Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme

Özet

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Özet

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Giriş

yöntem tarif amaçları adrenal aktivite non-invaziv bir değerlendirme sağlamak amacıyla at dışkısı kortikosteron konsantrasyonları analiz etmek. hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen aktivitesinin ölçülmesi esir ve yerli türler hem potansiyel caydırıcı durumlara tepki incelemek için kabul edilmiş bir yaklaşımdır. Referans tekniği ve en yaygın olarak kullanılan yöntem, ancak bu tür dışkı analizi gibi alternatif yöntemler bilgilerini kadar tür izleme olanağı kan örneği kendisinin neden olduğu stres üstesinden gelmek ve sağlamak amacıyla geliştirilmiştir kan plazması ^{1 'in} kullanımı olup.

caydırıcı bir durum sırasında, fizyolojik homeostasis bozulur. ön hipofiz bezi üzerinde hareket eder ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) salınımını uyarır salgılatıcı hormon (CRH) kortikotropin beyin sürümlerde hipotalamus. ACTH kan dolaşımına girer ve türünden salgılaması için adrenal korteksi uyarırs, belirli glukokortikoidler (GC). Glukokortikoidler yakından oldukça tutarlı nedenle genellikle diğer stres bağlantılı hormonların üzerinde ² tercih ölçülen tüm enerji artan devletler üretilen daha stresli olaylarla bağlantılıdır. Glukokortikoidler atların birçok adaptif etkileri sorumludur. Enerji hızlı yağlı asitler ve glukoz şeklinde vücuda depolama sitelerinden mobilize, oksijen alımı sensör fonksiyonu ³ geliştirilmiş ve kan akımı hareket ⁴ için gerekli olmayan alanlara azaltılır, artar. Yanı sıra bir başa çıkma mekanizması olarak hareket olarak, Glukokortikoid stres kaynaklı artış da sonraki stresör ⁵ için hayvan hazırlamak için yardımcı olabilir.

Hormon plazmadaki düzeyleri ve tükürük değerlendirilmesi gaita önlemler hormon metabolik son ürünü metabolitleri ölçmek, ancak gerçek dolaşan hormonu ölçüm içerir. Sirkülasyon steroid l katabolize edilenonlar bağırsak parça ⁶ içinde bakteri florasının enzimatik faaliyetleri kolaylaştırdı ileri değişikliklere uğrarlar safra için atılımı önce Iver. Bu nedenle, kan glukokortikoid yönelik bağışıklık dışkı glukokortikoid metabolitlerin ⁷ analizi için uygun ^olmayabilir.

Dışkı toplanması, at için bir rahatsızlık ile gerçekleştirilebilir gibi, kortikosteron için dışkı analizi, koşullar, bir dizi HPA etkinliğini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Atların dışkı içinde yükseltilmiş kortikosteron ameliyat sonrası tedavisi için veteriner hekimliğinde ⁸ boyunca ve kısıtlayıcı yuva ⁹ da dahil olmak üzere, potansiyel olarak caydırıcı durumlara cevap olarak bildirilmiştir. Fekal örnekleme zamanla toplanmış glukokortikoid düzeyi ziyade uzun vadeli, kronik veya mevsimsel desenleri ¹⁰ izlenmesi için uygun hale plazma ve tükürük tarafından sunulan zaman örnekleme noktasını yansıtır. Nedeniyle non-invaziv içinYöntemin niteliği, numuneler yakalama veya bağlama ¹¹ gerek kalmadan bir birey için, art arda toplanabilir. Bir numune alma protokolü planlama Ancak, türe özgü bağırsaktan geçiş süresi dikkate alınmalıdır. Atlarda, bağırsaktan geçiş süresi bu • durumda, böbrek üstü tepkisi ve daha sonra kortikosteron metabolitleri HPA ekseninin ilk aktivasyon bir gün sonra dışkı ile saptanabilir yaklaşık 18 saat ^12'dir.

Non-invaziv immunoassay teknikleri kullanılarak zaman araştırılan türler için dikkatli bir doğrulama ¹³ esastır. Buna ek olarak, hormon metabolit boşaltım cinsiyet farkları nedeniyle metabolizma hızı ve fareler ^14. ve tavuk ¹⁵ de dahil olmak üzere çeşitli türlerin atılır kortikosteron metaboliti türü farklılıkları muhtemelen bildirilmiştir. th ayrıntılı gibi deney erkek ve dişi, evcil atlar uygulamalarında kullanmak için geçerli olan bu yöntemin bir parçası olarak, bu nedenle önemlie protokolü. Cinsiyetler arasındaki hormon metabolizmasında Bu fark ele alınması ve tahlil doğrulama parçası olarak dahil nadiren edilir henüz veri kalitesi için sonuçları vardır.

Bu non-invaziv yöntem yerli atlar adrenal aktivitenin uzun süreli değerlendirmesini sağlar. protokol ayrıntıları testin geçerliliği ve tahlil tekniği kendisi hem de.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Etik açıklama: Alan örnekleme ve hayvan denekleri prosedürleri Nottingham Trent Üniversitesi'nde Animal, Kır ve Çevre Bilimi (ARES) Okulu tarafından onaylanmıştır.

Dışkı Örneklerinde 1. Koleksiyonu

NOT: Dışkı örnekleri ve metanol tutarken eldiven giyilmelidir. Bir hayvan gibi de giyilmelidir bir laboratuvar önlüğü gibi zoonotik hastalık, koruyucu giysiler muzdarip olabileceğini güçlü bir şüphe varsa.

1. dışkılama aşağıdaki (birkaç saat için dakika içinde) en kısa sürede dışkı örnekleri toplamak ve örnek bir torbaya koyun. yaklaşık 10 g toplam ağırlığa sahip bir defecated numunenin üç ila beş Alt-numûnelerin al. zaman ve toplama, bireysel kimlik tarihi ile çanta Etiket ve analize kadar -20 ° C'de örnek dondurmak.
2. tüm örnekleri dondurmak, hatayı en aza indirmek için -20 ° C kadar çalışma tamamlandığında sonra tek bir toplu olarak analiz için bir araya örnekleri toplamak.

2. Dışkı Hormon Ekstraksiyon

1. Oda sıcaklığında çözülmeye dışkı örnekleri bırakın.
2. Numuneler el ile kendi örnek torba içinde her numune karıştırılarak homojenize emin olun.
3. Her bir numune, ağırlığa tekne bir mikro 0.50 dışkı maddesi (g 0.003 ±) ağırlığında için daha sonra bir 8 ml bir cam şişeye dışkı aktarın. Her bir numune için yeni bir ağırlık teknesi kullanın ve her bir numune arasında% 30 metanol ile cımbız temizleyin.
4. 5% 90 ml metanol ile, dışkı maddesinin 0.5 g 'ını: su, ve oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcıda O / N sallayın.
5. Ertesi sabah, örnek karıştırın ve daha sonra 600 g'de 20 dakika boyunca santrifüj.
6. 37 ° C lik bir sıcaklığa ayarlanmış bir su banyosu içinde rafa 16 x 125 mm cam tüpe ² ve yerine metanol fraksiyonu süzün. Bir çeker ocak içinde hava ile kuruyana kadar buharlaştırın. ekstraksiyon şişeyi yıkayın ve bertaraf için bir klinik atık torbasına kalan dışkı pelet yerleştirin.
7. % 100 1 ml metanol dışkı özü yeniden askıya ve 12 x 75 ^mm2 bir polipropilen tüpü içine transfer. Hemen analiz edilinceye kadar -20 ° C'de kap saklayın.

3. Hormon Analizleri

1. poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum kullanarak bir enzim bağlantılı-immunoassay (EIA) ile analizi yürütmek.
   NOT:. İkinci ÇED (Kortizol R4866 antiserum test edilmiştir, fakat bu (Bölüm 4.1 bakınız) poliklonal kortikosteron CJM006 antiserum ve kortizol R4866 antiserum ve ilgili HRP en CJ Munro, California Üniversitesi tarafından sağlanan biyokimyasal doğrulama adımı gerçekleştirmek için başarısız, Davis, CA
2. 1 ile antiserumun seyreltilir: kaplama tamponu (0.05 M NaHCO3, pH 9.6) 'de 15,000 tekrar pipet ve 50 ul bir pipet kullanarak, / göz 50 ul, 96 oyuklu bir mikrotitre plakası yükleyin. Bir plaka kapatıcı ile örtün ve plaka, 4 ° C'de O / N inkübe edin. (N, spesifik olmayan bağlayıcı gözenekler temsil kaplanmamış iki kuyu boşSB).
3. Kullanımdan hemen önce, bir otomatik mikrotitre plaka yıkayıcısı (0.15 M NaCl,% 0.05 Tween 20 yıkama çözeltisi) kullanılarak, mikro ölçüm levhaları, beş kez yıkayın.
4. 1000 ug / - NSB en için oyuk başına 50 ul ve 'sıfır' kuyu [EIA tampon maddesi (0.1 M napo _4, 0.149 M NaCl,% 0.1 sığır serum albümini, pH 7.0) içinde, sadece] standartları (kortikosteron, 3.9 plakaları yük kuyu) veya uygun 01:20 ÇED tamponu seyreltilmiş dışkı özü numuneleri (,) bölüm 4.1'e bakınız. Standartlar ve sıfır sırasıyla üç kez ve dört nüsha olarak çalıştırılmalıdır. Sulandırılmış dışkı özü örnekleri ve NSB en nüsha halinde çalıştırılmalıdır.
5. 70.000: 50 ul / oyuk ile 1 EIA tamponu içinde seyreltilmiş etiket yaban turpu peroksidaz bağı ^ᵻ hemen takip etmektedir.
6. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca karanlıkta mikrotitre inkübe edin.
7. 100 ul ile karanlıkta, oda sıcaklığında plakalar yıkama çözeltisi ile 5 kez mikrotitre plakalar, yıkama ve inkübe / welRT substrat [0.4 mM 2,2'-azino-di- (3-etilbenztiyazolin-sülfonik asit) diamonyum tuzu, 1.6 mM _{H2O 2,} 0.05 M sitrat, pH 4.0] l. kullanımdan hemen önce alt-tabakanın hazırlanması.
8. mikrotitre plakaları okumak için 405 nm bir dalga boyunda bir spectrophometer kullanın. Sıfır kuyu optik yoğunluk ile 1.0 0.8 ulaştığında levha kuluçka tamamlandıktan olarak kabul edilir.
9. Tekrarlanabilirlik sağlamak için, yaklaşık% 30 (EIA standardı),% 50 (biyolojik numune örneğin, yerli at dışkı ekstresinin havuz) ve% 70 (EIA standardı) bağlamak için ÇED tamponunda seyreltilmiş kontrolleri [ÇED standartları ya da biyolojik bir örnek kullanınız ] sırasıyla <% 10 değişim ve <% 15 oranında bir içi ve inter-analiz katsayılarını göstermek için.

4. Enzim Linked-immunoassay: Çalışma Tür ve Sex Doğrulama

1. Biyokimyasal Doğrulama (Paralellik)
   1. ÇED tampon kullanarak, toplanmış fekal ekstra bir seri seyreltme gerçekleştirmekct, ideal olarak birkaç bireylerden şüphelenilen yüksek ve düşük hormon konsantrasyonu örneklerinden alınan (aralık: temiz, 1: 8192: 2 ile 1) ve 3. bölümde açıklandığı gibi ÇED çalıştırın.
      NOT: Dışkı özler seri seyreltme standart eğri ve lineer regresyon sonuçlarına bir deplasman eğrisi paralel verim BIR paralellik sağlanmıştır kabul edilir R2> 0.90, bir yamaç> 0.50 ve p <0.05 göstermektedir. Standart eğri üzerinde% 50 civarında bağlayan seri seyreltilmiş dışkı özü tüm dışkı özler çalıştırmak için ideal bir seyreltme düşünülmelidir (örneğin, 1:20). lineer regresyon sonuçları R2> 0.90 ve p <0.05 göstermek zaman tahlil üzerinde düşünülen hiçbir girişim yoktur.
2. Biyokimyasal Doğrulama (Girişim)
   1. % 50 sulandırılmış uygun toplanmış seyreltilmiş dışkı ekstresi [200 ul paralleli tarafından belirlenen bağlanma ile (3.9 1000 ng / çukur kortikosteron sıfır) seri olarak seyreltilmiş standartların 200 ul Spikesm (1:20)] ve ÇED analiz arsa ardından bölüm 3'teki gibi ÇED üzerinde çalışan gözlenen konsantrasyon eksi beklenen konsantrasyonuna karşı arka plan (sıfır numunenin konsantrasyonu).
      NOT: standartlara seyreltilmiş toplanmış fekal ekstresinin eklenmesi önemli ölçüde miktarı beklenen ve lineer regresyon sonuçlarını değiştirmez vermezse R ^2> 0.90, 1.0 ve p <0.05 yakın bir eğim verir. EIA ile hiçbir girişim elde edilmiştir.
3. Biyolojik Doğrulama:
   NOT: Seçilen ÇED ilgi hormon biyolojik ilgili değişiklikleri ölçmek yeteneğine sahip bir gösteri [örneğin, bir farmakolojik aşağıdaki glukokortikoid konsantrasyonlarda artış ya da biyolojik bir meydan okuma (ACTH genellikle lisanslı bir işlemdir) (örneğin, psikolojik ve / veya çevre; bir fırsatçı düzensiz olay olması daha muhtemeldir)].
   1. Seçin, özü ve glukokortikoid metabolit konsantrasyonları için dışkı örnekleri analizönce ve zorlu bir olaydan sonra 3 - bölümlerde 1 detaylı süreci kullanarak.
      NOT: zorlu bir olay özgü türler olacaktır. Bir örnek yöntemi yerli at için aşağıda verilmiştir. Atlar için zorlu olaylarla dolu örnekler yönetimi ⁹ ve hayvancılık prosedürleri ¹⁶ kullanımı dahil, daha önce yayınlanmıştır. zorlu olayın ardından glukokortikoid metabolit konsantrasyonlarında anlamlı bir artış gözlendi ve istatistiksel analiz kullanılarak onaylanmalıdır. Bu, tekrarlı ölçümlerde, örnek tarih ve bireysel etkisini uygun olan yerlerde içermelidir. Biyolojik doğrulama sonra elde sayılır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yurtiçi atları (n = 16, 8 kısrak, 8 geldings) 15 yıl (± 3) yaş ortalaması ile cinsiyete ve sosyal izolasyon (n = 4 at / tedavi) artan seviyeleri ile dört konut tasarımları tabi göre gruplandırıldı. yakından doğal yaşam simülasyonu, bir sürü ortamında yaşayan Konut 1. katılan atlar. kapalı ahırda çiftler yaşayan Konut 2 dahil atlar. Konut 3 tutulan atlar ahırlarda ancak diğer atlar ve atlar konut 4 dahil toplam izolasyon görsel temas yalnız ev sahipliği yap...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Dışkı kortikosteron analizi atlarda adrenal aktivitenin uzun süreli desen değerlendirmek için bir araç sağlar. Yöntemin non-invaziv doğa tükürük ve plazma analizi ⁹ olmak üzere adrenal aktivitesini değerlendirmek için kullanılan diğer örnekleme yöntemleri karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak teknik ücretsiz değişen atları okuyan eğer net bir non-invaziv bir avantaja sahiptir.

Bu yöntemle ve uygun kullanımıyla ilgili gör?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore