برازي تحليل جلايكورتيكود: رصد الغدة الكظرية غير الغازية في الخيليات

Summary

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Abstract

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Introduction

أهداف الطريقة الموصوفة لتحليل تركيز الكورتيزون في البراز الخيول من أجل توفير تقييم غير الغازية للنشاط الغدة الكظرية. قياس النشاط (HPA) محور الغدة النخامية، الغدة الكظرية هو نهج قبولهم للدراسة الاستجابة لحالات يحتمل أن تكون مكره في كل من الأنواع في الأسر والمحلية. تقنية الإشارة وطريقة الأكثر استخداما هو استخدام بلازما الدم ¹ ومع ذلك، الطرق البديلة مثل تحليل البراز وضعت من أجل التغلب على الإجهاد الناجم عن اخذ عينات من الدم نفسها والسماح القدرة على رصد الأنواع الطليقة.

أثناء وضع مكره، تعطل التوازن الفيزيولوجي. منطقة ما تحت المهاد في الدماغ النشرات المنمية القشرية الافراج عن هرمون (CRH) الذي يعمل على الغدة النخامية الأمامية ويحفز الافراج عن الهرمون الموجه لقشر الكظر (ACTH). ACTH يدخل مجرى الدم، ويحفز قشرة الغدة الكظرية لإفراز مسكوكةق السكرية محددة (GC). ترتبط ارتباطا وثيقا السكرية الأحداث المجهدة بدلا من أن تنتج باستمرار في جميع ولايات الطاقة المتزايدة ولذا غالبا ما يتم قياسها في تفضيل اكثر من غيرها من الإجهاد ترتبط الهرمونات ^2. السكرية هي المسؤولة عن العديد من الآثار التكيف في الخيول. وحشدت الطاقة بسرعة من مواقع التخزين في الجسم في شكل من الأحماض الدهنية والجلوكوز، وزيادة كمية الأوكسجين، مما يعزز وظيفة حسية ⁽³⁾ وانخفاض تدفق الدم الى مناطق غير الضرورية لحركة ^4. وكذلك بوصفها آلية التعامل، وارتفاع التوتر الناجم في السكرية قد يساعد أيضا على إعداد الحيوان للالضغوطات المقبل ^5.

تقييم مستويات الهرمون في البلازما واللعاب ينطوي على قياس هرمون تعميم الفعلي ومع ذلك، وقياس نواتج الأيض في التدابير البراز المنتج النهائي التمثيل الغذائي للهرمون. وcatabolized المنشطات المتداولة في لترإيفر قبل الإفراز في لالصفراء حيث أنها تخضع لتغييرات أخرى بتسهيل من الأنشطة الإنزيمية من النباتات البكتيرية داخل مسار الأمعاء ^6. لذلك، المناعية الموجهة نحو السكرية في الدم قد لا تكون مناسبة لتحليل نواتج الأيض جلايكورتيكود البرازية ^7.

كما يمكن أن يتم جمع البراز من دون أي إزعاج للحصان، وتحليل البراز للكورتيزون، وقد استخدم على نطاق واسع لمراقبة نشاط HPA في عدد من الظروف. تم الإبلاغ عن كورتيزون ارتفاع في البراز من الخيول استجابة لحالات يحتمل أن تكون مكره بما في ذلك أثناء العلاج البيطري بعد العملية ⁸ وفي السكن تقييدا ^​​9. تعكس أخذ العينات البرازية مستوى جلايكورتيكود المجمعة مع مرور الوقت بدلا من نقطة في أخذ العينات في الوقت التي تقدمها البلازما واللعاب مما يجعله مناسبا لرصد المدى الطويل المزمن أو الأنماط الموسمية ^10. ويرجع ذلك إلى غير الغازيةطبيعة الأسلوب، والعينات ويمكن جمع مرارا وتكرارا للفرد دون الحاجة إلى التقاط أو ضبط النفس ^11. ومع ذلك، يجب أن تؤخذ أنواع محددة وقت عبور القناة الهضمية في الاعتبار عند التخطيط لبروتوكول أخذ العينات. في الخيول، والوقت الأمعاء عبور حوالي 18 ساعة ¹² وبالتالي، يمكن الكشف عن استجابة الغدة الكظرية والأيض كورتيزون لاحقة في البراز بعد يوم واحد تفعيل الأولي للمحور HPA.

عندما تستخدم تقنيات المناعية غير الغازية التحقق من صحة دقيق لهذه الأنواع يجري التحقيق ضروري ^13. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن الفروق بين الجنسين في هرمون الأيض إفراز ربما بسبب الاختلافات في معدل الأيض ونوع الأيض كورتيزون تفرز في مختلف الأنواع بما في ذلك الفئران ^14، والدجاج ^(15). ولذلك كان من المهم كجزء من هذا الأسلوب الذي تم التحقق من صحة فحص للاستخدام في كل من الذكور والإناث الخيول المحلية كما هو مفصل في البروتوكول البريد. هذا الاختلاف في عملية الأيض الهرموني بين الجنسين له عواقب على نوعية البيانات إلا أنه نادرا ما يتم معالجتها وتضمينها كجزء من التحقق من صحة الفحص.

وتسمح هذه الطريقة غير الغازية تقييم المدى الطويل من النشاط الغدة الكظرية في الخيول المحلية. تفاصيل البروتوكول كل من المصادقة على فحص وتقنية فحص نفسها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بيان الأخلاق: الإجراءات التي تنطوي على أخذ العينات الميدانية والحيوان موضوعات تم اعتمادها من قبل مدرسة الحيوان، الريفية والعلوم البيئية (آريس) في جامعة نوتنغهام ترنت.

1. جمع عينات البراز

ملاحظة: يجب ارتداء القفازات عند التعامل مع العينات البرازية والميثانول. إذا كان هناك شكوك قوية بأن حيوان يمكن أن يعاني من مرض حيواني المنشأ، ملابس واقية مثل وينبغي أيضا أن ترتديه معطف المختبر.

1. جمع العينات البرازية في أقرب وقت ممكن (في غضون دقائق إلى بضع ساعة) بعد التغوط ووضعها في كيس من العينة. أخذ 3-5 العينات الفرعية من أي عينة يتبرز مع الوزن الكلي حوالي 10 غرام. تسمية حقيبة مع الوقت والتاريخ من جمع وهوية الأفراد، وتجميد العينة في -20 درجة مئوية حتى التحليل.
2. لتقليل الخطأ، وتجميد جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى الدراسة كاملة ثم جمع عينات معا للتحليل كما دفعة واحدة.

2. برازي هرمون استخراج

1. ترك عينات البراز لذوبان الجليد في RT.
2. ضمان أن العينات والمتجانس عن طريق خلط كل عينة يدويا في كيس عينة الخاصة بها.
3. لكل عينة تزن 0.50 (± 0.003 ز) من المواد البرازية على توازن دقيق في وزن القارب ثم نقل البراز إلى قارورة زجاج 8 مل. استخدام تزن قارب جديد لكل عينة وتنظيف ملاقط مع 30٪ الميثانول بين كل عينة.
4. الجمع بين 0.5 غرام من المواد البرازية مع 5 مل من 90٪ ميثانول: الماء، ويهز O / N على شاكر المداري في RT.
5. في صباح اليوم التالي، دوامة العينة ومن ثم الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 600 غرام.
6. صب جزء الميثانول في أنبوبة زجاجية 16 × 125 مم ² ومكان في رف في حمام مائي لتعيين درجة حرارة 37 درجة مئوية. تتبخر إلى جفاف باستخدام الهواء في خزانة الدخان. شطف القارورة استخراج ووضع بيليه البراز المتبقية في كيس النفايات الطبية للتخلص منها.
7. إعادة تعليق مقتطفات البرازية في 100٪، 1 مل الميثانول ونقل إلى أنبوب البولي بروبلين 12 × 75 مم ^2. على الفور سقف ومخزن في -20 درجة مئوية حتى التحليل.

3. تحليل هرمون

1. إجراء التحليل مع انزيم مرتبط-المناعية (EIA) باستخدام بولكلونل مصل كورتيزون CJM006.
   ملاحظة: تم وتقييم الأثر البيئي الثاني اختبار (الكورتيزول R4866 مصل، ولكن هذا فشل في تحقيق خطوة التحقق من صحة البيوكيميائية (انظر القسم 4.1) يتم توفير الأمصال المضادة بولكلونل كورتيزون CJM006 والكورتيزول R4866 مصل والتي تخصها، برنامج الصحة الإنجابية التي كتبها CJ مونرو، جامعة كاليفورنيا، ديفيس، كاليفورنيا.
2. تمييع مصل في 1: 15،000 في المخزن طلاء (0.05 M NaHCO3، ودرجة الحموضة 9.6) باستخدام ماصة المتكررة و50 ميكرولتر ماصة، تحميل لوحة التلازن 96-جيدا مع 50 ميكرولتر / جيد. تغطية لوحة مع سداده لوحة واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. ترك بئرين غير المصقول لتمثيل الآبار غير الملزمة محددة (NSB).
3. مباشرة قبل الاستعمال تغسل الصحون التلازن خمس مرات باستخدام الآلي غسالة لوحة التلازن (محلول الغسيل، 0.15 م كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20).
4. تحميل لوحات مع 50 ميكرولتر لكل بئر لفي جهاز الأمن القومي والآبار [عازلة تقييم الأثر البيئي (0.1 M نابو _4، 0.149 M كلوريد الصوديوم، 0.1٪ زلال المصل البقري، ودرجة الحموضة 7.0) فقط] "صفر"، ومعايير (كورتيزون، 3.9 - 1000 جزء من الغرام / أيضا) أو استخراج عينات البراز (مخفف بشكل مناسب في 1:20 عازلة تقييم الأثر البيئي، انظر القسم 4.1). يجب تشغيل المعايير والأصفار في ثلاث نسخ وquadruplicate، على التوالي. يجب تشغيل المخفف استخراج عينات البراز وفي جهاز الأمن القومي في نسختين.
5. اتبع هذا على الفور مع اضافة 50 ميكرولتر جيدا / التسمية الفجل البيروكسيديز المترافقة ^ᵻ المخفف في المخزن EIA إلى 1: 70000.
6. احتضان أطباق التلازن في الظلام لمدة 2 ساعة على RT.
7. غسل أطباق التلازن مع محلول الغسيل 5 مرات، واحتضان لوحات في RT في الظلام مع 100 ميكرولتر / أهلا وسهلالتر من RT الركيزة [0.4 ملي 2،2'-azino-DI- (3-ethylbenzthiazoline السلفونيك حمض) ملح ثنائي الأمونيوم، 1.6 مم H ₂ O _2، 0.05 M سترات، ودرجة الحموضة 4.0]. إعداد الركيزة مباشرة قبل الاستعمال.
8. استخدام spectrophometer عند طول موجي 405 نانومتر لقراءة لوحات التلازن. تعتبر حضانة لوحات كاملة عندما الكثافة البصرية من الآبار الصفر تصل 0،8-1،0.
9. لضمان التكرار، استخدام عناصر التحكم [معايير تقييم الأثر البيئي أو عينة بيولوجية المخفف في المخزن تقييم الأثر البيئي للربط في ما يقرب من 30٪ (EIA قياسي) و 50٪ (عينة على سبيل المثال البيولوجي، مجموعة من الحصان المحلي استخراج البراز) و 70٪ (EIA قياسي) ] لإثبات وجود داخل وبين فحص معاملات الاختلاف من <10٪ و <15٪ على التوالي.

4. انزيم مرتبط-المناعي: التحقق من صحة لنوع الدراسة والجنس

1. الكيمياء الحيوية التحقق (التوازي)
   1. باستخدام عازلة تقييم الأثر البيئي، إجراء تخفيف تسلسلي على تجميع البراز خارجط م، والتي اتخذت من الناحية المثالية من يشتبه عينات تركيز الهرمون العالية والمنخفضة من عدة أفراد (المدى: أنيق، 1: 2-1: 8192)، وتعمل على تقييم الأثر البيئي كما هو موضح في القسم 3.
      ملاحظة: يعتبر تحقيق التوازي عند التخفيفات المسلسل من مقتطفات البرازية تسفر عن بالتوازي منحنى النزوح الى نتائج منحنى الانحدار الخطي والقياسية تظهر R2> 0.90، منحدر> 0.50 و p <0.05. ينبغي النظر في استخراج البراز المخفف التسلسلي الذي يربط حوالي 50٪ على المنحنى القياسي لتخفيف المثالي لتشغيل جميع مقتطفات برازي (على سبيل المثال، 1:20). ليس هناك تدخل النظر فيها على الفحص عندما تظهر نتائج الانحدار الخطي R2> 0.90 و p <0.05.
2. الكيمياء الحيوية التحقق (التدخل)
   1. ارتفاع 200 ميكرولتر من المعايير تخفيفه بشكل متسلسل (صفر، 3،9-1٬000 نانوغرام / جيد كورتيزون) مع 200 ميكرولتر من استخراج البراز بشكل مناسب المخفف المجمعة [المخفف في 50٪ ملزمة تحددها paralleliخ (01:20)] وتعمل على تقييم الأثر البيئي كما هو الحال في الجزء 3. بعد مؤامرة تحليل تقييم الأثر البيئي تركيز لاحظ ناقص الخلفية (تركيز العينة صفر) مقابل تركيز المتوقع.
      ملاحظة: إذا كان إضافة المخفف استخراج البراز المجمعة لمعايير لا يغير كثيرا من المتوقع كمية خطية نتائج الانحدار ينتج R ^2> 0.90، منحدر بالقرب 1.0 و p <0.05. لم يتم إحراز أي تدخل في تقييم الأثر البيئي.
3. التحقق البيولوجي:
   ملاحظة: مظاهرة أن الادارة اختارت لديه القدرة على قياس التغييرات ذات الصلة بيولوجيا من هرمون الفائدة [على سبيل المثال، ارتفاع تركيزات القشرية السكرية بعد الدوائية (ACTH في كثير من الأحيان إجراء مرخص) أو التحدي البيولوجي (على سبيل المثال، نفسية و / أو للبيئة، من المرجح أن يكون حدثا غير المنظم الانتهازية)].
   1. اختيار، واستخراج وتحليل عينات البراز لتركيزات المستقلب القشرية السكريةباستخدام عملية بالتفصيل في القسمين 1-3 قبل وبعد الحدث تحديا.
      ملاحظة: سوف الحدث تحديا تكون أنواع محددة. يتم توفير وسيلة المثال أدناه للحصول على الحصان المحلي. وقد نشرت أمثلة كاملة من الأحداث الصعبة للخيول سابقا بما في ذلك استخدام إدارة ⁹ و تربية الإجراءات ^16. ارتفاع كبير في تركيزات المستقلب القشرية السكرية في أعقاب الحدث تحديا يجب مراعاتها وأكد باستخدام التحليل الإحصائي. هذا يجب أن تتضمن حيثما كان ذلك مناسبا، وتأثير التدابير المتكررة، تاريخ العينة والفرد. ومن ثم يعتبر تحقيق التحقق البيولوجي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الخيول المحلية (ن = 16، 8 الأفراس، 8 الحيوانات المخصية) تم تجميع مع متوسط ​​أعمارهم 15 عاما (± 3) وفقا لنوع الجنس وتعرض لأربعة تصاميم المساكن مع مستويات متزايدة من العزلة الاجتماعية (ن = 4 حصان / العلاج). الإسكان 1 تشارك الخيول الذين يعيشون في بيئة القطيع، م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يوفر تحليل البراز كورتيزون وسيلة لتقييم أنماط طويلة المدى لنشاط الغدة الكظرية في الخيول. طبيعة غير الغازية من طريقة تتغلب على آثار الخلط من طرق أخذ العينات الأخرى المستخدمة لتقييم نشاط الغدة الكظرية بما في ذلك اللعاب والبلازما تحليل ^9. وبالإضافة إلى ذلك الأسلو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore