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要約

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

要約

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

概要

この方法は、副腎活性の非侵襲的評価を提供するために馬の糞便中のコルチコステロン濃度を分析することを目的とします。視床下部 - 下垂体 - 副腎（HPA）軸の活性を測定すると、キャプティブと国内の両方の種において潜在的に嫌悪事態への対応を研究するための一般に認められた手法です。参考技術と最も広く使用される方法は、しかしながら、例えば、糞便分析などの別の方法は、遊離の範囲の種を監視する能力を採血自体によって誘発されるストレスを克服し、可能にするために開発されてきた血漿1の使用です。

嫌悪状況の間に、生理的恒常性が破壊されています。下垂体前葉に作用し、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）の放出を刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）の副腎皮質脳のリリースでは視床下部。 ACTHは血流に入り、種を分泌する副腎皮質を刺激しますsの特定のグルココルチコイド（GC）。グルココルチコイドは密接ではなく、一貫したがって、彼らはしばしば他のストレスリンクのホルモン2の上に優先的に測定されているすべてのエネルギーの高まりの状態で製造されるよりも、ストレスの多いイベントにリンクされています。グルココルチコイドは、馬のいくつかの適応効果を担当しています。エネルギーが急速に酸素摂取量を増加させ、脂肪酸およびグルコースの形で体内の貯蔵部位から動員され、感覚機能は、3と、血流を向上さ動き4に必要でない領域まで低下します。同様に対処メカニズムとして機能するように、グルココルチコイドの応力誘起される上昇はまた、次のストレッサー5のために動物を準備するのを助けることができます。

血漿および唾液中のホルモンのレベルを評価することは、糞便中の代謝物の測定は、ホルモンの代謝最終産物を測定し、しかし実際の循環ホルモンを測定することを含みます。循環ステロイドはリットルに異化されています彼らは腸のトラック6内細菌叢の酵素活性によって容易にさらなる変化を受ける胆汁に排泄前にアイバー。したがって、血液グルココルチコイドに向けイムノアッセイは、糞便、グルココルチコイド代謝物7の分析に適していないかもしれません。

糞便収集が馬に乱れを行うことができるように、コルチコステロンのための糞の分析は、多くの状況でHPA活性をモニターするために広く使用されています。馬の糞便中の上昇コルチコステロンは、術後獣医の治療8の間にあり、限定ハウジング9に含む潜在的嫌悪状況に応じて報告されています。糞便サンプルは、時間をかけてプールされたグルココルチコイドレベルではなく、血漿および唾液長期的に監視することが適切で作る、慢性または季節的パターン10によって提供される時間サンプリング点を反映しています。非侵襲性に起因し方法の性質は、サンプルを捕捉または拘束具11を必要とせずに、個々の繰り返し収集することができます。サンプリングプロトコルを計画する際しかし、種特異的腸通過時間を考慮しなければなりません。馬では、腸の通過時間は約18時間12したがって、副腎応答およびその後のコルチコステロン代謝物は1日HPA軸の初期起動後に糞便中に検出することができます。

非侵襲的なイムノアッセイ技術を利用する場合検討さ種について注意深く検証は13不可欠です。また、ホルモンの代謝物の排泄の性差が原因で、マウス14、鶏15を含む様々な種に排泄コルチコステロン代謝物の代謝速度とタイプの違いにおそらく報告されています。アッセイは目に詳述されているように男性と女性の国内の馬の両方で使用するために検証されたそのため、この方法の一部として重要でした電子プロトコル。男女間のホルモン代謝におけるこの違いは、アドレス指定されず、アッセイの検証の一部として含まれているまれまだデータ品質に対する影響を有しています。

この非侵襲的方法は、国内のウマにおける副腎活動の長期評価を可能にします。プロトコルの詳細分析の検証およびアッセイ技術自体の両方。

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プロトコル

倫理文：フィールドサンプリングおよび動物対象を含む手順は、ノッティンガム・トレント大学の動物、農村環境科学（ARES）科で承認されています。

糞便サンプルの1コレクション

注：糞便サンプルおよびメタノールを取り扱う際は手袋を着用する必要があります。動物が人獣共通感染症に苦しんでいることができることを強い疑いがある場合は、そのような白衣などの防護服も着用してください。

  1. 排便、次の（数時間に分以内）できるだけ早く糞便サンプルを収集し、サンプルバッグに入れます。約10グラムの総重量で任意の排便サンプルの3つから5つのサブサンプルを取ります。 、収集の時刻と日付で袋にラベルを付け、個々のID、および分析まで-20℃でサンプルを凍結します。
  2. エラーを最小限に抑えるために、全てのサンプルは-20℃で凍結します °Cまでの研究である完全な単一のバッチとして分析のために一緒にサンプルを収集します。

2.糞便ホルモンの抽出

  1. 室温で解凍し糞便サンプルを残します。
  2. サンプルは手動で独自のサンプルバッグ内の各サンプルを混合することにより均質化されていることを確認。
  3. 各サンプルについて、その後8ミリリットルのガラスバイアルに糞を転送計量ボートに天秤に糞便材料で（0.003グラム±）0.50重量を量ります。各試料についての新しい計量ボートを使用して、各試料間の30％メタノールでピンセットをクリーニングします。
  4. 糞便物質の0.5グラム、90％メタノール5mlでコンバイン：水、そして室温でオービタルシェーカー上でO / Nを振ります。
  5. 翌朝は、サンプルをボルテックスした後、600グラムで20分間遠心します。
  6. 37℃の温度に設定した水浴中のラックに16×125 mm 2のガラス管と、所定の位置にメタノール画分をデカント。ドラフトチャンバー内の空気を使用して乾燥するまで蒸発させます。抽出用容器をすすぎ、処分のための医療廃棄物袋に残った糞石を配置します。
  7. 、100％で1ミリリットルのメタノールを糞便抽出物を再懸濁し、12×75ミリメートル2ポリプロピレンチューブに移します。すぐに分析するまで-20℃でキャップや店舗。

3.ホルモン分析

  1. ポリクローナルコルチコステロンCJM006抗血清を用いて、酵素結合イムノアッセイ（EIA）との分析を行います。
    注：第二EIAは（コルチゾールR4866抗血清を試験したが、これは（4.1節を参照してください）​​ポリクローナルコルチコステロンCJM006抗血清およびコルチゾールR4866抗血清とそれぞれのHRPのがCJマンロー、カリフォルニア大学によって供給されている生化学的検証ステップを達成するために失敗しました、デイビス、カリフォルニア
  2. 繰り返しのピペットと50μlのピペットチップを使用して、コーティング緩衝液（0.05 M炭酸水素ナトリウム、pHは9.6）で15,000、50μl/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートをロード：1で抗血清を希釈します。プレートシーラーでプレートを覆い、4℃でO / Nインキュベートします。非特異的結合ウェル（Nを表現するためにコーティングされていない2つの井戸を残しますSB）。
  3. 使用直前に自動マイクロタイタープレート洗浄機（; 0.15MのNaCl、0.05％ツイーン20洗浄液）を用いてマイクロタイタープレートを5回洗浄します。
  4. 千PG / - NSBのためのウェルあたり50μlのと「ゼロ」のウェル[EIA緩衝液（0.1 MのNaPO 4、0.149 MのNaCl、0.1％ウシ血清アルブミン、pH7.0）でのみ]、標準（コルチコステロン、3.9でプレートをロードウェル）または糞便抽出試料（適切に1時20分EIAバッファーで希釈し、4.1節を参照してください）​​。標準とゼロはそれぞれ、三重および四重に実行する必要があります。希釈した糞便抽出試料とNSBのは、二重に実行する必要があります。
  5. 7万：50μlの/ウェルを加え1にEIA緩衝液で希釈したラベル西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートᵻですぐにこれに従ってください。
  6. RTで2時間、暗所でマイクロタイタープレートをインキュベートします。
  7. 洗浄溶液でマイクロタイタープレートを5回洗浄し、100μl/ WELと暗闇の中で、室温でプレートをインキュベートRT基板のL [0.4mMの2,2'-アジノ-ジ（3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸）ジアンモニウム塩、1.6mMのH 2 O 2、0.05 Mクエン酸、pHを4.0]。使用直前に基板を準備します。
  8. マイクロタイタープレートを読み取るために405nmの波長で分光光度計を使用してください。ゼロウェルの光学濃度が0.8〜1.0に達したときに、プレートのインキュベーションが完了したと見なされます。
  9. 再現性を保証するために、約30％（EIA規格）、50％（生物学的サンプル、 例えば、国内の馬の糞便抽出液のプール）、70％（EIA規格）に結合するためにEIA緩衝液で希釈したコントロール[EIA規格または生物学的サンプルを使用]は、それぞれ<10％の変動と<15％の内およびアッセイ間の係数を実証します。

4.酵素結合免疫測定法：研究種の検証とセックス

  1. 生化学的検証（並列処理）
    1. EIA緩衝液を使用して、プールされた糞便余分に連続希釈を行いますCT、理想的には、いくつかの個体から疑われる高および低ホルモン濃度のサンプルから採取した（範囲：ニート、1：8192：2〜1）および第3章で説明したようにEIA上で実行されます。
      注：糞便抽出物の連続希釈が標準曲線と直線回帰の結果に変位曲線を平行に得たときに並列処理が達成されたと見なされはR2> 0.90、スロープ> 0.50およびp <0.05を示しています。標準曲線に50％前後を結合する段階希釈糞便抽出物は、すべての糞便抽出物を実行するために理想的な希薄化を考慮すべきである（ 例えば、1時20分）。線形回帰の結果はR2> 0.90およびp <0.05を実証するときにアッ​​セイに考え干渉はありません。
  2. 生化学的検証（干渉）
    1. 適当に希釈したプールされた糞便抽出液200μlで連続的に希釈した標準液200μl（ゼロ、3.9〜1000 ngの/ウェルコルチコステロン）のスパイク[50％に希釈したparalleliによって決定バインディングSM（1時20分）]およびEIA分析プロット次のセクション3のようにEIA上で実行観察濃度マイナス予想濃度対バックグラウンド（ゼロサンプルの濃度）。
      注：標準の希釈プールされた糞便抽出物の添加が有意量予想と線形回帰の結果を変更しない場合はR 2> 0.90、1.0およびp <0.05に近い傾斜をもたらします。 EIAとの干渉が達成されていません。
  3. 生物学的検証：
    注：選択されたEIAは、関心のホルモンの生物学的に関連する変化を測定する能力を持っていることを実証[ 例えば、薬理以下のグルココルチコイド濃度の上昇（ACTHは、多くの場合、ライセンス手続きである）または生物学的課題（ 例えば、心理学的および/ ​​または環境;日和見無秩序なイベントである可能性がより高いです）]。
    1. グルココルチコイド代謝物濃度のために糞便サンプルを選択し、抽出して分析します挑戦的なイベントの前と後の3 - セクション1に詳述プロセスを使用して。
      注：挑戦的なイベントは、特定の種​​になります。例示的な方法は、国内の馬のために以下に提供されます。馬のための挑戦的なイベントの完全な例は、管理9と飼育手順16の使用を含め、以前に発表されています。挑戦的なイベント次のグルココルチコイド代謝物濃度の有意な上昇が観察され、統計的分析を用いて確認する必要があります。これは、適切な場合には反復測定は、サンプルの日付と個々の効果を組み込む必要があります。生物学的検証は、次に達成と考えられています。

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結果

国内馬（N = 16は、8頭の牝馬、8去勢馬）15年（±3）の平均年齢と性別に応じてグループ化され、社会的孤立のレベルの増加と4住宅のデザインを施した（n = 4の馬/処理）しました。密接に彼らの自然の生息地をシミュレートし、群れ環境に住んでいる住宅1関与馬。屋内納屋でペアに住んでいる住宅2関与馬。ハウジング3関与馬は厩舎ではなく、他の馬と馬のハウジング4?...

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ディスカッション

糞便のコルチコステロン分析は、ウマにおいて副腎活動の長期的パターンを評価する手段を提供します。方法の非侵襲的な性質は、唾液、血漿分析9を含む副腎活性を評価するために使用される他のサンプリング方法の交絡効果を克服します。自由変動の馬を研究する場合に加えて技術は明確な非侵襲的な利点を有しています。

このメソッドとその適切な利用に?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Corticosterone antibody & HRP kitCoralie Munro - UC DavisNo longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kitCoralie Munro - UC DavisNo longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormoneSigma Aldrich50-23-7Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormoneSigma Aldrich15087-01-1Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
MethanolSigma Aldrich67-56-1Irritant. Use in fume cupboard
Sodium BicarbonateSigma Aldrich144-55-8Irritant
Sodium Carbonate AnhydrousSigma Aldrich497-19-8Irritant
Sodium Phosphate DibasicSigma Aldrich7558-79-4Irritant
Sodium Phosphate MonobasicSigma Aldrich10049-21-5Irritant
BSASigma Aldrich9048-46-8Irritant
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5Irritant
Citric AcidSigma Aldrich77-92-9Irritant
ABTSSigma Aldrich30931-67-0Irritant
Hydrogen Peroxide 30%Sigma Aldrich7722-84-1Irritant
Sodium ChlorideSigma Aldrich7647-14-5Irritant
Buffer capsules - pH 4VWR332732B
Buffer capsules - pH 7VWR332742D
Buffer capsules - pH 10VWR332762H
Hydrochloric AcidSigma Aldrich435570Irritant. Use in fume cupboard
Sodium HydroxideSigma AldrichS5881Irritant
Analytical balanceFisher ScientificBFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinetVWR649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrerVWR640-282
Microplate readerVWR
Microplate washerVWR
pH meterVWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2VWR
Pipette - 1,000 µlVWR
Pipette - 200 µlVWR
Pipette - 20 µlVWR
Repeater pipetteVWR
Pipette fillerVWR
Orbital shakerProgen Scientific
SonicatorHilsonic
VortexVWR
Warm water bath
Water purification systemMillipore

参考文献

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