Физическая изоляция эндоспор из проб окружающей среды на целевой лизис вегетативных клеток

Резюме

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Аннотация

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Введение

Цель этой работы заключается в обеспечении протокол для разделения бактериальных эндоспор из растительных бактериальных клеток в пробах окружающей среды. Формирование бактериальных эндоспор является стратегией выживания, как правило, вызваны голода, обнаружили в ряде бактериальных групп, принадлежащих к типу Firmicutes ^1. Эндоспоровой формирования бактерии хорошо изучены, в основном, потому, что ряд штаммов патогенных микроорганизмов и являются, следовательно, медицинское значение (например, Bacillus сибирской язвы или Clostridium несговорчивый). Экологические штаммы эндоспоровой формирования бактерий были выделены из практически каждый окружающей среды (почвы, воды, донных отложений, воздуха, льда, человек кишки, животные кишки, и более) ^1-3. Таким образом, Firmicutes являются вторым наиболее распространенным типа в коллекции культур ^4.

Из-за их внешний выносливых коры и защитные основных белков, эндоспоры может выжить в экстремальных условиях окружающей среды, начиная FRом высыхание высокой радиации, экстремальных температур и вредных химических веществ ^5. Этот замечательный сопротивление делает его задача, чтобы извлечь ДНК из эндоспор ^6-8. Это, вероятно, объясняет, почему они были упущены в окружающей секвенирования исследований ^9,10. Другие методы, такие как нацеливание эндоспор в пробах окружающей среды с флуоресцентными антителами ^11, количественное определение дипиколиновая кислоты (DPA) в почве ^{12 и 13} осадка, проточной цитометрии ¹⁴ или пастеризации и последующего культивирования ^15,16 были использованы для получения или количественного эндоспоры в пробы окружающей среды. В последние годы методы экстракции ДНК оптимизирована, а также конкретные молекулярные праймеров для гена-мишени последовательности эндоспоровой конкретных были разработаны ^10,17-20. Это помогло выявить более биоразнообразия среди этой группы бактерий ^{21 и} также привело к приложениям в промышленности и медицине для обнаружения эндоспор, Например, в сухое молоко ^19.

Протокол, представленные здесь, основаны на разнице в устойчивость к вредным физико-химических условий (например, температуры и моющих средств) бактериальных эндоспор относительно вегетативных клеток. Чтобы разрушить вегетативные клетки в образце, мы последовательно применяются тепла, лизоцим и низкие концентрации детергентов. Время и сила этих процедур были оптимизированы таким образом, чтобы не разрушить споры, но лизировать все вегетативные клетки. Некоторые клетки в пуле окружающей клеток более устойчивы, чем другие, так что для того, чтобы повысить вероятность разрушения всех вегетативных клеток, мы используем три различных видов лечения. Преимущество и новизна данного способа является то, что эндоспоры после обработки остаются нетронутыми и могут быть использованы для последующих анализов дальнейших. Они включают в себя добычу ДНК, количественное ПЦР (КПЦР) и ампликон или метагеномных последовательности (таргетинг специально группу эндоспор и таким образом уменьшая Diversity, в то время как увеличение охвата). Эндоспоры также могут быть использованы для последующего культивирования или количественного помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или обнаружение DPA. Важной особенностью данного метода является то, что при сравнении необработанного образца с обработанной пробы, можно сделать вывод, количество и разнообразие эндоспор в окружающей образца в дополнение к компоненту, соответствующую вегетативных клеток.

протокол

1. Подготовка химических веществ и оборудования

1. Сделать 500 мл 1% гексаметафосфат натрия (ШМП) (NaPO _{3) н} раствора и стерилизовать в автоклаве.
2. Стерилизовать нитроцеллюлозы (NC) фильтры (размер пор 0,22 мкм, диаметр 47 мм) в автоклаве в закрытой стеклянной чашки Петри.
3. Стерилизовать ЧПУ фильтры (размер пор 0,22 мкм, диаметр 25 мм) в автоклаве в закрытой стеклянной чашки Петри.
4. Взвешивание и обратите внимание на вес пустого стерильных 50 мл пробирки (с крышкой) (по одной трубке в образце).
5. Подготовьте Трис-ЭДТА-буферного (TE-буфера) 1x: сделать раствор 10 мМ Трис (трис (гидроксиметил)) и 1 мМ ЭДТА буфере. Доведения рН до 8 и стерилизовать автоклавированием.
6. Подготовка раствора лизоцима (20 мг / мл) путем растворения 0,02 г лизоцима в 1 мл ТЕ-буфера. В идеале, сделать свежий каждый раз. Хранить при 4 ° С в течение не более чем 1 недели.
7. Готовят физиологический раствор путем растворения 8 г / л хлорида натрия(NaCl), в дистиллированной воде. Стерилизовать автоклавированием.

2. Разделение биомассы из осадка

1. Добавить 3 г образца осадка с предварительно взвешенный стерильной 50 мл трубки, используя этанол-пылал металлические ложки. Выполните это в чистом, УФ стерилизовать кабинета биобезопасности, чтобы избежать загрязнения.
2. Добавить 15 мл 1% стерильной (автоклавного) SHMP раствора образца, используя стерильный окончил бюретки. Решение ШМП также могут быть отфильтрованы, чтобы избежать загрязнения.
3. Однородный осадок и раствор SHMP с жидким диспергатор / гомогенизатор (например, Ultra-Turrax гомогенизатор). 70% этанола стерилизовать в автоклаве или дисперсии ротор перед использованием. Запустите гомогенизации в течение 1 мин при 17500 оборотах в минуту. Пусть образец остаток в течение 2 мин и повторить гомогенизации в течение 1 мин при той же скорости вращения ротора.
4. Оставьте образец в течение 10 мин. На данном этапе, наиболее тяжелые частицы (минералы) будут располагаться. Клетки и любые органические компоненты образца однако жплохо остаются в растворе. Впоследствии, передать надосадочную решение (содержащие клеток биомассы) в чистую пробирку 50 мл, стараясь не потревожить осадок наносов.
5. Для осадка осадку добавить снова 15 мл 1% стерильной (автоклавного) SHMP решения с использованием стерильной окончил бюретки. Затем повторите шаги 2.3 и 2.4. Это повторение обеспечивает разделение максимального количества клеток и органических частиц из минеральной части осадка. Супернатант этого второго разделения могут быть объединены с супернатантом из первого отделения.
   Примечание: Следующие шаги все сделано на супернатанта (содержащего биомассу клеток). Минеральный компонент (осадка гранул) может быть отброшен.
6. Центрифуга образца при 20 мкг в течение 1 мин. Этот шаг повышает G-Force достаточно, чтобы решить небольшие минеральные частицы, пока материал биологическая клетка остается в растворе. После центрифугирования надосадочную передать решение (содержащие клеток биомассы) вчистый 50 мл трубки. Откажитесь от минеральной осадок.
7. Определить конечный объем раствора, содержащего биомассу путем взвешивания образца. Определение веса избавляет от необходимости переноса образца в мерном цилиндре и снижает риск загрязнения.

3. Сбор биомассы на мембранный фильтр

1. Подготовьте блок фильтрации (47 мм диаметр) мембран и вакуумный насос. Стерилизацию блока фильтрации либо путем автоклавирования или (если стекла пирекс) путем распыления его с 70% -ным этанолом и пламенное его с горелкой Бунзена. Пусть ему остыть, прежде чем продолжить с протоколом.
2. Добавить стерильной NC мембраны фильтрующей установки с использованием этанола-запылано стерилизованные щипцы.
3. Добавьте половину надосадочной пробе (со стадии 2.6) на элементе мембранной фильтрации и собирают клетки на мембране с помощью вакуумного насоса.
4. Когда жидкость полностью проходит через фильтр, выключите вакуумный насос и тщательно удалить мембрану с помощью Итанол пламени стерилизовать пинцетом. Поместите мембрану в стерильную чашку Петри.
   1. Разрежьте пополам мембраны с помощью этанола-пылал стерилизованные ножницы. Добавить каждую половину мембраны в отдельную пробирку 2 мл. Одна половина оболочки будет использоваться для извлечения и анализа всей бактериальной ДНК сообщества. Другая половина фильтра будут сохранены при -80 ° С и служит в качестве резервного.
5. Поместите новый NC мембрану на фильтровальной установке и собирать биомассу из второй половины объема образца (со стадии 2.6) с использованием вакуумного насоса.
6. Когда жидкость полностью проходит через фильтр, выключите вакуумный насос и тщательно удалить мембрану с помощью этанола-пылал стерилизованные щипцы. Поместите всю мембрану в отдельную пробирку 2 мл. Этот образец будет использоваться для лечения, чтобы отделить от эндоспоры вегетативных клеток. Образец можно хранить при -20 ° С до использования.

4. Лизис вегетативных клеток

1. Выполнителечение, чтобы отделить эндоспоры из вегетативных клеток на биомассе собранной ранее на мембране НК (шаг 3.6).
   1. Если мембрана была заморожена, оставить его при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы оттаивания. Затем поместите мембрану в стерильную чашку Петри и разрезать его (примерно в 4 раза) на более мелкие куски при использовании этанола-запылано стерилизованные ножницы. Затем поместите все части мембранного фильтра в стерильную пробирку 2 мл.
2. Добавить 900 мкл 1x TE (трис-ЭДТА) буфере (см 1.5) в пробирку, содержащую образец мембраны и тщательно перемешать вихря. На этом этапе, биомасса удаляется из мембраны в ТЭ-буферного раствора.
3. Поместите пробирку в термостат при 65 ° С в течение 10 мин и 80 мин. После удаления трубки из инкубатора и дайте ему остыть в течение 15 мин.
4. Добавить 100 мкл свежеприготовленного лизоцима (см 1.5), чтобы достичь конечной концентрации 2 мг / мл. Не добавить лизоцим, прежде чем образец остынет до 37 ° С, так как это может градРаде фермент.
5. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 60 мин и 80 мин, оптимальные условия для лизоцима лизировать вегетативные клетки.
6. После лизиса завершена, добавить 250 мкл 3 гидроксида натри (NaOH) и 250 мкл 6% додецилсульфата натрия (SDS) раствор к образцу. При добавлении этого, объем образца достигает 1,5 мл и есть конечная концентрация 0,5 N NaOH и конечная концентрация 1% SDS.
7. Инкубируйте эту смесь при КТ в течение 60 мин и 80 мин. Добавление базы и моющие средства помогут в окончательном лизиса клеток. Концентрация этих моющих средств была оптимизирована, чтобы не повредить эндоспоры, а лизиса вегетативные клетки.
8. Приготовьте стерильную фильтрацию, которая содержит мембраны диаметром 25 мм в автоклаве, или (если стекла пирекс) распыления 70% этанола и пламенное его с горелкой Бунзена. Пусть ему остыть.
9. Поставьте NC мембрану 0,2 мкм (диаметр 25 мм) на устройстве с помощью фильтрации этанола пламя стерилизованные щипцы.
10. Добавить образец с шага 4.7 на мембрану и фильтровать жидкость, используя вакуумный насос. Когда жидкость проходит через, выключите вакуумный насос. На этом этапе лизируют клетки растительный материал удаляется, так как он не удерживается на мембране. Только эндоспоры останется на мембране.
11. Добавить 2 мл физиологического раствора стерильного, чтобы смыть остатки моющих средств и фильтрации жидкости с помощью вакуумного насоса.
12. Когда жидкость полностью фильтруется, выключите вакуумный насос. Оставьте мембрану на фильтровальной установке.

5. Лечение ДНКазы

Примечание: Выполнить обработку ДНКазы непосредственно на мембрану фильтра. Важно, что блок фильтрации не протекает, и вакуумный насос выключен.

1. Добавить 450 мкл стерильной воды, 50 мкл реакционного буфера ДНКазы (1x) и 0,5 мкл ДНКазы фермента непосредственно на мембранный фильтр и оставьте на 15 мин. Если это возможно, сделать это пищеварение в комнате, которая немного войнаMer, чем средний РТ, поскольку фермент работает лучше при температуре 25 ° С и выше.
   Примечание: Ведение горелку в сторону блок фильтрации также увеличивает температуру и имеет дополнительное преимущество по поддержанию окружение стерильной, поэтому снижается риск загрязнения образцов.
2. Когда ДНКазы пищеварения закончена, включается вакуумный насос, чтобы удалить фермент из образца.
3. Смыть остаточного фермента путем добавления и фильтрации 1 мл физиологического раствора.
4. Если жидкость полностью прошло, выключите вакуумный насос и снимите фильтр мембрану, содержащую эндоспоры помощью стерильного пинцета и поместить его в стерильную чашку Петри.
   Примечание: Образец разделенных эндоспор теперь готов к потоку анализа. Хранить при -20 ° C при использовании для выделения ДНК или, альтернативно, при 4 ° С, если используется для прорастания и культивирования.

Результаты

Результаты, представленные здесь, были опубликованы ранее ^10,21. Пожалуйста, обратитесь к этим статьям для окружающей среды интерпретации и обсуждении данных.

Вся процедура приводится на рисунке 1 и соответствует три основных этапа: во-первых, разд...

Обсуждение

Сопротивление эндоспор до внешних агрессивных факторов (физико-химических, например, температуры или моющие средства) был использован для разработки метода для разделения бактериальных эндоспоры из растительных клеток в пробах окружающей среды. Это первый комплексный метод, чт?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  60-00-4
Lysozyme from chicken egg white	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	powder, CAS  12650-88-3
Ultra-Turrax homogenizer T18 basic	IKA	3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glass	EMD Millipore	XX10 047 00
Chemical duty vacuum pump	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylene
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  1310-73-2
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameter	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich