Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Riepilogo

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Abstract

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Introduzione

Gli obiettivi metodo descritto per analizzare le concentrazioni di corticosterone nelle feci equine per fornire una valutazione non invasiva dell'attività surrenale. Misurazione dell'attività (HPA) dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene è un approccio accettato di studiare la risposta a situazioni potenzialmente avversi in entrambe le specie in cattività e nazionali. La tecnica di riferimento e il metodo più diffuso è l'uso di plasma sanguigno ¹ Tuttavia, metodi alternativi come l'analisi fecale sono state sviluppate per superare lo stress indotto mediante campionamento sangue stesso e permettere la possibilità di monitorare le specie che vanno.

Durante una situazione di avversione, l'omeostasi fisiologica è interrotta. L'ipotalamo nel cervello rilascia ormone di rilascio della corticotropina (CRH), che agisce sulla ghiandola pituitaria anteriore e stimola il rilascio di ormone adrenocorticotropo (ACTH). ACTH entra nel flusso sanguigno e stimola la corteccia surrenale a secernere species glucocorticoidi specifici (GC). I glucocorticoidi sono strettamente legate ad eventi stressanti piuttosto che essere prodotta in modo coerente in tutti gli stati di energia accresciuta quindi sono spesso misurati in preferenza rispetto ad altri di stress legato ormoni ^2. I glucocorticoidi sono responsabile di diversi effetti di adattamento nei cavalli. Energia viene rapidamente mobilizzato da siti di stoccaggio nel corpo sotto forma di acidi grassi e glucosio, assunzione di ossigeno viene aumentata, funzione sensoriale è migliorata ³ e il flusso di sangue è diminuita ad aree non necessarie per il movimento ^4. Così come in qualità di un meccanismo di coping, l'aumento indotto stress nella glucocorticoidi può anche aiutare a preparare l'animale per il prossimo ⁵ fattore di stress.

Valutare livelli dell'ormone nel plasma e nella saliva coinvolge misurare l'ormone effettivo circolante Tuttavia, misurando i metaboliti nelle misure feci il prodotto finale del metabolismo dell'ormone. steroidi circolanti sono catabolizzati nella liver prima di escrezione della bile dove subiscono ulteriori modifiche facilitati dalle attività enzimatiche della flora batterica intestinale all'interno della traccia ^6. Pertanto, saggi immunologici diretti verso glucocorticoidi nel sangue può non essere adatto per l'analisi dei metaboliti fecali glucocorticoidi ^7.

Come raccolta fecale può essere effettuata con nessun disturbo al cavallo, analisi delle feci per corticosterone, è stato ampiamente utilizzato per monitorare l'attività HPA in una serie di circostanze. Corticosterone elevata nelle feci dei cavalli è stata riportata in risposta a situazioni potenzialmente avversi anche durante post-operatorio trattamento veterinario ⁸ e nelle abitazioni restrittiva ^9. Campionamento fecale riflette un livello di glucocorticoide pool nel corso del tempo, piuttosto che il punto di campionamento in tempo offerto dal plasma e la saliva che lo rende adatto per il monitoraggio a lungo termine, cronica o modelli stagionali ^10. A causa della non-invasivanatura del metodo, i campioni possono essere ritirati ripetutamente per un individuo senza la necessità di cattura o di ritenuta ^11. Tuttavia, specie specifica il tempo di transito intestinale deve essere preso in considerazione quando si pianifica un protocollo di campionamento. Nei cavalli, il tempo di transito intestinale è di circa 18 ore ¹² Pertanto, la risposta surrenale e successive metaboliti corticosterone possono essere rilevati nelle feci un giorno dopo attivazione iniziale dell'asse HPA.

Quando utilizzando tecniche non invasive immunodosaggio una validazione accurata per le specie oggetto di indagine è essenziale ^13. Inoltre, le differenze di sesso ormone metaboliti sono stati segnalati probabilmente a causa di differenze nel tasso metabolico e il tipo di metabolita corticosterone escreto nelle varie specie, tra cui topi, ¹⁴ e polli ^15. Era quindi importante nell'ambito di questo metodo che il test è stato convalidato per l'uso in maschi e femmine cavalli domestici come dettagliato in the protocollo. Questa differenza nel metabolismo ormonale tra i generi ha conseguenze per la qualità dei dati eppure raramente si rivolge e incluso come parte di convalida del test.

Questo metodo non invasivo consente la valutazione a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli domestici. I dettagli del protocollo sia la validazione del test e la tecnica di analisi in sé.

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Protocollo

Etica dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti campo di campionamento e di animali sono stati approvati dalla Scuola di animali, rurale e Scienze Ambientali (ARES) alla Nottingham Trent University.

1. Raccolta di campioni di feci

NOTA: I guanti devono essere indossati durante la manipolazione dei campioni fecali e metanolo. Se c'è un forte sospetto che un animale possa essere affetto da una zoonosi, indumenti protettivi, come un camice da laboratorio dovrebbe essere indossati.

1. Raccogliere i campioni fecali appena possibile (entro min a qualche ora) dopo la defecazione e metterli in un sacchetto di campionamento. Prendere tre a cinque sotto-campioni di qualsiasi campione defecato con un peso totale di circa 10 g. Etichettare il sacchetto con l'ora e la data di raccolta, ID individuale, e congelare il campione a -20 ° C fino al momento dell'analisi.
2. Per ridurre al minimo errore, congelare tutti i campioni a -20 ° C fino a quando lo studio è completo quindi di raccogliere i campioni insieme per l'analisi in un unico lotto.

2. fecale Hormone Estrazione

1. Lasciare i campioni di feci per scongelare a temperatura ambiente.
2. Assicurarsi che i campioni sono omogeneizzati miscelando manualmente ogni campione nel proprio sacchetto di campionamento.
3. Per ogni campione pesa 0.50 (± 0,003 g) di materiale fecale su una microbilancia in una barca pesare poi trasferire le feci in una fiala di vetro 8 ml. Utilizzare una nuova barca pesare per ogni campione e pulire le pinzette con il 30% di metanolo tra ogni campione.
4. Unire la 0,5 g di materiale fecale con 5 ml di metanolo al 90%: acqua e agitare O / N in un agitatore orbitale a RT.
5. La mattina seguente, Vortex il campione e quindi si centrifuga per 20 minuti a 600 g.
6. Decantare la frazione di metanolo in un tubo di vetro 16 x 125 mm ² e posto in un rack in un bagnomaria regolato ad una temperatura di 37 ° C. Portare a secco con aria sotto cappa. Sciacquare la fiala di estrazione e posizionare il pellet fecale rimanente in un sacchetto di rifiuti clinici per lo smaltimento.
7. Risospendere gli estratti fecali in 100%, 1 ml di metanolo e trasferire in una provetta di polipropilene da 12 x 75 mm ^2. Immediatamente tappo e conservare a -20 ° C fino al momento dell'analisi.

3. Analisi Hormone

1. Effettuare l'analisi con un collegato-immuno-enzimatico (EIA) utilizzando antisiero policlonale corticosterone CJM006.
   NOTA:. Un secondo EIA è stato testato (cortisolo R4866 antisiero, ma questo non è riuscito a raggiungere la fase di validazione biochimica (vedere paragrafo 4.1) L'antisiero policlonale corticosterone CJM006 e cortisolo R4866 antisiero e la rispettiva HRP del sono forniti da CJ Munro, University of California, Davis, CA.
2. Diluire l'antisiero a 1: 15.000 in tampone di rivestimento (0,05 M NaHCO3, pH 9.6) con una pipetta ripetitiva e un puntale 50 microlitri, caricare una micropiastra a 96 pozzetti con 50 microlitri / bene. Coprire la piastra con un sigillante ed incubare O / N a 4 ° C. Lascia due pozzi non rivestiti per rappresentare i pozzi legame non specifico (NSB).
3. Immediatamente prima dell'uso lavare i piatti microtitolazione cinque volte utilizzando un lavatore micropiastra automatizzato (soluzione di lavaggio; 0,15 M di NaCl, 0,05% di Tween 20).
4. Caricare le piastre con 50 microlitri per bene per la NSB di e pozzi [tampone EIA (0,1 M NaPO _4, 0,149 M di NaCl, 0,1% di albumina sierica bovina, pH 7,0) soltanto] 'zero', standard (corticosterone, 3.9 - 1000 pg / bene) o campioni fecali estratto (opportunamente diluiti a 1:20 tampone EIA, vedere paragrafo 4.1). Norme e zeri devono essere eseguiti in triplice copia e quadruplice, rispettivamente. Diluito campioni estratto fecale e NSB di dovrebbero essere eseguiti in duplicato.
5. Seguire questa immediatamente con l'aggiunta di 50 ml / pozzetto dell'etichetta perossidasi coniugato ^ᵻ diluito in tampone EIA a 1: 70.000.
6. Incubare le piastre microtitolazione al buio per 2 ore a temperatura ambiente.
7. Lavare le piastre microtitolazione con soluzione di lavaggio 5 volte e incubare le piastre a RT al buio con 100 l / well di RT substrato [0,4 mM 2,2'-Azino-di- (3-ethylbenzthiazoline solfonico) sale diammonico, 1.6 mM H ₂ O _2, 0,05 M citrato, pH 4,0]. Preparare il substrato immediatamente prima dell'uso.
8. Utilizzare un Spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 405 nm per leggere le piastre di microtitolazione. L'incubazione delle piastre è considerata completa quando la densità ottica dei pozzetti di zero raggiunge da 0,8 o 1,0.
9. Per assicurare la ripetibilità, utilizzare i controlli [standard EIA o un campione biologico diluiti in tampone EIA di consolidare a circa il 30% (standard EIA), il 50% (un campione per esempio biologica, pool di cavallo domestico estratto fecale) e il 70% (standard EIA) ] a dimostrare un intra e inter-assay coefficienti di variazione di <10% e <15%, rispettivamente.

4. Enzyme Linked-immunologico: convalida per la specie di studio e sesso

1. Biochimica Validation (parallelismo)
   1. Utilizzando tampone EIA, eseguire una diluizione seriale del pool fecale in piùct, idealmente preso da presunti campioni di alta e bassa concentrazione di ormoni da diversi individui (range: pulito, 1: 2 a 1: 8192) ed eseguire sulla VIA, come descritto nella sezione 3.
      NOTA: Un parallelismo si considera raggiunto quando le diluizioni seriali di estratti fecali producono una curva spostamento parallelo ai risultati della curva e di regressione lineare standard di dimostrare R2> 0,90, una pendenza> 0,50 e p <0.05. L'estratto fecale diluito seriale che lega circa il 50% sulla curva standard dovrebbe essere considerata la diluizione ideale per eseguire tutti gli estratti fecali (ad esempio, 1:20). Non vi è alcuna interferenza considerato sul test quando i risultati di regressione lineare dimostrano R2> 0,90 e p <0.05.
2. Biochimica Validation (Interference)
   1. Spike 200 ml di standard diluite in serie (zero, 3.9 a 1000 ng / pozzetto corticosterone) con 200 ml di estratto fecale opportunamente diluito in pool [diluito al 50% legame determinati da Parallelism (1:20)] ed eseguire sulla VIA, come al punto 3. A seguito di trama analisi EIA la concentrazione osservata meno il fondo (concentrazione del campione zero) rispetto alla concentrazione prevista.
      NOTA: se l'aggiunta di estratto fecale pool diluito per gli standard non altera in modo significativo la quantità prevista e lineari risultati della regressione produce R ^2> 0,90, un pendio vicino al 1.0 e p <0.05. Nessuna interferenza con l'EIA è stato raggiunto.
3. Validazione biologica:
   NOTA: Una dimostrazione che la VIA scelta ha la capacità di misurare le variazioni biologicamente rilevanti di ormone di interesse [ad esempio, l'aumento delle concentrazioni di glucocorticoidi a seguito di un farmacologica (ACTH è spesso una procedura di licenza) o una sfida biologica (ad esempio, psicologica e / o ambientale; più probabile che sia un evento non regolamentata opportunistica)].
   1. Selezionare, estrarre e analizzare i campioni di feci per le concentrazioni del metabolita glucocorticoidiutilizzando il processo descritto nelle sezioni 1 - 3 prima e dopo un evento impegnativo.
      NOTA: Un evento impegnativo sarà determinate specie. Un metodo esempio è riportato qui sotto cavallo domestico. Esempi di eventi impegnativi per i cavalli sono stati pubblicati in precedenza compreso l'uso di gestione ⁹ e allevamento procedure ^16. Un aumento significativo della concentrazione di metaboliti glucocorticoidi dopo l'evento impegnativo deve essere osservato e confermato con l'analisi statistica. Questo deve incorporare, se del caso, l'effetto delle misure ripetute, data campione e singoli. validazione biologica è quindi considerato raggiunto.

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Risultati

cavalli domestici (n = 16, 8 cavalle, 8 castroni), con un'età media di 15 anni (± 3) sono stati raggruppati in base al sesso e sottoposti a quattro disegni abitative con crescenti livelli di isolamento sociale (n = 4 cavallo / trattamento). Housing 1 coinvolti cavalli che vivono in un ambiente mandria, simulando attentamente il loro habitat naturale. Housing 2 coinvolti cavalli che vivono in coppie in una stalla coperta. Housing 3 cavalli coinvolti alloggiati solo nelle stalle, ma ...

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Discussione

Analisi corticosterone fecale fornisce un mezzo per valutare i modelli a lungo termine di attività surrenalica nei cavalli. La natura non invasiva del metodo supera gli effetti confondenti di altri metodi di campionamento utilizzati per valutare l'attività del surrene tra cui saliva e nel plasma analisi ^9. Inoltre la tecnica ha un vantaggio non invasivo chiaro se lo studio cavalli liberi che vanno.

Ci sono diversi punti chiave da discutere riguardo a questo metodo e il suo u...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corticosterone antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Cortisol antibody & HRP kit	Coralie Munro - UC Davis		No longer available through UC Davis - please see Arbor Assays
Corticosterone synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	50-23-7	Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Cortisol synthetic standard hormone	Sigma Aldrich	15087-01-1	Harmful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard
Methanol	Sigma Aldrich	67-56-1	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	144-55-8	Irritant
Sodium Carbonate Anhydrous	Sigma Aldrich	497-19-8	Irritant
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4	Irritant
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma Aldrich	10049-21-5	Irritant
BSA	Sigma Aldrich	9048-46-8	Irritant
Tween 20	Sigma Aldrich	9005-64-5	Irritant
Citric Acid	Sigma Aldrich	77-92-9	Irritant
ABTS	Sigma Aldrich	30931-67-0	Irritant
Hydrogen Peroxide 30%	Sigma Aldrich	7722-84-1	Irritant
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	7647-14-5	Irritant
Buffer capsules - pH 4	VWR	332732B
Buffer capsules - pH 7	VWR	332742D
Buffer capsules - pH 10	VWR	332762H
Hydrochloric Acid	Sigma Aldrich	435570	Irritant. Use in fume cupboard
Sodium Hydroxide	Sigma Aldrich	S5881	Irritant
Analytical balance	Fisher Scientific	BFS-525-010A
Air compressor
Centrifuge
Computer +printer
fridge-freezer
Drying apparatus
+tubing
Flammable liquid storagecabinet	VWR	649-002
Fume cupboard
Hot-plate stirrer	VWR	640-282
Microplate reader	VWR
Microplate washer	VWR
pH meter	VWR
Eppendorf Research® pipettes - multipack option 2	VWR
Pipette - 1,000 µl	VWR
Pipette - 200 µl	VWR
Pipette - 20 µl	VWR
Repeater pipette	VWR
Pipette filler	VWR
Orbital shaker	Progen Scientific
Sonicator	Hilsonic
Vortex	VWR
Warm water bath
Water purification system	Millipore