JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Abstract

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Introduction

המטרות תארו השיטה לנתח ריכוזי corticosterone בצואת סוסים כדי לספק הערכה לא פולשנית של פעילות כליה. מדידת ההיפותלמוס-היפופיזה-אדרנל (HPA) פעילות ציר היא גישה מקובלת ללמוד התגובה למצבים מרתיעים פוטנציאל בשני מיני בשבי ומקומיים. טכניקת התייחסות השיטה הנפוצה ביותר היא השימוש פלזמת דם 1 עם זאת, שיטות חלופיות כגון ניתוח צואה פותחו כדי להתגבר על הלחץ הנגרם על ידי לקיחת דמים עצמו ולאפשר את היכולת לפקח מינים הנעים בחינם.

במהלך מצב מרתיע, הומאוסטזיס פיסיולוגי מופר. ההיפותלמוס ב המוח משחרר corticotrophin משחררים הורמון (CRH) אשר פועלת על בלוטת יותרת המוח הקדמית ומעורר שחרור הורמון אדרנוקורטיקוטרופי (ACTH). ACTH נכנס לזרם הדם ומעורר את קליפת יותרת הכליה להפריש מצלצליםזה גלוקוקורטיקואידים ספציפיים (GC). Glucocorticoids מתקיים קשר הדוק לאירועים מלחיצים ולא שיופק באופן עקבי בכל המדינות מוגברות האנרגיה ולכן הם נמדדים לעתים קרובות עדיפים על פני הורמונים צמודי מתח אחרים 2. Glucocorticoids אחראי מספר השפעות אדפטיבית בסוסים. אנרגיה מגויסת במהירות מאתרי אחסון בגוף בצורה של חומצות שומן וגלוקוז, צריכת חמצן מוגברת, תפקוד חושי הוא משופר 3 ואת זרימת דם יורדת לאזורים אין צורך לתנועה 4. כמו גם מתנהג כמו מנגנון התמודדות, עליית המתח המושרית ב Glucocorticoids עשויה גם לעזור להכין את חית הדחק הבא 5.

הערכת רמות הורמוני הפלזמה ורוק כרוך מדידת ההורמון במחזור בפועל לעומת זאת, מדידת מטבוליטים אמצעי צואת המוצר הסופי המטבולית של ההורמון. סטרואידים במחזור הם catabolized ב lIver לפני ההפרשה אל המרה שם הם עוברים שינויים נוספים בהנחייתם של הפעילות אנזימטית של פלורת חיידקים בתוך מסלול מעי 6. לכן, immunoassays מכוונת גלוקוקורטיקואידים דם ואינה מתאימה לניתוח של מטבוליטים בסטרואידי צואת 7.

כמו אוסף צואה יכול להתבצע ללא הפרעה אל הסוס, ניתוח ובצואה corticosterone, כבר נעשה שימוש נרחב כדי לעקוב אחר פעילות HPA בכמה נסיבות. Corticosterone הגבוהה בצואה של סוסים דווחה בתגובה למצבים מרתיעים פוטנציאל כלל במהלך טיפול וטרינרי ניתוח שלאחר 8 ו בדיור 9 מגבילים. דגימת צואה משקפת רמה בסטרואידים נקוותה לאורך זמן ולא טעם דגימת זמן המוצע על ידי פלזמה ורוק מה שהופך אותו מתאים לניטור ארוך טווח, כרוני או דפוסים עונתיים 10. בשל פולשניטבעה של השיטה, דגימות ניתן לאסוף שוב ושוב ליחיד ללא צורך ללכוד או ריסון 11. עם זאת, זמן מעבר במעי ספציפי מינים חייב להילקח בחשבון בעת ​​תכנון פרוטוקול דגימה. בסוסים, זמן מעבר במעי הוא סביב 18 שעות 12 ולכן, תגובת כלית מטבוליטים corticosterone עוקבים ניתן לאתר בצואה יום אחד לאחר הפעלה ראשונית של ציר HPA.

כאשר ניצול טכניקות immunoassay פולשני אימות זהירה עבור המין הנחקרת היא 13 חיונית. בנוסף, קיימים הבדלים בין המגדרים בהפרשת הורמון המטבוליט דווחו ככל הנראה בשל הבדלים בקצב חילוף החומרים וסוג המטבוליט corticosterone מופרש מינים שונים, כולל עכברים 14, ותרנגולות 15. לכן היה חשוב כחלק בשיטה זו כי assay שקיבל תוקף לשימוש גם זכר וגם נקבה סוסים המקומי כפי מפורט הפרוטוקול הדואר. להבדל הזה במטבוליזם הורמון בין המינים השלכות על איכות הנתונים ובכל זאת לעתים רחוקות התייחס וכלל כחלק מאימות assay.

שיטה לא פולשנית זו מאפשרת הערכה לטווח ארוכה של פעילות כליה בסוסים מקומיים. פרטי הפרוטוקול הוא האימות של assay ואת טכניקת assay עצמו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הצהרה אתיקה: הנהלים הקשורים בנושאים הדגימה ובעלי חיים בשדה אושרו על ידי בית הספר Animal, כפרי ואיכות הסביבה מדע (ARES) ב נוטינגהאם טרנט האוניברסיטה.

1. איסוף של דגימות צואה

הערה: יש ללבוש כפפות בעת טיפול דגימות צואה, מתנול. אם קיים חשד כבד כי חיה יכול להיות סובל ממחלה zoonotic, ביגוד מגן כגון חלוק מעבדה צריך גם להיות משוחק.

  1. לאסוף את דגימות צואה בהקדם האפשרי (בתוך דקות עד מספר שעות) לאחר עשיית צרכים ולהכניס אותם לתוך שקית מדגם. להימשך בין שלוש לחמש subsamples של כל מדגם חירבן במשקל כולל של כ -10 גרם. לייבל את השקית עם השעה והתאריך של אוסף, מזהה הפרט, ולהקפיא המדגם ב -20 ° C עד הניתוח.
  2. כדי למזער שגיאות, להקפיא את כל הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד המחקר הושלם ואז אוסף את הדגימות יחד לניתוח כקבוצה אחת.

2. הפקת הורמון צואה

  1. השאירו את דגימות צואה להפשיר ב RT.
  2. ודא כי דגימות הומוגני ידי ערבוב כל דגימה ידנית בתיק מדגם משלו.
  3. עבור כל דגימה שוקלת 0.50 (± 0.003 גרם) של חומר צואתי על microbalance בסירה לשקול מכן להעביר את הצואה כדי בקבוקון זכוכית 8 מיליליטר. השתמש בסירה לשקול חדשה עבור כל דגימה ולנקות פינצטה עם מתנול 30% בין כל דגימה.
  4. מערבבים את 0.5 גרם של חומר צואתי עם 5 מ"ל של 90% מתנול: מים, ולנער O / N על שייקר מסלולית ב RT.
  5. למחרת בבוקר, מערבולת המדגם ולאחר מכן צנטריפוגות במשך 20 דקות ב 600 גרם.
  6. למזוג את שבר מתנול לתוך צינור זכוכית 16 x 125 מ"מ 2 ומניחים מתלים באמבט מים על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. להתאדות כדי יובש באמצעות אוויר בתוך ארון קטר. יש לשטוף את בקבוקון החילוץ ומניח גלולת הצואה הנותרת לתוך שקית פסולת קלינית לסילוק.
  7. Re- להשעות את תמציות צואתי ב 100%, 1 מ"ל מתנול להעביר צינור פוליפרופילן 12 x 75 מ"מ 2. מיד כובע ולאחסן ב -20 ° C עד הניתוח.

3. ניתוח הורמון

  1. לבצע את הניתוח עם-immunoassay מקושר האנזים (EIA) באמצעות antiserum CJM006 corticosterone polyclonal.
    הערה:. EIA השני נבדק (antiserum קורטיזול R4866, אבל זה לא הצליחה להשיג את שלב האימות ביוכימיים (ראה סעיף 4.1) את antiserum Polyclonal corticosterone CJM006 ו antiserum קורטיזול R4866 ואת בהתאמה HRP של מסופקים על ידי CJ מונרו, אוניברסיטת קליפורניה, דיוויס, קליפורניה
  2. לדלל את antiserum ב 1: 15,000 חיץ ציפוי (0.05 מ 'NaHCO3, pH 9.6) בעזרת פיפטה חוזרות קצה פיפטה 50 μl, לטעון צלחת microtitre 96-היטב עם 50 μl / היטב. מכסים את הצלחת עם אוטם צלחת דגירה O / N ב 4 ° C. השאר שתי בארות ללא ציפוי לייצג את בארות מחייב הלא ספציפיות (NSB).
  3. מייד לפני המריחה יש לשטוף את צלחות microtitre חמש פעמים באמצעות מכונת כביסת צלחת microtitre אוטומטית (פתרון לשטוף; 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20).
  4. טען את צלחות עם 50 μl לכל טוב עבור NSB של ו 'אפס' בארות [חיץ EIA (0.1 M 4 Napo, 0.149 M NaCl, 0.1% בסרום שור אלבומין, pH 7.0) רק], תקנים (corticosterone, 3.9 - 1,000 pg / כן) או לחלץ דגימות צואה (מדולל כראוי בשעה 1:20 חיץ EIA, ראה סעיף 4.1). לתקני אפסים צריכים לרוץ בשלושה עותקים ארבעה פעמים, בהתאמה. מדוללים לחלץ דגימות צואה NSB של צריכות להתנהל בשני עותקים.
  5. בצע את זה מיד עם תוספת של 50 μl / טוב של ᵻ המצומד peroxidase תווית חזרת מדולל במאגר EIA עד 1: 70,000.
  6. דגירה צלחות microtitre בחושך במשך שעה 2 ב RT.
  7. שטפו את צלחות microtitre עם פתרון לשטוף 5 פעמים דגירה צלחות ב RT בחושך עם 100 μl / well של המצע RT [0.4 מ"מ 2,2'-azino-דוּ (חומצה sulfonic 3-ethylbenzthiazoline) מלח diammonium, 1.6 מ"מ H 2 O 2, 0.05 מ 'ציטראט, pH 4.0]. מכינים את המצע מיד לפני השימוש.
  8. השתמש spectrophometer באורך גל של 405 ננומטר כדי לקרוא את לוחית microtitre. דגירה של צלחות נחשבת להשלים כאשר הצפיפות האופטית של אפס הבארות מגיעה 0.8 1.0.
  9. כדי להבטיח את הדירות, השתמש שולטת [סטנדרטים EIA או דגימה ביולוגית מדולל במאגר EIA להיקשר בכ 30% (תקן EIA), 50% (א למשל דגימה ביולוגית, מאגר של תמצית המקומי סוס צואה) ו -70% (תקן EIA) ] להפגין מקדמי תוך-assay יתר של וריאציה של <10% ו- <15% בהתאמה.

4. אנזימים צמוד immunoassay: תיקוף של מיני הלימוד והמין

  1. אימות ביוכימיים (מקביליות)
    1. באמצעות חיץ EIA, לבצע דילול סדר על ותקווה צואה נוספתct, אידיאלי שנלקחו דגימות ריכוז הורמון גבוהות ונמוכות חשד מכמה אנשים (טווח: מסודר, 1: 2 עד 1: 8192) ולהפעיל על EIA כמפורט בסעיף 3.
      הערה: הקבלה נחשבת מושגת כאשר דילולי סדרה של תמציות צואה להניב במקביל עקום עקירה לתוצאות רגרסיה העקומה ולינארית התקן להפגין R2> 0.90, מדרון> 0.50 ו- p <0.05. התמצה הצואה המדוללת סדרה שקושר סביב 50% על עקומת הסטנדרט יש לשקול דילול האידיאלי כדי להפעיל את כל התמציות בצואה (למשל, 1:20). אין הפרעה נחשב על assay כשתוצאות רגרסיה ליניארית להפגין R2> 0.90 ו- p <0.05.
  2. אימות ביוכימיים (התאבכות)
    1. ספייק 200 μl של סטנדרטים בדילול סדרתי (אפס, 3.9 כדי 1000 ng / טוב corticosterone) עם 200 μl של תמצית צואה בדילול ונקווה כראוי [מדולל ב 50% כריכת שקבע paralleliSM (1:20)] ולהפעיל על EIA כמו בסעיף 3. בעקבות עלילת ניתוח EIA הריכוז שנצפה מינוס ברקע (הריכוז של המדגם אפס) לעומת הריכוז הצפוי.
      הערה: אם תוספת של תמצית צואה ונקווה בדילול לתקנים לא לשנות באופן משמעותי את הסכום הצפוי ולינארית תוצאות רגרסיה מניב R 2> 0.90, מדרון קרוב ל -1.0 ו- p <0.05. אין התערבות עם EIA הושגה.
  3. אימות ביולוגיות:
    הערה: הפגנה כי EIA נבחר יש את היכולת למדוד שינויים רלוונטיים הביולוגי של הורמון עניין [למשל, העלייה הריכוזית בסטרואידים בעקבות תרופתי (ACTH היא בדרך כלל הליך מורשה) או אתגר ביולוגי (למשל, פסיכולוגיים ו / או סביבתי; סיכוי גבוה יותר להיות אירוע מוסדר אופורטוניסטים)].
    1. בחר, לחלץ ולנתח דגימות צואה לריכוזי המטבוליט בסטרואידיםבאמצעות התהליך המפורטים בסעיפים 1 - 3 לפני ואחרי אירוע מאתגר.
      הערה: אירוע מאתגר יהיה מינים ספציפיים. שיטה למשל מוצגת להלן הסוס המקומי. דוגמאות מלאות של אירועים מאתגרים לסוסים פורסמו בעבר כולל שימוש פרוצדורות ניהול 9 ו בעלי 16. עלייה משמעותית בריכוז המטבוליט בסטרואידים בעקבות האירוע המאתגר יש להקפיד ואשרה באמצעות ניתוח סטטיסטי. זה חייב לשלב במידת צורך, את ההשפעה של מדידות חוזרות, תאריך מדגם בודד. אימות ביולוגית נחשבה אז מושגת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

סוסים מקומיים (n = 16, 8 סוסות, 8 מסורסים) עם גיל ממוצע של 15 שנים (± 3) קובצו לפי מגדר נתון העיצובים דיור ארבעה ברמות הולכות וגדלות של בידוד חברתי (n = 4 סוסים / טיפול). שיכון 1 מעורבת סוסים חיים בסביבת עדר, מקרוב המדמה את סביבתם הטבעית. דיור 2 מעורבות סוסים חיים ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ניתוח corticosterone צואה מספק אמצעי להערכת דפוסים לטווח ארוך של פעילות כליה בסוסים. האופי הלא-פולשני של השיטה מתגבר על תופעות בלבול של שיטות דגימה אחרות המשמשות כדי להעריך את פעילות כליה כוללים ניתוח רוק פלזמה 9. בנוסף הטכניקה יש יתרון לא פולשנית ברורה אם לומדים סוסי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Corticosterone antibody & HRP kitCoralie Munro - UC DavisNo longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kitCoralie Munro - UC DavisNo longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormoneSigma Aldrich50-23-7Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormoneSigma Aldrich15087-01-1Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
MethanolSigma Aldrich67-56-1Irritant. Use in fume cupboard
Sodium BicarbonateSigma Aldrich144-55-8Irritant
Sodium Carbonate AnhydrousSigma Aldrich497-19-8Irritant
Sodium Phosphate DibasicSigma Aldrich7558-79-4Irritant
Sodium Phosphate MonobasicSigma Aldrich10049-21-5Irritant
BSASigma Aldrich9048-46-8Irritant
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5Irritant
Citric AcidSigma Aldrich77-92-9Irritant
ABTSSigma Aldrich30931-67-0Irritant
Hydrogen Peroxide 30%Sigma Aldrich7722-84-1Irritant
Sodium ChlorideSigma Aldrich7647-14-5Irritant
Buffer capsules - pH 4VWR332732B
Buffer capsules - pH 7VWR332742D
Buffer capsules - pH 10VWR332762H
Hydrochloric AcidSigma Aldrich435570Irritant. Use in fume cupboard
Sodium HydroxideSigma AldrichS5881Irritant
Analytical balanceFisher ScientificBFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinetVWR649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrerVWR640-282
Microplate readerVWR
Microplate washerVWR
pH meterVWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2VWR
Pipette - 1,000 µlVWR
Pipette - 200 µlVWR
Pipette - 20 µlVWR
Repeater pipetteVWR
Pipette fillerVWR
Orbital shakerProgen Scientific
SonicatorHilsonic
VortexVWR
Warm water bath
Water purification systemMillipore

References

  1. Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
  2. Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals? Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
  3. Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
  4. Nelson, R. J. An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , Sinaur associates Inc. Ohio, USA. 670-671 (2005).
  5. Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
  6. Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
  7. Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
  8. Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
  9. Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
  10. Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
  11. Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
  12. Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
  13. Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
  14. Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
  15. Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
  16. Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
  17. Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
  18. Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
  19. Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
  20. Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
  21. Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

110corticosteroneimmunoassay

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved