JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Özet

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

Giriş

Bu çalışmanın amacı, çevre numuneleri içinde vejetatif bakteriyel hücrelerden bakteri sporları ayrılması için bir protokol sağlamaktır. Bakteri sporları oluşumu filum Firmicutes 1 ait olan bakteri grupları bir dizi bulunan bir hayatta kalma stratejisi genellikle açlık tetiklediği vardır. Endospore oluşturan bakteriler de suşları bir dizi patojenleri ve dolayısıyla tıbbi önemi (örneğin, Bacillus anthracis veya Clostridium difficile) vardır başlıca nedeni, incelenmiştir. Endospore oluşturan bakterilerin Çevre suşları hemen hemen her ortamda (toprak, su, sediment, hava, buz, insan bağırsak, hayvanlar gut, ve daha fazla) 1-3 izole edilmiştir. Bu nedenle, Firmicutes kültür koleksiyonları 4 ikinci en bol filum vardır.

Çünkü onların cesur dış korteks ve koruyucu çekirdek proteinlerinin, endosporlar fr değişen aşırı çevre koşulları yaşayabiliryüksek radyasyon, aşırı sıcaklıklara ve zararlı kimyasallar 5 om kuruma. Bu olağanüstü direnci endosporlar 6-8 DNA ayıklamak için bir meydan okuma yapar. Çevresel sıralama çalışmalarında 9,10 gözardı edilmiş bu yüzden muhtemelen açıklıyor. Floresan antikorlar 11 ile çevre numuneleri içinde endosporlar hedeflenmesi gibi diğer yöntemler, toprak 12 ve tortu 13 dipikolinik asit ölçümü (DPA), 14 akış sitometrisi veya pastörizasyon ve daha sonra kültür 15,16 endosporlar almak veya ölçmek için kullanılmıştır Çevresel örnekleri. Son yıllarda, optimize edilmiş DNA ekstraksiyon yöntemleri yanı sıra, spesifik moleküler primerler endospor-özgü gen sekansları, 10,17-20 geliştirilmiştir hedef. Bu bakteriler 21 bu grup arasında daha biyolojik çeşitlilik ortaya çıkarmak için yardımcı olan ve aynı zamanda endosporlar tespiti için endüstride ve tıpta uygulamalara yol açmıştırSüt tozu 19, örneğin.

Burada sunulan protokol hücreleri vejetatif göre bakteri sporları arasında (örneğin, ısı ve deterjanlar gibi), zararlı fizikokimyasal koşullara direnç farka dayanır. Bir numunede vejetatif hücrelerini yok etmek için, biz arka arkaya ısı, lizozim ve deterjan düşük konsantrasyonlarda geçerlidir. Sporlar yok etmek ama tüm vejetatif hücreleri lize etmek için değil, böylece bu tedavilerin zaman ve güç optimize edilmiştir. Bir çevre hücre havuzu bazı hücreler diğerlerinden daha dayanıklıdır, böylece tüm vejetatif hücrelerin tahrip olasılığını artırmak amacıyla, üç farklı tedaviler uygulanır. Bu yöntemin avantajı, ve yenilik tedaviden sonra endosporlar hala sağlam ve daha fazla alt analizler için kullanılabilir olmasıdır. Bunlar d azaltılması ve böylece DNA ekstraksiyon, kantitatif PCR (qPCR) ve amplikon veya özel endosporlar grubu hedef alan metagenomic dizileme (ve dahilÇeflitlilik) kapsama artırırken. Endosporlar de mansap yetiştirme veya floresan mikroskobu ile miktar tayini için kullanılabilir, akış sitometrisi veya DPA tespiti. Bu yöntemin önemli bir özelliği, tedavi edilen bir örnek ile işlem görmemiş bir numune ile karşılaştırılması, tek bir hücre vejetatif karşılık gelen bileşene ek olarak bir çevre numunede endosporlar miktar ve çeşitliliği anlamak olabilir.

Protokol

Kimyasalların ve Ekipman 1. Hazırlık

  1. % 1 sodyum heksametafosfat (SHMP) (napo 3) n çözeltisi 500 ml yapmak ve otoklavda sterilize edilir.
  2. Kapalı cam Petri kapları içinde otoklavlanarak sterilize nitroselüloz (NC) filtreleri ile (gözenek büyüklüğü 0.22 um, çap 47 mm).
  3. Kapalı cam Petri kapları içinde otoklav ile Kuzey Carolina filtre ile (gözenek büyüklüğü 0.22 um, çap 25 mm) sterilize edin.
  4. Tartılır ve (kapağı ile) steril 50 ml tüpler boş ağırlığı (numune başına bir tüp) not edin.
  5. Tris-EDTA-tamponu (TE-tamponu) 1x hazırlayın: 10 mM Tris (tris (hidroksimetil) aminometan) ve 1 mM EDTA tampon solüsyonu yapmak. 8 pH ayarlayın ve otoklav ile sterilize.
  6. 1 ml TE-tamponu içinde lizozim 0.02 g çözülerek lizozim çözeltisi (20 mg / ml) hazırlayın. İdeal olarak, her zaman taze olun. En fazla 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.
  7. 8 g / L sodyum klorid çözündürülmesiyle fizyolojik çözeltiyi hazırlayınDamıtılmış su (NaCI). Otoklav ile sterilize.

Sedimentten Biyokütle 2. ayrılması

  1. Tortu numunesi 3 g etanol Alevli metal kepçe kullanarak 50 ml tüpler steril tartılmış önceden ekle. Kirlenmesini önlemek için temiz, UV steril biyogüvenlik kabini bu gerçekleştirin.
  2. Steril bir büret kullanılarak dereceli numuneye% 1 steril (otoklav) SHMP çözeltisi 15 ml ekleyin. SHMP çözüm de kirlenmeyi önlemek için filtre edilebilir.
  3. Bir sıvı dağıtıcı / homojenizör (örneğin, Ultra-Turrax homojenleştirici) ile tortu ve SHMP çözelti homojenize edilir. % 70 etanol-sterilize veya kullanmadan önce dağılım rotor otoklav. 17.500 rpm'de 1 dakika için homojenizasyon çalıştırın. 2 dakika boyunca numune kalan verin ve rotor hızında 1 dakika için homojenizasyon tekrarlayın.
  4. Numune 10 dakika bekletin. Bu aşamada, ağır parçacıklar (mineraller) razı olacak. Hücreleri ve bununla birlikte W numunenin herhangi bir organik bileşenlerHasta çözelti içinde kalır. Sediment pelet rahatsız etmemek için dikkat çekerken Daha sonra, temiz bir 50 ml tüp içine süpernatant solüsyonu (içeren hücre biyokütle) aktarın.
  5. Sediman pelet steril bir büret mezun kullanarak% 1 steril (otoklav) SHMP solüsyonu tekrar 15 ml ekleyin. Sonra tekrar 2.3 ve 2.4 adımları tekrarlayın. Bu tekrarlama tortu mineral bileşeni hücreleri ve organik partiküllerin maksimum miktarını ayrılmasını sağlar. Bu ikinci ayrılık süpernatant ilk ayrılık süpernatanıyla birleştirilebilir.
    Not: Aşağıdaki adımlar tüm (hücre biyokütle içeren) süpernatant yapılır. Mineral bileşen (tortu topak) iptal edilebilir.
  6. 1 dakika için 20 x g'de santrifüjleyin. Biyolojik hücre malzeme hala çözelti içinde kalır Bu adım, küçük mineral parçacıkları çözmek için yeterli g-gücünü daha da arttırır. Santrifüj işleminden sonra, bir yüzer madde halinde çözeltisi içeren (Hücre biyokütle) aktarmaktemiz 50 ml tüp. Mineral pelet atın.
  7. Numuneyı tartmak biyokütle içeren çözeltinin son hacmi belirlenir. Ağırlığı belirlemesi, dereceli bir silindire örnek aktarmak zorunda ve kirlenme riskini azaltır önler.

Filtre Zarında Biyokütle 3. Koleksiyonu

  1. Filtrasyon ünitesi (47 mm çaplı membranlara) ve vakum pompası hazırlayın. Otoklav yoluyla veya% 70 etanol ile püskürtme ve Bunsen beki ile yanan tarafından (Pyrex cam varsa) ya filtrasyon ünitesi sterilize edin. Bu protokol ile devam etmeden önce soğumasını bekleyin.
  2. Etanol-yakılmış sterilize forseps kullanarak filtrasyon ünitesi steril NC membranı ekleyin.
  3. Vakum pompası kullanılarak membran üzerinde hücrelerin membran filtrasyon ünitesi üzerine (adım 2.6 dan itibaren) süpernatant numunenin yarısını ekleyin ve toplamak.
  4. Sıvı tamamen filtre üzerinden geçtikten sonra, vakum pompası durdurmak ve dikkatle Ethan kullanarak membran kaldırmakol-alev forseps sterilize. Steril bir Petri kabı içine zarın yerleştirin.
    1. Etanol-yakılmış sterilize makas kullanarak yarısında zarı kesin. Ayrı bir 2 ml'lik bir tüpe zar her yarım ekleyin. Membranın bir yarısı DNA ekstraksiyonu ve tüm bakteriyel eden analizi için kullanılır. Filtrenin diğer yarısı -80 ° C'de saklanır ve yedeği olarak görev yapar edilecektir.
  5. Filtrasyon ünitesi üzerine yeni NC membranı yerleştirin ve vakum pompası kullanılarak (adım 2.6 dan itibaren) örnek hacmi ikinci yarısından itibaren biyokütle toplamak.
  6. Sıvı tamamen filtre üzerinden geçtikten sonra, vakum pompası durdurmak ve dikkatle etanol-Alevli sterilize forseps kullanarak membran kaldırmak. Ayrı 2 ml tüp içine tüm membran yerleştirin. Bu örnek, bitki hücrelerinde endosporlar ayırmak için tedavi için kullanılır. Örnek kullanılana kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

Bitkisel Hücre 4. Liziz

  1. GerçekleştirmekTedavi önceden NC zarın (adım 3.6) toplanan biyokütle üzerinde vejetatif hücrelerden endosporlar ayırmak için.
    1. Membran donmuş ise, çözülme 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. Daha sonra steril bir Petri kabı membran yerleştirmek ve etanol-Alevli steril makaslar kullanılarak küçük parçalar halinde (yaklaşık 4 kat) kesti. Sonra steril bir 2 ml tüp içine tüm membran filtre parçaları yerleştirin.
  2. Örnek zarı içeren tüp 1x TE (Tris-EDTA) tamponu 900 ul (1.5 bakınız) ekleyin ve vorteks ile iyice karıştırın. Bu adımda, biyokütle TE-tamponu çözeltisi içine zardan çıkarılır.
  3. 10 dakika karıştırıldı ve 80 rpm'de 65 ° C'de bir kuluçka tüp yerleştirin. Daha sonra inkübatör tüp kaldırmak ve 15 dakika soğumasını bekleyin.
  4. 2 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için taze hazırlanmış lisozim (1.5 bakınız) 100 ul ekle. Numune 37 ° C soğuduktan önce bu deg olabilir gibi, lizozim ilave etmeyinizenzim rade.
  5. Lizozim için en uygun koşulları vejetatif hücreleri lize etmek için, 60 dakika karıştırıldı ve 80 rpm'de 37 ° C'de örnek inkübe edin.
  6. Lisis tamamlandıktan sonra, 3 N sodyum hidroksit (NaOH) ve örnek 6% sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi 250 ul 250 ul ilave edin. Bu ekleyerek, numune hacmi 1,5 ml ulaşır ve 0,5 N NaOH ile nihai konsantrasyon% 1 SDS nihai konsantrasyon vardır.
  7. 60 dakika karıştırıldı ve 80 rpm'de, oda sıcaklığında bu karışımı inkübe edin. Taban ve deterjan ekleme nihai hücre parçalama yardımcı olacaktır. Vejetatif hücreler lize ise, bu deterjan konsantrasyonu, endosporlar zarar şekilde optimize edilmiştir.
  8. (Pyrex cam ise)% 70 etanol ile püskürtme ve Bunsen beki ile yanan otoklav ile 25 mm çaplı zarlarını tutan, ya da steril filtrasyon ünitesi hazırlayın. Soğumaya bırakın.
  9. Etanol-alev sterilize forseps kullanarak filtreleme ünitesi üzerindeki 0.2 mikron NC membranı (25 mm çapında) yerleştirin.
  10. Membran üzerine adım 4.7 numuneyi ekleyin ve vakum pompası kullanılarak sıvı filtre. Sıvı içinden geçtikten sonra, vakum pompası devre dışı bırakın. Bu zar üzerinde muhafaza edilmez Bu adımda, parçalanmış bitki hücre malzemesi çıkarılır. Sadece endosporlar membran üzerinde kalacaktır.
  11. Kalıntı deterjanlar yıkayın ve vakum pompası kullanılarak sıvıyı filtrelemek üzere steril fizyolojik solüsyon 2 ml ilave edilir.
  12. Sıvı tamamen süzülür olduğunda, vakum pompası kapatın. Filtrasyon ünitesi ile ilgili membran bırakın.

5. DNase Tedavi

Not: Filtre membran üzerinde doğrudan DNaz tedavi uygulayın. Bu filtreleme ünitesi akmaması önemlidir ve vakum pompası kapatılır.

  1. Filtre membran üzerine steril su, 450 ul doğrudan DNase reaksiyon tampon maddesi (1x) ve 0.5 ul DNaz enzimi 50 ul ilave edin ve 15 dakika boyunca bekletildi. Mümkünse, biraz savaş bir odada bu sindirim yapmakOrtalama RT daha mer, enzimin, yukarıdaki 25 ° C ve sıcaklıklarda daha iyi olduğunda işe yaramaktadır.
    Not: Bunsen beki tutulması kenara filtrasyon ünitesi de sıcaklığını arttırır ve steril bir ortamda tutmak yararı vardır, bu nedenle örneklerin bulaşma riskini azaltmıştır.
  2. DNaz sindirim tamamlandığında, numuneden enzimi kaldırmak için vakum pompası açın.
  3. Ekleme ve fizyolojik çözelti 1 ml filtre edilerek artık enzimin yıkayın.
  4. Sıvı tamamen geçtiyse, vakum pompasını kapatın ve steril forseps kullanarak ve steril Petri kabı içine yerleştirin endosporlar içeren filtre membran kaldırmak.
    Not: ayrılmış endosporlar örnek şimdi aşağı analiz için hazırdır. Çimlenme ve kültivasyonu için kullanıldığında -20 ° C'de saklayın DNA ekstraksiyonu için ya da alternatif olarak 4 ° C 'de kullanıldığında.

Sonuçlar

Burada sunulan sonuçlar, daha önce 10,21 yayınlanmıştır. Verilerin çevre yorumlanması ve tartışılması için bu makaleleri bakın.

Genel prosedür Şekil 1 'de özetlenmiş ve üç ana adımlar karşılık gelir: ilk olarak, birikinti ya da herhangi bir diğer çevresel matris biyokütle ayrılması; İkinci, vejetatif hücrelerin tahribi; ve üçüncü olarak, ayrılmış endosporlar alt baş analizi. Alt analizi çeşitliliği belirlemek için, DN...

Tartışmalar

Dış agresif fizikokimyasal faktörlerden (örneğin, sıcaklık ya da deterjanlar) ile endosporlar direnci çevre örneklerinde bitkisel hücrelerden bakteri endosporlar ayırmak için bir yöntem bulmak için kullanıldı. Bu bir tahribatsız şekilde çevresel örneklerden izole endosporlar ilk kapsamlı yöntemdir. Ölçmek algılamak veya numunelerde endosporlar analiz etmek için önceki metotlar, dipikolinik asit veya spesifik bir işaretleyici genler gibi endosporlar özel vekiller ölçümüne dayanma...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar Bağış No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 ve sayılı 151948 İsviçre Ulusal Bilim Vakfı kabul ve Fundation Pierre Mercier la Science dökün.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 47 mm diameterSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich 
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma-Aldrich252859 Sigma-AldrichCAS 77-86-1
EDTASigma-AldrichE9884 Sigma-AldrichCAS  60-00-4 
Lysozyme from chicken egg whiteSigma-Aldrich62971 Flukapowder, CAS  12650-88-3 
Ultra-Turrax homogenizer T18 basicIKA3720000
Glass filter holders for 47 mm membranes, Pyrex glassEMD MilliporeXX10 047 00
Chemical duty vacuum pumpMilliporeWP6122050220 V/50 Hz
Manifold sampling filtration for 25 mm membranesMillipore1225 Sampling Manifoldpolypropylene
DnaseNew England BiolabsM0303SRnase free
NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
Sodium dodecyl sulfphate (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 μm pore size, 25 mm diameterSigma-AldrichWHA7182002 Aldrich

Referanslar

  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 107Endosporlarayr l kvejetatif h crelerEndospor olu turan bakterilerh cre par alamae itlilikmikrobiyal ekoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır