Fecal glucocorticoïdes Analyse: Surveillance surrénale non invasive en Equidés

Résumé

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Résumé

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Introduction

La méthode décrite vise à analyser les concentrations de corticostérone dans les fèces équins afin de fournir une évaluation non invasive de l'activité surrénale. Mesure de l'activité (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien est une approche acceptée pour étudier la réponse à des situations potentiellement aversif chez les deux espèces en captivité et domestiques. La technique de référence et la méthode la plus largement utilisée est l'utilisation du plasma sanguin ¹ cependant, d' autres méthodes telles que l' analyse fécale ont été développés afin de surmonter le stress induit par le prélèvement de sang lui - même et permettre à la capacité de surveiller les espèces en liberté.

Dans une situation aversif, l'homéostasie physiologique est perturbé. L'hypothalamus dans le cerveau libère Corticolibérine (CRH) qui agit sur l'hypophyse antérieure et stimule la libération de l'hormone corticotrope (ACTH). ACTH pénètre dans le sang et stimule le cortex surrénalien à sécréter espèces glucocorticoïdes spécifiques (GC). Les glucocorticoïdes sont étroitement liés à des événements stressants plutôt que d' être produite de manière cohérente dans tous les états d'énergie accrue par conséquent , ils sont souvent mesurés en priorité sur les autres contraintes liées hormones ^2. Les glucocorticoïdes sont responsables de plusieurs effets adaptatifs chez les chevaux. L' énergie est rapidement mobilisée à partir de sites de stockage dans le corps sous la forme d'acides gras et de glucose, l' apport en oxygène est augmentée, la fonction sensorielle est améliorée ³ et le flux sanguin est réduit dans les zones ne sont pas nécessaires pour le mouvement ^4. En plus d'agir comme mécanisme d' adaptation, le stress hausse induite par les glucocorticoïdes peut également aider à préparer l'animal pour la prochaine stresseur ^5.

L'évaluation des niveaux d'hormones dans le plasma et la salive consiste à mesurer l'hormone circulante réelle cependant, la mesure des métabolites dans les mesures de fèces le produit final métabolique de l'hormone. stéroïdes circulantes sont catabolized dans la lIver avant l' excrétion de la bile où ils subissent d' autres changements facilitées par les activités enzymatiques de la flore bactérienne intestinale dans la piste ^6. Par conséquent, immunoessais dirigés vers glucocorticoïdes sanguins peuvent ne pas être adapté à l' analyse des métabolites glucocorticoïdes fécaux ^7.

Comme la collecte fécale peut être effectuée sans perturbation du cheval, l'analyse des selles pour la corticostérone, a été largement utilisé pour surveiller l'activité HPA dans un certain nombre de circonstances. Corticostérone Elevated dans les selles des chevaux a été rapporté en réponse à des situations potentiellement aversif , y compris pendant le traitement vétérinaire post-opératoire ⁸ et dans le logement ⁹ restrictive. Échantillonnage fécal reflète un niveau de glucocorticoïdes mis en commun au fil du temps plutôt que le point dans l' échantillonnage de temps offert par le plasma et la salive rendant approprié pour le suivi à long terme, chronique ou modèles saisonniers ^10. En raison de la non-invasivenature de la méthode, des échantillons peuvent être recueillis à plusieurs reprises pour un individu sans qu'il soit nécessaire de capture ou de retenue ^11. Cependant, les espèces spécifiques gut temps de transit doit être pris en compte lors de la planification d'un protocole d'échantillonnage. Chez les chevaux, le temps de transit intestinal est d' environ 18 h ¹² donc, la réponse des surrénales et des métabolites de corticostérone ultérieures peuvent être détectées dans les selles un jour après l' activation initiale de l'axe HPA.

Lors de l' utilisation des techniques de dosage immunologique non invasifs une validation minutieuse pour l'espèce étudiée est essentielle ^13. En outre, les différences de sexe en hormone métabolite excrétion ont été rapportés probablement en raison de différences dans le taux métabolique et le type de corticostérone métabolite excrété dans diverses espèces , y compris les souris ^14, et les poulets ^15. Il était donc important dans le cadre de cette méthode que le test a été validé pour une utilisation à la fois mâle et chevaux domestiques comme cela est détaillé dans eProtocole e. Cette différence dans le métabolisme hormonal entre les sexes a des conséquences sur la qualité des données mais il est rarement pris en compte et inclus dans le cadre de la validation du test.

Cette méthode non-invasive permet à long terme l'évaluation de l'activité des glandes surrénales chez les chevaux domestiques. Les détails du protocole à la fois la validation de l'essai et de la technique de dosage elle-même.

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Protocole

déclaration éthique: les procédures impliquant l'échantillonnage sur le terrain et les animaux sujets ont été approuvés par l'École des animaux, rural et sciences de l'environnement (ARES) à l'Université de Nottingham Trent.

1. Prélèvement des échantillons fécaux

NOTE: Les gants doivent être portés lors de la manipulation des échantillons fécaux et le méthanol. S'il y a une forte suspicion que l'animal pourrait souffrir d'une maladie zoonotique, des vêtements de protection comme une blouse de laboratoire devraient également être portés.

1. Recueillir les échantillons de matières fécales dans les plus brefs délais (min à quelques heures) après la défécation et les placer dans un sac de prélèvement. Prendre trois à cinq sous-échantillons de tout échantillon déféqué avec un poids total d'environ 10 g. Etiqueter le sac avec le temps et la date de collecte, ID individuelle et congeler l'échantillon à -20 ° C jusqu'à l'analyse.
2. Pour minimiser l'erreur, de geler tous les échantillons à -20 ° C jusqu'à ce que l'étude soit terminée, puis rassembler les échantillons ensemble pour l'analyse en un seul lot.

2. Fecal Hormone Extraction

1. Laisser les échantillons fécaux décongeler à la température ambiante.
2. Veiller à ce que les échantillons sont homogénéisés en mélangeant manuellement chaque échantillon dans son propre sac de l'échantillon.
3. Pour chaque échantillon, peser 0,50 (± 0,003 g) de la matière fécale sur une microbalance dans un bateau peser ensuite transférer les matières fécales à 8 ml flacon en verre. Utilisez une nouvelle pesée bateau pour chaque échantillon et nettoyer les pincettes avec 30% de méthanol entre chaque échantillon.
4. Mélanger 0,5 g de matières fécales avec 5 ml de méthanol à 90%: l'eau, et agiter O / N sur un agitateur orbital à température ambiante.
5. Le lendemain matin, VORTEX l'échantillon, puis centrifuger pendant 20 min à 600 g.
6. Décanter la fraction de méthanol dans un tube et lieu 16 x 125 mm ² verre dans un rack dans un bain d'eau réglé à une température de 37 ° C. Evaporer à sec utilisant de l'air dans une hotte. Rincer la fiole d'extraction et de placer la pastille fécale restante dans un sac de déchets cliniques pour l'élimination.
7. Resuspendre les extraits fécaux dans 100%, 1 ml de methanol et transférer dans un tube de 12 x 75 mm ² en polypropylène. Boucher immédiatement et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse.

3. Analyse Hormone

1. Effectuer l'analyse avec un lien immuno-enzymatique (EIA) utilisant des anticorps polyclonaux corticostérone CJM006 antisérum.
   NOTE:. Une deuxième EIA a été testé (Cortisol R4866 antisérum, mais cela n'a pas réussi à atteindre l'étape de validation biochimique (voir section 4.1) L'antisérum polyclonaux corticostérone CJM006 et Cortisol R4866 antisérum et le HRP de respectif sont fournis par CJ Munro, Université de Californie, Davis, CA.
2. Diluer l'antisérum à 1: 15.000 dans un tampon de revêtement (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) à l'aide d'une pipette répétitive et une pointe de pipette 50 pi, charger une plaque de microtitration 96 puits avec 50 pl / puits. Couvrir la plaque avec un scellant pour plaques et incuber O / N à 4 ° C. Laissez deux puits non couchés pour représenter les puits de liaison non spécifiques (NSB).
3. Immédiatement avant utilisation, se laver les plaques de microtitration cinq fois en utilisant un laveur de plaques de microtitrage automatisé (solution de lavage; 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20).
4. Chargez les plaques avec 50 pl par puits pour l'ONN et des puits [tampon EIA (0,1 M NaPO _4, 0,149 M de NaCl, 0,1% d' albumine de sérum bovin, pH 7,0) seulement] «zéro», les normes (corticostérone, 3,9 - 1,000 pg / bien) ou des échantillons d'extraits fécaux (dilué de manière appropriée à 1h20 tampon EIA, voir section 4.1). Normes et zéros doivent être exécutés en triple et quadruple, respectivement. échantillons d'extrait de selles dilué et ONN devraient être en double.
5. Suivre cette immédiatement avec l' addition de 50 pl / puits du marqueur conjugué à la peroxydase de raifort ^ᵻ dilué dans le tampon EIA à 1: 70.000.
6. Incuber les plaques de microtitrage dans l'obscurité pendant 2 heures à température ambiante.
7. Laver les plaques de microtitrage avec une solution de lavage 5 fois et incuber les plaques à la température ambiante dans l'obscurité avec 100 pl / well de substrat RT [0,4 mM de 2,2'-azino-di- (acide sulfonique 3-éthylbenzothiazoline) de sel de diammonium, 1,6 mM de H ₂ O _2, 0,05 M de citrate, pH 4,0]. Préparer le substrat immédiatement avant l'utilisation.
8. Utilisez un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 405 nm pour lire les plaques de microtitrage. L'incubation des plaques est considérée comme terminée lorsque la densité optique des puits zéro atteint entre 0,8 et 1,0.
9. Pour assurer la répétabilité, les contrôles [normes EIA ou un échantillon biologique dilué dans un tampon EIA pour se lier à environ 30% (norme EIA), 50% (un échantillon biologique , par exemple, la piscine du cheval domestique extrait fécal) et 70% (norme EIA) utiliser ] de démontrer un intra- et inter-dosage coefficients de variation de <10% et <15% respectivement.

4. Enzyme Linked-immunologique: Validation pour les espèces études et le sexe

1. Biochemical Validation (Parallélisme)
   1. Utilisation de tampon EIA, effectuer une dilution en série sur groupée supplémentaire fécalect, idéalement prises à partir d'échantillons de concentration de l'hormone haute et basse soupçonnés de plusieurs individus (plage: propre, 1: 2 à 1: 8192) et exécuter sur l'EIA comme décrit dans la section 3.
      REMARQUE: Un parallélisme est considéré comme atteint quand les dilutions en série d'extraits fécaux donnent une courbe de déplacement parallèle aux résultats et la courbe de régression standard démontrent R2> 0,90, une pente> 0,50 et p <0,05. L'extrait fécal dilué de série qui se lie à environ 50% sur la courbe standard doit être considérée comme la dilution idéale pour exécuter tous les extraits fécaux (par exemple, 01:20). Il n'y a pas d'interférence considéré sur le dosage lorsque les résultats de régression linéaire montrent R2> 0,90 et p <0,05.
2. Biochemical Validation (Obstruction)
   1. Spike 200 ul de standards dilués en série (zéro, 3,9 à 1000 ng / puits corticostérone) avec 200 ul de l'extrait fécal dilué de façon appropriée mis en commun [dilué à 50% déterminée par la liaison parallelism (1:20)] et exécuter sur l'EIE comme dans la section 3. Après EIA tracé d'analyse de la concentration observée moins le fond (concentration de l'échantillon zéro) par rapport à la concentration attendue.
      NOTE: Si l'ajout de dilution extrait fécal commun aux normes ne modifie pas de manière significative les résultats de la régression montant prévu et linéaires donne R ^2> 0,90, une pente proche de 1,0 et p <0,05. Aucune interférence avec l'EIA a été atteint.
3. La validation biologique:
   NOTE: Une démonstration que l'EIE choisie a la capacité de mesurer les changements biologiquement pertinentes de l'hormone d'intérêt [par exemple, l'augmentation des concentrations de glucocorticoïdes suivantes un pharmacologique (ACTH est souvent une procédure autorisée) ou un défi biologique (par exemple, psychologique et / ou environnement; plus susceptibles d'être un événement non réglementée opportuniste)].
   1. Sélectionnez, d'extraire et d'analyser des échantillons fécaux pour les concentrations de métabolites de glucocorticoïdesen utilisant le processus décrit dans les sections 1-3 avant et après un événement difficile.
      NOTE: Un événement difficile sera d'espèces spécifiques. Un procédé d'exemple est fourni ci-dessous pour le cheval domestique. Des exemples complets d'événements difficiles pour les chevaux ont été publiés précédemment , y compris l'utilisation de la gestion ⁹ et élevage procédures ^16. Une augmentation significative des concentrations de métabolites glucocorticoïdes après l'événement difficile doit être observée et confirmée par l'analyse statistique. Cela doit inclure le cas échéant, l'effet des mesures répétées, la date de l'échantillon et des particuliers. validation biologique est alors considéré comme atteint.

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Résultats

chevaux domestiques (n = 16, 8 juments, 8 hongres) avec un âge moyen de 15 ans (± 3) ont été regroupés en fonction du sexe et soumis à quatre modèles de logement avec des niveaux croissants d'isolement social (n = 4 cheval / traitement). Logement 1 impliqué chevaux vivant dans un environnement de troupeau, simulant étroitement leur habitat naturel. Logement 2 impliqués chevaux vivant en couple dans une grange couverte. Logement 3 chevaux impliqués logés seuls dans les éc...

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Discussion

analyse de corticostérone Fecal fournit un moyen d'évaluer les modèles à long terme de l'activité des glandes surrénales chez les chevaux. La nature non-invasive de la méthode permet de surmonter les effets de confusion d'autres méthodes d'échantillonnage utilisées pour évaluer l' activité des glandes surrénales , y compris la salive et le plasma analyse ^9. En outre, la technique présente un avantage non-invasive clair si l'étude des chevaux libres allant.

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore