糖皮质激素粪分析:在马属动物无创监测肾上腺

摘要

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

摘要

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

引言

所描述的方法的目的来分析，以便提供肾上腺活动的非侵入性的评价在马粪便皮质酮浓度。测量下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴（HPA）的活动是一个公认的方法来研究在两个俘虏和国内品种可能厌恶的情况下的响应。参考技术和最广泛使用的方法是使用血浆¹然而，替代的方法如粪便分析人为了克服由采血本身引起的应力，并允许监测自由测距物种的能力得到了发展。

在厌恶的情况下，生理动态平衡被打乱。在大脑释放促肾上腺皮质激素作用于垂体前叶，刺激促肾上腺皮质激素（ACTH）的释放释放激素（CRH）下丘脑。促肾上腺皮质激素进入血液，刺激肾上腺皮质分泌物种的具体糖皮质激素（GC）。糖皮质激素有密切联系的应激事件，而不是因此它们优先于其他应激激素的链接通常²测量的所有能量提高国家被一致产生。糖皮质激素是负责马匹数自适应的效果。能量被迅速地从存储位点中的脂肪酸和葡萄糖的形式体动员，氧摄取量的增加，感觉功能增强³和血流减少到没有必要移动^4个区域。以及用作应对机构，在糖皮质激素的应力引起的上升也可能有助于制备动物为下一个压力源^5。

评估血浆激素水平和唾液涉及测量实际循环激素然而，测量代谢物在粪便措施的激素的代谢终产物。循环类固醇分解代谢的L到，这里它们经受肠道⁶内菌群的酶活性促进进一步的变化胆汁排泄之前艾弗。因此，针对血糖皮质激素的免疫测定可能不适合用于粪便的糖皮质激素的代谢产物⁷的分析^。

作为粪便收集可以没有干扰对马进行，粪便为皮质酮的分析，已被广泛用于监测在许多情况HPA活性。在马的粪便升高皮质酮已经报道响应于潜在厌恶情况，包括在手术后的兽医治疗⁸和限制性壳体^9。粪便采样反映一段时间内汇集糖皮质激素水平，而不是由血浆和唾液提供实时采样使它更适合监测长期，慢性或季节性模式¹⁰点。由于非侵入性该方法的性质，样品可反复，而不需要对捕获或约束¹¹的个体收集的。然而，在规划一个采样协议时物种特异性肠道转运时间，必须考虑到。在马，肠道运输时间大约是18小时¹²因此，肾上腺反应和随后的皮质酮代谢物可在粪便中一天HPA轴的初始激活后检测。

当使用非侵入性免疫分析技术正在调查该物种进行仔细验证是必需的^13。此外，在激素代谢物的排泄性别差异已可能是由于在代谢率和在不同物种包括小鼠^14，和鸡¹⁵排出皮质酮代谢物的类型的不同的报道。因此，有作为此方法的测定法验证在男性和女性国内马使用的一部分重要的，因为是在第详细Ë协议。男女之间的激素代谢这种差异对数据质量的后果，但它很少讨论并作为实验验证的一部分。

这种非侵入性方法允许在国内马肾上腺活性长期评估。该协议的细节在测定两者的验证和测定技术本身。

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研究方案

伦理学声明:涉及野外采样和动物个体程序已通过动物，农村与环境科学（ARES）在诺丁汉特伦特大学学院。

1.粪便样本的收集

注:手套应处理粪便样本和甲醇时佩戴。如果有一个强烈怀疑的动物能够从一种人畜共患疾病，防护服是患如白大褂也应佩戴。

1. 尽快收集粪便样本（内分几个小时）以下的排便，将它们放入一个样品袋中。采取任何大便样品三至五子样本与大约10克总重量。标记的时间和收集，个别ID的日期的袋子，在-20冻结样品℃直至分析。
2. 为了尽量减少错误，冻结所有样品在-20 °C，直到研究完成，然后收集样品一起分析，单批

2.粪便激素提取

1. 离开粪便样品在室温下解冻。
2. 确保该样品通过在其自己的样品袋各样品手工混合均匀。
3. 对每个样品称重0.50粪便物质的（±0.003克）上微量天平在称量舟然后粪便转移到8毫升的玻璃小瓶中。使用新的权衡船每个样本与每个样品之​​间30％的甲醇清洁镊子。
4. 结合0.5克粪便物质的用5毫升90％甲醇:水，并在在室温下轨道摇床摇动O / N。
5. 第二天早晨，涡旋样品，然后在600克离心20分钟。
6. 滗在设定为37℃的温度下的水浴齿条甲醇馏分到一个16×125 ^平方毫米的玻璃管和地点。蒸发在通风橱用空气至干。冲洗提取小瓶和剩余的粪便颗粒放入一个临床废物袋处置。
7. 重悬的粪便提取物在100％，1毫升甲醇和转移到一个12×75毫米²的聚丙烯管中。马上帽并储存在-20℃直至分析。

3.激素分析

1. 开展与使用皮质酮多克隆抗血清CJM006的酶联免疫分析（EIA）的分析。
   注意:第二次环评进行了测试（皮质醇R4866抗血清，但未能达到生化验证步骤（见第4.1节）多克隆皮质CJM006抗血清皮质醇R4866抗血清和相应的HRP的是由CJ蒙罗，加州大学提供，戴维斯，CA.
2. 在1稀释的抗血清:使用重复吸管和50微升枪头在包被缓冲液（0.05M碳酸氢钠，pH值9.6）15,000，装入96孔微量滴定板与50μl/孔。盖上板密封该板，并在4℃孵育O / N。假两件未涂井代表非特异性结合井（NSB）。
3. 使用前立即用自动微量滴定板垫圈（0.15 M氯化钠，0.05％吐温20洗涤溶液）洗涤微量滴定板五次。
4. 加载板，每孔50微升为NSB的和"零"的孔[EIA缓冲液（0.1M磷酸钠_4，0.149摩尔NaCl，0.1％牛血清白蛋白，pH 7.0）中仅]，标准（皮质酮，3.9 - 1000皮克/好）或粪便提取物样品（在1:20 EIA缓冲液适当稀释，见4.1）。标准和零点应一式三份，并一式四份分别运行。稀释粪便提取物样品和NSB的应一式两份运行。
5. 70000:立即加入50微升/孔的EIA缓冲液稀释至1标签辣根过氧化物酶结合物^ᵻ按照此。
6. 孵育在黑暗中微量滴定板在室温2小时。
7. 用洗涤液在室温在暗处用100微升洗涤微量滴定板5次，并培育板/ WEL升的RT衬底[0.4mM的2,2'-连氮基-二- （3-乙基磺酸）二铵盐，1.6毫_的 H ₂ O _2，0.05M的柠檬酸盐，pH为4.0]中。准备基底在使用前立即。
8. 使用分光光度计在405nm的波长读取微量滴定板。板的温育被认为完成时，零孔的光密度达到0.8至1.0。
9. 以确保可重复性，使用在EIA缓冲液稀释到结合在约30％（EIA标准），50％（生物样品如国内马的粪便提取物的池）和70％（EIA标准）的控制[EIA标准或生物样品]分别展示出的<10％的变化和<15％的区域内和测定间​​的系数。

4.酶联免疫法:为验证研究物种和性别

1. 生化验证（并行）
   1. 使用EIA缓冲池化粪额外进行连续稀释CT，最好从疑似高，低浓度的激素样取自几个人（范围:整齐，1:2至1:8192）和第3节中描述的EIA运行。
      注意:被视为实现了并行时粪便提取物的连续稀释产生平行于标准曲线和线性回归结果的位移曲线展示R2> 0.90，坡度> 0.50和P <0.05。该标准曲线上结合约50％的序列稀释的粪便提取物应该被认为是理想的稀释运行所有粪便提取物（ 例如，1:20）。没有对测定考虑当线性回归结果表明R2> 0.90和p <0.05的干扰。
2. 生化验证（干扰）
   1. 穗200微升的连续稀释的标准（零，3.9到1000纳克/孔皮质酮）与200微升适当稀释汇集粪便提取物[在50％稀释的结合而paralleli确定SM（1:20）和环评作为运行在第3节继EIA分析图观察到的浓度减去背景（零样品浓度）与预期的浓度。
      注:如果在加入稀释汇集粪便提取物与标准不显著改变量预期和线性回归的结果产生^{，R 2>} 0.90，接近1.0且p <0.05的斜率。环评无干扰已经实现。
3. 生物验证:
   注:所选择的环境影响评价具有测量感兴趣的激素生物相关变化的能力演示[ 例如，在以下药理糖皮质激素浓度上升（ACTH往往是有执照的程序）或生物攻击（ 例如，心理和/或环境;更可能是一种机会不管制事件）。
   1. 选择，提取和分析粪便样本对糖皮质激素代谢物浓度使用1节详述的过程 - 前一个具有挑战性的事件之后3。
      注:一个具有挑战性的活动将是具体的物种。的示例方法是针对国内马下面提供。马具有挑战性的活动全部例子已经包括使用管理⁹和饲养过程¹⁶先前公布。糖皮质激素代谢物浓度显著上升后的富有挑战性的活动必须遵守并利用统计分析证实。这必须包括在适当情况下，重复测量，采样日期和个人的影响。生物验证，然后视为实现。

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结果

国产马（N = 16，8匹母马，8阉马）15年（±3），平均年龄按性别，进行到四房的设计与社会隔离（N = 4马/治疗）的增加水平分组。房屋1参与马生活在畜群环境，密切模拟其自然栖息地。房屋2匹涉及生活在对在室内谷仓。房屋3参与马马厩但视觉接触到其他马匹和马匹房屋涉及4完全隔离单独放置。

暴露于每种处理是在一个随机的...

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讨论

粪便皮质酮分析提供了评估在马肾上腺活性长期型态的手段。该方法的非侵入性克服了用于评估肾上腺活性，包括唾液和血浆分析⁹其他采样方法混杂影响。此外，该技术具有如果学习自由测距马匹的明确的非侵入性的优势。

有几个关键点对本方法及其适当的使用进行讨论。在协议中的一个关键步骤是测定在质询和适当抗体的选择品种的验证。如果所使用的抗体与结?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore