez. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 semana.
7. Preparar la solución fisiológica disolviendo / L de cloruro de sodio 8 g(NaCl) en agua destilada. Esterilizar en autoclave.

2. Separación de la biomasa a partir de sedimentos

1. Añadir 3 g de muestra de sedimento de tarados estéril tubos de 50 ml utilizando cucharas de metal con etanol flameado. Realice esto en una, UV esterilizada gabinete de bioseguridad limpia para evitar la contaminación.
2. Añadir 15 ml de una solución SHMP 1% estéril (autoclave) a la muestra usando una bureta graduada estéril. La solución SHMP también puede ser filtrada para evitar la contaminación.
3. Homogeneizar el sedimento y la solución SHMP con un dispersor líquido / homogeneizador (por ejemplo, homogeneizador Ultra-Turrax). 70% de etanol-esterilizar en autoclave o el rotor de dispersión antes de su uso. Ejecutar la homogeneización durante 1 min a 17.500 rpm. Dejar reposar la muestra durante 2 min y repetir la homogeneización durante 1 minuto a la misma velocidad del rotor.
4. Deje reposar la muestra durante 10 minutos. En este paso, las partículas más pesadas (minerales) se asentarán. Las células y los componentes orgánicos de la muestra sin embargo wenfermos permanecen en solución. Después, transferir la solución sobrenadante (que contiene la biomasa celular) en un tubo de 50 ml limpio, teniendo cuidado de no perturbar el pellet de sedimentos.
5. Para el sedimento sedimentos añadir de nuevo 15 ml de una (autoclave) Solución de SHMP 1% estéril usando una bureta graduada estéril. Luego repita los pasos 2.3 y 2.4. Esta repetición asegura la separación de la cantidad máxima de células y partículas orgánicas a partir del componente mineral del sedimento. El sobrenadante de esta segunda separación se puede fusionó con el sobrenadante de la primera separación.
   Nota: Los siguientes pasos se puede hacer todo en el sobrenadante (que contiene la biomasa celular). El componente mineral (pellet sedimentos) puede ser desechada.
6. Centrifugar la muestra a 20 xg durante 1 min. Este paso aumenta la fuerza g suficiente para resolver partículas minerales pequeñas mientras que el material de célula biológica aún permanece en solución. Después de la centrifugación, transferir la solución sobrenadante (que contiene la biomasa celular) en unalimpia tubo de 50 ml. Deseche el sedimento mineral.
7. Determinar el volumen final de la solución que contiene la biomasa pesando la muestra. La determinación del peso evita tener que transferir la muestra a un cilindro graduado y reduce el riesgo de contaminación.

3. Recolección de Biomasa en filtro de membrana

1. Preparar unidad de filtración (por 47 mm de diámetro membranas) y la bomba de vacío. Esterilizar la unidad de filtración, ya sea en autoclave o (si vidrio Pyrex) rociándolo con etanol al 70% y en llamas con un mechero Bunsen. Deje que se enfríe antes de continuar con el protocolo.
2. Añadir membrana NC estéril para la unidad de filtración usando pinzas esterilizadas con etanol flameado.
3. Añadir la mitad de la muestra de sobrenadante (de la etapa 2.6) en la unidad de filtración de membrana y recoger las células en la membrana utilizando la bomba de vacío.
4. Cuando el líquido ha pasado totalmente a través del filtro, detenga la bomba de vacío y retire con cuidado la membrana utilizando ethanol-llama esterilizado fórceps. Colocar la membrana en una placa de Petri estéril.
   1. Cortar la membrana en un medio con unas tijeras esterilizadas con etanol flameado. Añadir cada medio de la membrana a un tubo de 2 ml separado. Una media de la membrana se utiliza para la extracción y el análisis de toda la comunidad bacteriana de ADN. El otro medio de filtro se almacenó a -80 ° C y sirve como una copia de seguridad.
5. Coloque nueva membrana NC en la unidad de filtración y recoger biomasa a partir de la segunda mitad del volumen de la muestra (del paso 2.6) utilizando la bomba de vacío.
6. Cuando el líquido ha pasado totalmente a través del filtro, detenga la bomba de vacío y retire con cuidado la membrana utilizando pinzas esterilizadas con etanol flameado. Coloque toda la membrana en un tubo de 2 ml separado. Esta muestra se utiliza para el tratamiento para separar las endosporas a partir de células vegetativas. La muestra puede ser almacenada a -20 ° C hasta su uso.

4. La lisis de las células vegetativas

1. Realizar eltratamiento para separar las endosporas de células vegetativas en la biomasa recogida previamente sobre una membrana de NC (paso 3.6).
   1. Si la membrana se congela, dejarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos para descongelar. A continuación, coloque la membrana en una placa de Petri estéril y cortarla (aproximadamente 4 veces) en trozos más pequeños con unas tijeras esterilizadas con etanol flameado. A continuación, coloque todas las piezas del filtro de membrana en un tubo de 2 ml estéril.
2. Añadir 900 l de TE (Tris-EDTA) tampón 1x (véase 1.5) al tubo que contiene la membrana muestra y mezclar a fondo por vórtice. En este paso, la biomasa se elimina de la membrana en la solución de tampón TE.
3. Colocar el tubo en una incubadora a 65 ° C durante 10 min y 80 rpm. Luego retire el tubo de la incubadora y deje que se enfríe durante 15 minutos.
4. Añadir 100 l de lisozima recién preparada (ver 1.5) para llegar a una concentración final de 2 mg / ml. No agregue la lisozima antes de la muestra se ha enfriado a 37 ° C, ya que esto podría degRade la enzima.
5. Incubar la muestra a 37 ° C durante 60 min y 80 rpm, las condiciones óptimas para la lisozima para lisar las células vegetativas.
6. Después de la lisis es completa, añadir 250 l de 3 N de hidróxido de sodio (NaOH) y 250 l de dodecilsulfato de sodio (SDS) solución al 6% a la muestra. Mediante la adición de esto, el volumen de la muestra llega a 1,5 ml y hay una concentración final de 0,5 N NaOH y la concentración final de 1% de SDS.
7. Incubar esta mezcla a TA durante 60 min y 80 rpm. Adición de la base y detergentes ayudará en la lisis celular final. La concentración de estos detergentes se ha optimizado para no dañar las endosporas, mientras que la lisis de las células vegetativas.
8. Preparar una unidad de filtración estéril que contiene membranas de 25 mm de diámetro por tratamiento en autoclave, o (si Pyrex vidrio) rociándolo con etanol al 70% y en llamas con un quemador Bunsen. Deje que se enfríe.
9. Coloque una membrana de 0,2 micras NC (25 mm de diámetro) en la unidad de filtración utilizando fórceps etanol llama esterilizados.
10. Añadir la muestra a partir del paso 4.7 en la membrana y el filtrado del líquido utilizando la bomba de vacío. Cuando el líquido ha pasado a través, apague la bomba de vacío. En este paso, se retira el material de célula vegetativa lisadas, ya que no se retiene en la membrana. Sólo endosporas permanecerán en la membrana.
11. Añadir 2 ml de solución fisiológica estéril para lavar detergentes residuales y filtrar el líquido usando la bomba de vacío.
12. Cuando el líquido se filtra completamente, apague la bomba de vacío. Deja la membrana de la unidad de filtración.

5. El tratamiento DNasa

Nota: Realice el tratamiento DNasa directamente en la membrana de filtro. Es importante que la unidad de filtración no se escapa y la bomba de vacío está apagado.

1. Añadir 450 l de agua estéril, 50 l de tampón de reacción de DNasa (1x) y 0,5 l enzima DNasa directamente sobre la membrana de filtro y se deja reposar durante 15 minutos. Si es posible, hacer esto digestión en una habitación que es ligeramente guerramer que el promedio RT, ya que la enzima funciona mejor a temperaturas de 25 ° C y por encima.
   Nota: Mantener el quemador Bunsen a un lado la unidad de filtración también aumenta la temperatura y tiene la ventaja añadida de mantener estéril el entorno, por lo tanto menor riesgo de contaminación de las muestras.
2. Una vez finalizada la digestión DNasa, encienda la bomba de vacío para eliminar la enzima de la muestra.
3. Lavar la enzima residual mediante la adición y filtrado 1 ml de solución fisiológica.
4. Si el líquido ha pasado totalmente, apague la bomba de vacío y quitar la membrana de filtro que contiene endosporas usando pinzas estériles y colocarlo en una placa de Petri estéril.
   Nota: La muestra de endosporas separadas está ahora listo para el análisis de aguas abajo. Almacenar a -20 ° C si se utiliza para la extracción de ADN o, alternativamente, a 4 ° C si se utiliza para la germinación y el cultivo.

Resultados

Los resultados presentados aquí han sido publicados anteriormente ^10,21. Por favor, consulte los artículos para la interpretación ambiental y análisis de los datos.

El procedimiento global se resume en la figura 1 y corresponde a tres pasos principales: primero, la separación de la biomasa a partir de sedimentos o cualquier otra matriz ambiental; segundo, la destrucción de las células vegetativas; y tercero, el análisis de aguas abajo de l...

Discusión

La resistencia de endosporas a factores fisicoquímicos agresivas externas (por ejemplo, la temperatura o detergentes) se utilizó para diseñar un método para separar las endosporas bacterianas de células vegetativas en muestras ambientales. Esta es la primera método integral para aislar endosporas a partir de muestras ambientales de una manera no destructiva. Los métodos anteriores para cuantificar, detectar o analizar endosporas en las muestras se basan en la medición de los proxies específico...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	powder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic	IKA	3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylene
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich