العزلة و<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; ثقافة Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; خلايا T γδ، وهو Extrathymic αβT خلايا السلف

Summary

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

الغدة الصعترية، الجهاز الرئيسي لتوليد αβ T الخلايا والعمود الفقري للنظام المناعي التكيفي في الفقاريات، منذ فترة طويلة تعتبر المصدر الوحيد للخلايا αβT. ومع ذلك، وارتداد الغدة الصعترية يبدأ في وقت مبكر في الحياة مما يؤدي إلى انخفاض شديد في انتاج الخلايا αβT ساذجة في الهامش. ومع ذلك، يمكن حتى المعمرين بناء مناعة ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. تشير الأبحاث الحديثة إلى تطوير خلية αβT extrathymic، لكن فهمنا للمسارات التي يمكن أن تعوض عن فقدان الغدة الصعترية وظيفة لا تزال اولى. خلايا T γδ هي الخلايا الليمفاوية الفطرية التي تشكل فرعية T-الخلية الرئيسية في الأنسجة. نحن المسند في الآونة الأخيرة وظيفة العالقة حتى تأخذ حقها من الآن إلى γδ الخلايا التائية فرعية من خلال إظهار أن الكيان نادرة من CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ خلايا T يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في حالات الالتهابات. هنا، نحن صrovide بروتوكول لعزل هذه السلف من الدم المحيطي وزراعته لاحقة. يتم إثراء خلايا Vδ1 إيجابيا من PBMCs من المانحين البشرية السليمة باستخدام حبات مغناطيسية، تليها الخطوة الثانية التي نحن فيها استهداف جزء نادرة من CD4 ⁺ الخلايا مع مزيد من تقنية وضع العلامات المغناطيسية. القوة المغناطيسية لوضع العلامات الثاني تجاوز واحدة من التسمية المغناطيسية الأولى، وبالتالي تسمح للعزلة إيجابية فعالة، والكمية المحددة للسكان الفائدة. نحن ثم إدخال هذه التقنية والثقافة الشرط المطلوب لاستنساخ وكفاءة توسيع الخلايا والتعرف على الحيوانات المستنسخة الناتجة عن تحليل FACS. وهكذا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنقية والثقافة وفيفو السابقين توسيع CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ خلايا T. هذه المعرفة هي شرط أساسي للدراسات التي تتصل هذا αβT progenitor`s خلية البيولوجيا وبالنسبة لأولئك الذين يهدفون إلى بيئة تطوير متكاملةntify مشغلات الجزيئية التي تشارك في transdifferentiation لها.

Introduction

في الفقاريات، والحصانة التكيفية التي يتمحور في الخلوية وجزء الخلطية الحصانة تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. وتوسط الاعتراف مجموعة واسعة من مولدات المضادات التي كتبها T- hyperpolymorphic وB مستقبلات الخلايا (TCR / BCR)، الذي فيما يتعلق خلايا T يفترض أن تنتج بشكل رئيسي في الغدة الصعترية ^1. بذلك، الجذعية الخلايا المكونة للدم (HSCs)، المشتقة من نخاع العظام، والبذور الغدة الصعترية والتفريق على مراحل محددة جيدا يعطي في النهاية إلى ظهور كل الأنساب الخلايا التائية. الغدة الصعترية الأسلاف بذر هي CD4 ^- وCD8 ^- وبالتالي تشكل غير ناضجة، النفي المزدوج (DN) خلية توتية الكسر. إشارات التوتة المشتقة ثم حمل التزام نسبهم والتمايز إلى أي خلايا T αβ أو γδ. التعبير عن ترتيبها وظيفيا TCR-γ وTCR-δ الجينات سلسلة في DN2 / 3 thymocytes يؤدي إلى جاما δTCR المجمعات، التي تدفع الخلوي تكاثرد تعزيز التمايز إلى خلايا γ δT ^2،3. في المقابل، فإن إعادة ترتيب وظيفية سلسلة TCR-β، التي يمكن أن الزوج مع preTα لبناء preTCR حزب العمال، الحث على إسكات النسخي من سلسلة TCR-γ في thymocytes DN3 وانتقالها إلى CD4 ⁺ CD8 ⁺ نقرا مزدوجا إيجابية thymocytes ⁴ . في هذه المرحلة، إعادة التركيب من سلسلة TCR-α يحدث، وحذف موضع TCR-δ التي يعشعش داخل مكان TCR-α، وبالتالي إلغاء إنتاج وγδTCR في هذه الخلايا لا رجعة فيه ^5-9. ويتم اختيار αβTCRs ترتيبها بعد ذلك لقدرتها على ربط MHC الذاتي ضعيف (اختيار الإيجابية)، والتي قد لا تتجاوز عتبة معينة لتجنب المناعة الذاتية (اختيار السلبية). وفقا لقدرتها على الطبقة MHC ملزم الأول أو الثاني، فإن الخلايا αβT المختارة تتطور إلى واحدة إيجابية CD4 ⁺ أو CD8 ⁺ T الخلايا، والتي الخروج الغدة الصعترية خلايا T ساذجة كما.

ومع ذلك، ارتداد من الغدة الصعترية يبدأ في الحياة مما أدى إلى انخفاض أضعافا مضاعفة الناتج من الخلايا T السذاجة أن يسقط تقريبا بعد سن المراهقة ¹⁰ في وقت مبكر. ومع ذلك، يظل حجم تجمع الخلايا T المستمر طوال الحياة، والتي يمكن تفسيرها إلا في جزء من انتشار التماثل الساكن بعد التوتة الخلايا T وانتشار ذاكرة مناعية طويلة العمر ^11. ونتيجة لذلك، يجب أن يحدث نمو الخلايا T extrathymic. وقد اكتسب البحوث التي أجريت مؤخرا الجذب الكبير الذي تتميز الأسلاف خلية αβT، التي، في extrathymic مواقع أدت إلى αβ وظيفية الخلايا التائية ^12-17. ومع ذلك، ومعرفة تفصيلية حول extrathymic السلائف الخلية αβT التي مستقلة من الغدة الصعترية التمايز إلى خلايا αβT مجزأة مثل الخلفية التي لدينا على الطريق أنها تأخذ بذلك.

حددنا مؤخرا الكيان T-خلية صغيرة من Vδ1 ⁺ خلايا CD4 ⁺ γδT باعتبارها extrathymic αβT خلية prognitor ^18، والتي عندما عزل من الدم المحيطي من المانحين البشرية السليمة يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في بيئة التهابات خفيفة. ومن المثير للاهتمام، وخلافا لانتشار استتبابي من الخلايا T بعد الغدة الصعترية، transdifferentiation من Vδ1 CD4 ⁺ الخلايا يولد مستقبلات الخلايا التائية جديدة، وبالتالي توسيع التنوع ذخيرة، بحيث مستضدات جديدة محتملة يمكن الاعتراف بها ويجوز حماية المضيف ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. وهذا يضيف إلى ليونة من الخلايا T ويضيف مسارا جديدا لذلك محل تقدير بعيدا عن تطوير الخلايا T extrathymic.

العزلة الكمية من مصادر مفاوي، جيل من الحيوانات المستنسخة وحيدة الخلية وتوسعها كفاءة ضرورية لتحقيق الهدف لتحديد تلك العلامات والجزيئات التي تؤدي هذه الخلية αβT precursor`s تطوير extrathymic.

Protocol

بيان أخلاقيات: تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في جامعة توبنغن (المشاريع 38 / 2009B02 و 470 / 2013B02).

1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)

1. خذ 50-100 مل من المتطوعين الأصحاء عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 50 مل تحتوي على 1000 وحدة دولية الهيبارين كبريتات وتمييع الدم 1: 2 مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.2).
2. طبقة بعناية 35 مل من الدم: حل PBS على حل فصل 15 ملليتر دم مثل Biocoll (د = 1.077 جم / مل) في 50 مل المخروطية أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 800 x ج في RT.
   ملاحظة: الفرامل يجب ألا تستخدم.
3. جمع الخلايا من طبقة الليمفاوي مع ماصة وغسل الخلايا مرتين في لا يقل عن 50 مل PBS (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 400 x ج). إزالة طاف بعد الطرد المركزي مع ماصة.
4. ليز المتبقية خلايا الدم الحمراء من خلال تعليق وincubأثناء التشغيل جزء الليمفاوي مع 1-5 مل من محلول العازلة منخفض التوتر لمدة 2-4 دقيقة.
   ملاحظة: مدة التعرض وحجم الناشر عازلة تعتمد على المخزن المؤقت الناشر المستخدمة وعلى كمية من خلايا الدم الحمراء اليسار في جزء اللمفاويات.
5. تمييع الخلايا مع PBS (01:10) وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 12 دقيقة وبعد ذلك و resuspend ويغسل بيليه الخلايا مرة واحدة في 10 مل PBS في 300 x ج لمدة 12 دقيقة.
6. Resuspend والخلايا الليمفاوية في برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا في غرفة الفرز نويباور باستخدام التريبان حل الأزرق.
   ملاحظة: عادة، يتم استلام> 1 × 10 ⁸ الخلايا الليمفاوية من 100 مل ضعت حديثا الدم المحيطي.

2. عزل خلايا T Vδ1

1. خذ <1 × 10 ⁶ الخلايا الليمفاوية المعزولة لFACS الأولية تحديد وتيرة خلايا CD4 T Vδ1.
   ملاحظة: حجم سكان هذا الكيان T-الخلية قد تختلف اختلافا كبيرا بين الأفراد وفقا لحالتهم المناعية. Typicحليف، وحوالي 1٪ من خلايا T هي Vδ1 ⁺ وحوالي 1-5٪ من Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ الخلايا هي.
   1. تمييع الخلايا مع 1 مل FACS العازلة، والذي يتألف من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FCS و 5 ملي EDTA. أجهزة الطرد المركزي في 660 x ج لمدة 2 دقيقة وصب طاف. حجم الجزر حوالي 100 ميكرولتر FACS العازلة كافية لتلطيخ لاحقة. دوامة لفترة وجيزة واحتضان الخلايا مع 5 ميكرولتر FC-حجب الكاشف لمدة 5 دقائق على RT لزيادة خصوصية تلطيخ FACS.
   2. إضافة الاجسام المضادة الإنسان مباشرة إلى الخلايا دون إزالة كاشف الحظر لكرة القدم. تأكد من وصمة عار على الخلايا مع أجسام مضادة ضد Vδ1 (01:50)، CD3 (01:50)، CD4 (1: 200)، CD8 (1: 200) وTCRαβ (01:25). إعداد isotype السيطرة مع isotypes المناعي المقابلة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
   3. غسل الخلايا في 1 مل FACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة، في 660 x ج)، صب supernatant، والشروع في اكتساب FACS في حجم العازلة المتبقية.
2. بلتيز الخلايا (التي لا يتم استخدامها في تحليل FACS) بواسطة الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة. في 300 غرام؛ 8 ° C. إزالة طاف و resuspend الخلية pelletin 60 ميكرولتر MACS العازلة لكل 1 × 10 ⁷ الخلايا. إضافة 20 ميكرولتر حجب التيسير الكاشف لكل 1 × 10 ⁷ الخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. إضافة 10 ميكرولتر FITC مترافق الأجسام المضادة Vδ1 مكافحة الإنسان في 1 × 10 ⁷ الخلايا مباشرة إلى الخلايا. احتضان لمدة 12 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
4. غسل الخلايا باستخدام 14 مل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 غرام؛ 8 ° C). تجاهل طاف تماما وresuspend الخلايا في 80 ميكرولتر MACS العازلة في 1X10 ⁷ الخلايا.
5. يستغرق 1-2 × 10 ^{5 خلايا} وتمييع لهم في 100 ميكرولتر FACS العازلة للتحقق من وضع العلامات من خلال تحليل FACS. وهناك حاجة إلى أي إضافات أخرى لهذه الخطوة. تأكد أن هناك suffiالفرق cient في سطوع لVδ1 ^- والخلايا Vδ1 ^+. إذا لم تكن هذه هي الحالة، كرر الخطوات من 2.3) و 2.4).
6. إضافة 20 ميكرولتر بلي لمكافحة FITC في 1 × 10 ⁷ الخلايا إلى الخلايا المتبقية، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، وغسل الخلايا باستخدام 10 مل على الأقل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 x ج، 8 ° C).
7. أثناء الطرد المركزي، تتوازن العمود المغناطيسي تبرد قبل وضعها في مغنطيس مع MACS 500 ميكرولتر العازلة.
8. resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة (للأرقام الخلية أعلى من 1 × 10 ^8، توسيع نطاق هذا الكتاب وفقا لذلك) وتطبيق خلايا بعناية على العمود. جمع من خلال تدفق تحتوي على Vδ1 ^- الخلايا.
9. غسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر MACS العازلة وجمع من خلال تدفق مرة أخرى في نفس الأنبوب. لاحظ أن الخزان يجب أن تكون فارغة قبل تطبيق عازلة على العمود.
10. إزالة العمود من الجهاز المغناطيسي ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل. تدفق بسرعة العمود مع 1 مل MACS العازلة عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود. جمع شطافة في أنبوب.
    ملاحظة: من أجل الحصول على نقاء> 98٪، فإنه عادة ما يكون من الضروري تكرار الخطوات 2،7-2،9) مع العمود الثاني.
11. التحقق من نقاء الخلايا عن طريق تحليل FACS ¹⁸ مع نفس الفريق الضد كما كان من قبل (انظر 2.1.2) وعدد الخلايا.

3. عزل Vδ1CD4 ⁺ T الخلايا

1. و resuspend 25 ميكرولتر من الخرز CD4 مع دوامة ل> 30 ثانية. تغسل حبات (الحد الأدنى كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة) في 1 مل MACS العازلة في أنبوب 1.5 مل رد فعل عن طريق وضع أنبوب إلى المغناطيس لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف بعناية مع ماصة صغيرة الحجم (200 ميكرولتر) و resuspend الخرز في حجم الأصلي للMACS العازلة.
2. بلتيز Vδ1 خلايا ⁺ (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة. في 300 x ج) ونضح طاف و resuspend كل Vδ1 ⁺ الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة وإضافتها إلى أنبوب يحتوي على حبات. مزيج بقوة واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية مع إمالة ثابتة (على سبيل المثال، في المدورة).
3. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا في مغناطيس لمدة 2 دقيقة. تأكد من عدم وجود أي بقايا في الغطاء.
   ملاحظة: خلايا CD4 ⁺ وربطت حبات مغناطيسية ونعلق على جانب الأنبوب تواجه المغناطيس.
4. فتح بعناية الغطاء مع الحفاظ على أنبوب داخل الجهاز المغناطيسي وجمع طاف التي تحتوي على CD4 ^- Vδ1 ⁺ الخلايا باستخدام ماصة على نطاق صغير. وضع CD4 ^- Vδ1 ⁺ خلايا في أنبوب منفصل ووضع هذا الأنبوب إلى المغناطيس مرة أخرى لتجنب ربما تبقى خلايا CD4 أو حبات من السكان.
   1. غسل CD4 ^- الخلايا في 5 مل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 x ج) لالثانية و resuspend لهم في تركيز 1 × 10 ^{5 خلايا} لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام. CD4 ^- خلايا يمكن زراعتها بسهولة تحت ظروف معينة أقل من (4.2).
5. وضع أنبوب مع أهداف خلية CD4 ⁺ خارج الحقل المغناطيسي للأرض، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة ووضعها مرة أخرى في الجهاز المغناطيسي. كرر الخطوات من 3،3-3،5 مرتين للحصول على نقاء أعلى. إزالة طاف قبل pipetting
6. Resuspend وCD4 ⁺ الخلايا في 100 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة (RPMI 1640، 10٪ FCS، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) وإضافة 10 ميكرولتر من حل فصل حبة. في احتضان RT لمدة 45 دقيقة مع إمالة ثابتة (على سبيل المثال، في المدورة).
7. وضع الخلايا في المغناطيس لمدة 1 دقيقة. جمع بعناية طاف تحتوي على Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ الخلايا الحرة حبة باستخدام ماصة على نطاق صغير.
8. خارج المغناطيس، resuspend والخرز مع وسائل الإعلام الثقافة 100 ميكرولتر وتكرارخطوات 3.6 و 3.7 ضعف للحصول على أرقام الخلية أعلى من خلايا CD4 ^+.
9. بلتيز الخلايا (أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 12 دقيقة) وتجاهل طاف تماما من قبل pipetting. الخلايا resuspend في والإعلام قبل حرارة الطازجة والاعتماد عليها. فحص نقاء Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ الخلايا عن طريق تحليل FACS يصور في الخطوات 2.1.1-2.1.3.

استنساخ 4. وحيدة الخلية التي كتبها المحدودة التخفيف

1. عزل الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) من متبرع خيفي كما هو مبين في 1،1-1،6.
2. أشرق 2.5 × 10 ⁷ PBMCs خيفي مع 80 غراي في 25 مل سائل الإعلام والثقافة باستخدام جاما للإشعاع.
3. إضافة IL-2 (200 U / مل)، IL-7 (20 نانوغرام / مل)، وجمعية المستشفيات الخاصة (2 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا المغذية المشع وتوزيعها في لوحات 96-جيدا U-النموذج، 5 × 10 ⁴ التغذية الخلايا في 50 ميكرولتر لكل بئر.
4. تمييع الخلايا Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ إلى تركيز 0.3 خلايا في 50 ميكرولتر. الماصةالشركة المصرية للاتصالات 50 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل بئر بإيواء الخلايا المعرضة للإشعاع والسيتوكينات.
   ملاحظة: وهكذا، وتضعف السيتوكينات إلى تركيز النهائي من 100 U / مل IL-2، 10 نانوغرام / مل IL-7 و 1 ميكروغرام / مل PHA. احتضان لوحات 96-جيدا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ مرطب الجو.
   1. اختياريا، زراعة المتبقية تنقية Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ الخلايا كثقافة الأكبر في ظل نفس الظروف الثقافة باعتبارها الحيوانات المستنسخة.
5. تزويد خلايا كل 3-4 أيام مع السيتوكينات وسائل الإعلام الجديدة. لهذا، صرف نصف المتوسط ​​في الآبار مع 50 متوسطة جديدة ميكرولتر من قبل pipetting. إضافة تركيز 2 أضعاف السيتوكينات إلى كل مكملات. إضافة 5X10 ⁴ الخلايا المغذية المشع لكل بئر في كل جولة أخرى من التغذية.
6. باستخدام المجهر، ومراقبة الحيوانات المستنسخة الأولى تصبح مرئية بعد 3-4 أسابيع، لأنها استقلاب، وبالتالي تغيير لون المستعمرات مستنبت والشكل.
   ملاحظة: للحصول على الفراءزراعة ذر، resuspend واستنساخ جيدا ونقلها إلى فصل لوحات 96-جيدا. تحليل الخلايا عن طريق FACS كما هو مبين في 2.1.1-2.1.3. استنساخ أبقى في ظل هذه الظروف قد تتغير في نهاية المطاف TCR بهم من Vδ1 إلى αβTCR. النقطة الوقت لهذا transdifferentiation تختلف من استنساخ استنساخ.

النتائج

الشكل 1 يصور المراحل المختلفة ونتائج عزل الخلايا Vδ1 T من الدم المحيطي. ويبين الشكل 1A توزيع نموذجي من Vδ1 ⁺ الخلايا في CD3 ⁺ الخلايا الليمفاوية، فضلا عن التعبير شارك في مستقبلات السكان Vδ1 ^+. في هذا المانحة، وتواتر Vδ1 خلايا ⁺

Discussion

لدراسة النمط الظاهري والبيولوجيا وظيفة من ندرة (T-) كيان الخلية، وهي خلايا CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ T، استخدمنا اثنين علامات: Vδ1 وCD4 لعزل الخلايا المغناطيسية الإيجابية. Vδ1 هو مستقبل الأيتام، في حين يتم التعبير عن CD4 على الخلايا التائية المساعدة، على مستوى أدنى في وحيدات الخل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D