Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Resumen

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Resumen

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Introducción

Los objetivos método descrito para analizar las concentraciones de corticosterona en las heces de equino con el fin de proporcionar una evaluación no invasiva de la actividad suprarrenal. La medición de la actividad (HPA) eje hipotálamo-hipofisario-suprarrenal es un método aceptado para estudiar la respuesta a situaciones potencialmente aversivas en ambas especies en cautividad y domésticas. La técnica de referencia y el método más ampliamente utilizado es el uso de plasma de la sangre ¹ Sin embargo, los métodos alternativos tales como el análisis fecal se han desarrollado con el fin de superar el estrés inducido por el muestreo de sangre en sí y permitir la capacidad de seguimiento de las especies que van libres.

Durante una situación aversiva, la homeostasis fisiológica se altera. El hipotálamo en el cerebro libera hormona liberadora de corticotropina (CRH) que actúa sobre la glándula pituitaria anterior y estimula la liberación de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH). ACTH entra en el torrente sanguíneo y estimula la corteza adrenal para secretar especieS glucocorticoides específicos (GC). Los glucocorticoides están estrechamente vinculados a los acontecimientos estresantes en lugar de ser producido constantemente en todos los estados elevados de energía, por lo tanto a menudo se miden en preferencia sobre otras hormonas de estrés ligado ^2. Los glucocorticoides son responsables de varios efectos adaptativos en caballos. La energía se movilizó rápidamente desde los lugares de almacenamiento en el cuerpo en forma de ácidos grasos y glucosa, el consumo de oxígeno se incrementa, la función sensorial se potencia ³ y el flujo sanguíneo se reduce a las zonas no necesarias para el movimiento ^4. Además de actuar como mecanismo de defensa, el aumento inducido por el estrés de glucocorticoides también puede ayudar a preparar a los animales para el siguiente factor de estrés ^5.

La evaluación de los niveles de hormonas en el plasma y saliva implica la medición de la hormona circulante actual, sin embargo, la medición de los metabolitos en las medidas de heces el producto final metabólico de la hormona. esteroides circulantes son catabolizados en el liver antes de su excreción en la bilis a la donde se someten a cambios adicionales facilitadas por las actividades enzimáticas de la flora bacteriana en el tracto intestinal ^6. Por lo tanto, los inmunoensayos dirigidos a los glucocorticoides en la sangre no pueden ser adecuados para el análisis de los metabolitos de glucocorticoides fecales ^7.

Como recogida fecal puede llevar a cabo sin perturbación para el caballo, el análisis de heces para la corticosterona, se ha utilizado ampliamente para controlar la actividad HPA en un número de circunstancias. Corticosterona elevada en las heces de los caballos ha sido reportada en respuesta a situaciones potencialmente aversivos incluso durante el tratamiento veterinario postoperatorio ⁸ y ⁹ en la vivienda restrictiva. Toma de muestras fecales refleja un nivel de glucocorticoides combinado con el tiempo en lugar de en el punto de muestreo en tiempo ofrecido por el plasma y la saliva por lo que es apropiado para el seguimiento a largo plazo, crónica o patrones estacionales ^10. Debido a la no invasivanaturaleza del método, las muestras se pueden recoger en varias ocasiones para un individuo sin la necesidad para la captura o la restricción ^11. Sin embargo, las especies de tiempo específico de tránsito intestinal se debe tener en cuenta al planificar un protocolo de muestreo. En los caballos, tiempo de tránsito intestinal es de alrededor de 18 hr ^12, por lo tanto, la respuesta adrenal y posteriores metabolitos de corticosterona se pueden detectar en las heces un día después de la activación inicial del eje HPA.

Cuando se utilizan técnicas de inmunoensayo no invasivos una validación cuidadosa de la especie objeto de la investigación es esencial ^13. Además, las diferencias de sexo en la hormona de excreción de los metabolitos se han reportado probablemente debido a las diferencias en la tasa metabólica y el tipo de metabolito excretado corticosterona en diversas especies, incluyendo ratones ^{14, 15} y pollos. Por ello es importante como parte de este método que el ensayo fue validado para su uso tanto en los caballos domésticos masculinos y femeninos como se detalla en la THprotocolo de correo. Esta diferencia en el metabolismo de las hormonas entre los géneros tiene consecuencias para la calidad de los datos, sin embargo, rara vez se aborda y se incluye como parte de la validación de un ensayo.

Este método no invasivo permite una evaluación a largo plazo de la actividad suprarrenal en los caballos domésticos. Los detalles del protocolo tanto en la validación del ensayo y de la técnica de ensayo en sí.

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Protocolo

Ética declaración: los procedimientos que implican temas de muestreo de campo y animales han sido aprobados por la Escuela de animal, Rural y Ciencias Ambientales (ARES) en la Universidad de Nottingham Trent.

1. Recolección de muestras fecales

NOTA: Se deben usar guantes al manipular muestras fecales y metanol. Si existe una fuerte sospecha de que un animal podría estar sufriendo de una enfermedad zoonótica, ropa protectora, como también se debe usar una bata de laboratorio.

1. Recoger las muestras fecales tan pronto como sea posible (dentro de unos pocos minutos a una hora) después de la defecación y colocarlos en una bolsa de muestra. Tomar de tres a cinco submuestras de cualquier muestra defecado con un peso total de aproximadamente 10 g. Etiquetar la bolsa con la hora y fecha de recolección, identificación individual, y congelar la muestra a -20 ° C hasta su análisis.
2. Para minimizar el error, congelar las muestras a -20 ° C hasta que el estudio se complete a continuación, recoger las muestras para el análisis en conjunto como un solo lote.

2. Extracción de la hormona fecal

1. Deje las muestras fecales que se descongele a temperatura ambiente.
2. Asegúrese de que las muestras se homogeneizaron mezclando manualmente cada muestra en su propia bolsa de muestra.
3. Para cada muestra pesan 0.50 (± 0.003 g) de material fecal en una microbalanza en un barco pesan a continuación, transferir las heces a un vial de vidrio de 8 ml. Use un nuevo barco pesan para cada muestra y limpiar las pinzas con metanol al 30% entre cada muestra.
4. Combinar el 0,5 g de materia fecal con 5 ml de metanol al 90%: agua, y agitar O / N en un agitador orbital a temperatura ambiente.
5. A la mañana siguiente, la muestra Vortex y centrifugar durante 20 minutos a 600 g.
6. Se decanta la fracción de metanol en un tubo de vidrio de 16 x 125 mm ² y colocar en un estante en un baño de agua a una temperatura de 37 ° C. Se evapora a sequedad del aire en una campana de humos. Enjuague el vial de extracción y colocarlo el sedimento fecal restante en una bolsa de residuos clínicos para su eliminación.
7. Vuelva a suspender los extractos fecales en 100%, 1 ml de metanol y transferir a un tubo de polipropileno de 12 x 75 mm ^2. Inmediatamente la tapa y se almacena a -20 ° C hasta su análisis.

3. Análisis Hormonal

1. Llevar a cabo el análisis con un inmunoensayo ligado a enzimas (EIA) utilizando antisuero policlonal corticosterona CJM006.
   NOTA:. Un segundo EIA fue probado (cortisol R4866 antisuero, pero esto no logró alcanzar la etapa de validación bioquímica (ver sección 4.1) El antisuero policlonal corticosterona CJM006 y antisuero cortisol R4866 y el respectivo HRP de son suministrados por CJ Munro, Universidad de California, Davis, CA.
2. Diluir el antisuero a 1: 15.000 en tampón de revestimiento (0,05 M NaHCO3, pH 9,6) usando una pipeta repetitiva y una punta de pipeta 50 l, cargar una placa de microtitulación de 96 pocillos con 50 l / pocillo. Cubrir la placa con un sellador de placas e incubar O / N a 4 ° C. Dejar dos pozos no recubiertos para representar los pozos de unión no específica (NSB).
3. Inmediatamente antes de su uso lavar las placas de microtitulación cinco veces usando un lavador de placas de microtitulación automático (solución de lavado; 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
4. Cargar las placas con 50 l por pocillo para la NSB de y pozos [tampón EIA (0,1 M NaPO _4, 0,149 M NaCl, 0,1% de albúmina de suero bovino, pH 7,0) solamente] "cero", estándares (corticosterona, 3,9 - 1.000 pg / así) o extraer muestras fecales (diluido apropiadamente a las 1:20 tampón EIA, ver sección 4.1). Normas y ceros deben ser manejados por triplicado y cuadruplicado, respectivamente. Diluidas extraer muestras fecales y de NSB deben analizar por duplicado.
5. Siga este inmediatamente con la adición de 50 l / pocillo de la etiqueta de rábano picante ^ᵻ conjugada con peroxidasa, diluida en tampón EIA a 1: 70.000.
6. Se incuban las placas de microtitulación en la oscuridad durante 2 horas a RT.
7. Lavar las placas de microtitulación con solución de lavado 5 veces y se incuban las placas a temperatura ambiente en la oscuridad con 100 l / well de RT sustrato [0,4 mM de 2,2'-azino-di- sal (3-etilbenzotiazolina sulfónico) diamonio, 1,6 mM H ₂ O _2, 0,05 M citrato, pH 4,0]. Preparar el sustrato inmediatamente antes del uso.
8. Use un espectrofotómetro a una longitud de onda de 405 nm para leer las placas de microtitulación. La incubación de las placas se considera completa cuando la densidad óptica de los pocillos cero llega a 0,8 a 1,0.
9. Para asegurar la repetibilidad, utilizar los controles [normas EIA o una muestra biológica diluidas en tampón de EIA para unirse a aproximadamente 30% (estándar EIA), 50% (una muestra biológica, por ejemplo, la piscina de caballo doméstico extracto fecal) y 70% (estándar EIA) ] para demostrar una intra e inter-ensayo coeficientes de variación de <10% y <15%, respectivamente.

4. Enzyme Linked-inmunoensayo: Validación para la especie estudio y sexo

1. Validación bioquímica (paralelismo)
   1. Utilizando tampón EIA, lleve a cabo una dilución en serie en agrupada fecal adicionalct, lo ideal es tomado de muestras de alta y baja concentración de la hormona sospechosos de varios individuos (rango: aseado, 1: 2 a 1: 8192) y se ejecutan en el EIA como se describe en la sección 3.
      NOTA: Un paralelismo se considera logra cuando las diluciones en serie de los extractos fecales producen una curva de desplazamiento paralelo a los resultados curva y lineal de regresión estándar demuestran R2> 0,90, una pendiente> 0,50 y p <0,05. El extracto fecal diluida en serie que se une a alrededor del 50% en la curva estándar se debe considerar la dilución ideal para ejecutar todos los extractos fecales (por ejemplo, 1:20). No hay interferencia en el ensayo considerado cuando los resultados de regresión lineal demuestran R2> 0,90 y p <0,05.
2. Validación bioquímica (Interferencia)
   1. Pico de 200 l de los estándares diluidos en serie (cero, de 3,9 a 1000 ng / pocillo corticosterona) con 200 l de extracto fecal diluidas adecuadamente agrupada [diluida en el 50% de la unión determinada por Parallelism (1:20)] y se ejecutan en el EIA como en la sección 3. Tras gráfico de análisis EIA, la concentración observada menos el fondo (concentración de la muestra cero) frente a la concentración esperada.
      NOTA: Si la adición de extracto fecal diluida agrupado a las normas no altera significativamente la cantidad esperada y lineales resultados de la regresión produce ^R2> 0,90, una pendiente cercana a 1,0 y p <0,05. se ha logrado ninguna interferencia con la EIA.
3. Validación biológica:
   NOTA: Una demostración de que la EIA elegido tiene la capacidad de medir los cambios de importancia biológica de la hormona de interés [por ejemplo, el aumento de las concentraciones de glucocorticoides siguientes farmacológico (ACTH es a menudo un procedimiento de licencia) o un desafío biológico (por ejemplo, psicológica y / o ambiental; más probable que sea un evento no regulada oportunista)].
   1. Seleccionar, extraer y analizar muestras fecales de las concentraciones de metabolitos de glucocorticoidesmediante el proceso detallado en las secciones 1 a 3 antes y después de un evento desafiante.
      NOTA: Un desafiante evento será especies específicas. Un procedimiento de ejemplo se proporciona a continuación para el caballo doméstico. Ejemplos completos de eventos desafiantes para los caballos han sido publicados anteriormente incluyendo el uso de gestión ⁹ y procedimientos de cría de ^16. Un aumento significativo en las concentraciones de metabolitos de glucocorticoides después del evento desafiante debe ser observado y confirmado mediante análisis estadístico. Esto debe incorporar en su caso, el efecto de las medidas repetidas, fecha de la muestra e individuales. Se consideró entonces logra la validación biológica.

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Resultados

caballos domésticos (n = 16, 8 yeguas, 8 castrados) con una edad media de 15 años (± 3) se agruparon de acuerdo con el género y se sometió a cuatro diseños de las viviendas con el aumento de los niveles de aislamiento social (n = 4 caballos / tratamiento). 1 vivienda involucrada caballos que viven en un ambiente de la manada, que simula estrechamente su hábitat natural. Viviendas 2 involucrada caballos que viven en parejas en un granero de interior. Viviendas de 3 caballos que par...

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Discusión

análisis corticosterona fecal proporciona un medio de evaluar los patrones de largo plazo de la actividad suprarrenal en los caballos. La naturaleza no invasiva del método supera los efectos de confusión de otros métodos de muestreo utilizados para evaluar la actividad suprarrenal incluyendo la saliva y el plasma análisis ^9. Además, la técnica tiene una clara ventaja no invasivo si el estudio de los caballos que van libres.

Hay varios puntos clave para discutir con respecto...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore