İzolasyon ve<em&gt; Ex Vivo</emVδ1 of&gt; Kültür<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; γδ T hücrelerinin bir Extrathymic αβT hücre Progenitör

Özet

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Özet

Timus, αβ T hücreleri ve omurgalılarda adaptif bağışıklık sisteminin omurgasının oluşturulması için primer organ uzun αβT hücrelerinin tek kaynak olarak kabul edilmiştir. Ancak, timik involüsyon çevresine naif αβT hücrelerinin büyük ölçüde azalır çıkış lider hayatında erken başlıyor. Yine de, hatta asırlık yeni alınan patojenlere karşı bağışıklık inşa edebilirsiniz. Son araştırmalar fonksiyonunun timus kaybını telafi edebilir yolların ancak bizim anlayış hala rudimental olan extrathymic αβT hücre gelişimini göstermektedir. γδ T hücreleri dokularda temel T-hücresi alt kümesi oluşturur doğuştan lenfositlerdir. Biz son zamanlarda göstererek bir γδ T hücre alt kümesine bir şimdiye kadar farkedilmemiş seçkin işlevi atfedilen o CD4 kıt varlık ⁺ Vδ1 ⁺ γδ T hücreleri inflamatuar koşullarda αβT hücrelerin içine transdifferentiate olabilir. Burada, biz pperiferik kandan bu dede izolasyonu ve sonraki ekimi için protokol rovide. Vδ1 hücreleri pozitif bir başka manyetik işaretleme tekniği ile ^CD4 + hücrelerinin az kısmını hedef olup, burada, bir ikinci aşamada, ardından manyetik boncuklar kullanılarak Sağlıklı insan donörlerden bir PBMC'lerden zenginleştirilmiştir. İkinci etiketleme manyetik kuvvet ilk manyetik etiket biri aşıyor ve bu nedenle faiz nüfusunun, verimli nicel ve belirli olumlu izolasyonu sağlar. Daha sonra hücreler, klonlama ve verimli bir şekilde genişletilmesi için ve FACS analizi ile üretilmiştir klonlarının tespiti için gerekli olan teknik ve kültür durum getirmektedir. Böylece, saflaştırma, kültür ^ve CD4 + Vδ1 ⁺ γδ T hücrelerinin ex vivo artışı için detaylı bir protokol sağlar. Bu bilgi, bu αβT hücre progenitor`s biyoloji ile ilgili çalışmalara ve ide amaçlayan olanlar için ön koşuldurBunu transdiferansiyonun yer alan moleküler tetikler ntify.

Giriş

Omurgalılarda, hücresel ve bağışıklığın bir hümoral bölümünde yapılandırılmıştır adaptif bağışıklık patojenlere karşı savunmasında önemli bir rol oynar. Antijenleri geniş bir tanıma, T hücreleri ile ilgili olarak timus ¹ esas olarak üretilecek varsayılır hyperpolymorphic T ve B hücresi reseptörlerinin (TCR / BCR), aracılık eder. Bunun üzerine, kemik iliğinden elde edilen hematopoetik kök hücrelerin (HSC), timus tohum ve nihayet tüm T hücre soyları sebebiyet veren iyi tanımlanmış aşamaları boyunca ayırt. Ve CD8 ^{- -} Thymus ekim atalarıdır CD4 ve böylece olgunlaşmamış, çift negatif (DN) timosit kısmını oluşturmaktadır. Thymus türetilmiş sinyaller daha sonra soy bağlılığı ve αβ veya γδ T hücrelerinin içine ya farklılaşmasını teşvik. DN2 / 3 timositlerde fonksiyonel olarak yeniden düzenlenmiş TCR-γ ve TCR-δ zincir genlerinin sentezlenmesi selüler proliferasyon, bir sürücü δTCR kompleksleri, y olan yol açarγ ¨t hücrelerine ^2,3 içine farklılaşmasını teşvik d. Buna karşılık, bir preTCR pT oluşturmak için preTα eşleştirmeden işlevsel TCR-β zincirinin yeniden düzenlenmesi, transkripsiyon DN3 timositlerde TCR-γ zincirinin susturulması ^ve CD4 + CD8 ^{+ çift} pozitif timositleri ⁴ içine geçiş indükler . Bu aşamada, TCR-α zincirinin rekombinasyon ve böylece, bu hücrelerin geri dönülmez ^5-9 üretim, bir γδTCR ortadan kaldıran, TCR-α lokusundaki sırtını TCR-δ lokusunu silme oluşur. Rearranged αβTCRs sonradan otoimmünitesini (negatif seçim) önlemek için belirli bir eşiği geçemez zayıf (pozitif seçimi) öz-MHC bağlanma yetenekleri için seçilir. MHC sınıf I veya II bağlama kapasitelerine göre, seçilen αβT hücreler tek-pozitif ^CD4 + veya CD8 ^{+ T hücreleri,} timus çıkış naif T hücreleri dönüşür.

Ancak, timus involusyonu erken neredeyse söndürülmüş sonrası ergenlik ¹⁰ naif T hücrelerinin katlanarak azaltılmış çıkış yol açan yaşam başlar. Bununla birlikte, T hücresi havuzunun büyüklüğü sonrası timik homeostatik T hücrelerinin çoğalması ve uzun ömürlü immünolojik bellek ¹¹ proliferasyonu ile sadece kısmen açıklanabilir ömrü boyunca sabit kalır. Sonuç olarak, T-hücresi gelişimi extrathymic gerçekleşmelidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar-de extrathymic fonksiyonel αβ T hücrelerinin ^12-17 yol siteleri-verdi αβT hücre atalarıdır, karakterize önemli cazibe kazanmıştır. Oysa, bir timus bağımsız αβT hücrelerine ayırt extrathymic αβT hücre öncüleri hakkında detaylı bilgi biz onlar böylece almak güzergahı üzerinde olan arka plan olarak bölük pörçük olduğunu.

Biz son zamanlarda Vδ1 ⁺ küçük T-hücre varlık tespit hafif inflamatuar ortamında αβT hücrelerine transdifferentiate sağlıklı insan vericilerden periferal kandan izole edilen bir extrathymic αβT hücre prognitor ¹⁸ olarak ^CD4 + γδT hücreleri. İlginç bir şekilde ve potansiyel olarak yeni antijenler kabul edilebilir, böylece bu şekilde, repertuarı genişleyen çeşitlilik sonrası timik T hücrelerinin proliferasyonu homeostatik, Vδ1 ^CD4 + hücrelerinin transdiferansiyonun yeni T hücre reseptörleri üreten, aksine ve koruma olabilir yeni alınan patojenlere karşı konakçı. Bu T hücrelerinin plastisite ekler ve extrathymic T hücre gelişimi için şimdiye kadar farkedilmemiş yeni yolu ekler.

Amaç bu αβT hücresi extrathymic gelişimini precursor`s tetikleyen işaretleri ve molekülleri tanımlamak için lenfositik kaynaklardan niceliksel izolasyonu, tek hücre klonlarının oluşturulması ve etkin genişletme gereklidir.

Protokol

Etik Beyanı: Tüm işlemler Helsinki Bildirgesi uyarınca yürütüldü ve Tübingen Üniversitesi'nde Klinik Etik Komitesi tarafından kabul edildi (38 / 2009B02 ve 470 / 2013B02 projeler).

Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. izolasyonu (PBMC)

1. 1000 IU heparin sülfat içeren 50 ml'lik şırınga kullanarak venipunktür yoluyla sağlıklı bir gönüllüden 50-100 ml alın ve kan sulandırmak 1: PBS (pH = 7.2) 2.
2. 15 ml kan ayırma çözeltisi üzerine PBS çözeltisi gibi Biocoll olarak (d = 1.077 g / ml), 50 ml konik bir tüp içinde: dikkatlice kan 35 ml katman. Oda sıcaklığında 800 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
   NOT: Fren kullanılmamalıdır.
3. Bir pipet ile lenfositik tabakanın hücreleri toplamak ve en az 50 ml PBS içerisinde iki kez yıkama hücreleri (400 x g'de 12 dakika boyunca santrifüj). Bir pipet ile santrifüj sonra süpernatantı.
4. Lyse askıya alınması ve inkubasyon suretiyle eritrositler kalan2-4 dakika boyunca, bir hipotonik tampon çözeltisi 1-5 ml lenfositik kısmını bir başlatma.
   Not: maruz kalma ve liz tampon maddesi hacmi süresi kullanılan parçalama tamponu ve lenfosit fraksiyonunda kalan kırmızı kan hücrelerinin miktarına bağlıdır.
5. 12 dakika boyunca 250 xg'de PBS (01:10) ile hücreler ve santrifüj seyreltilir ve daha sonra tekrar süspansiyon ve 12 dakika boyunca 300 x g'de 10 ml PBS içinde bir kez hücre pelletini yıkayın.
6. PBS içinde yeniden süspanse lenfositleri ve tripan mavi bir solüsyon kullanımıyla bir Neubauer sayım odası içinde hücreleri sayın.
   NOT: Genellikle,> 1 x 10 ⁸ lenfositler 100 ml alınan taze periferik kan çekilmiş.

Vδ1 T hücreleri 2. İzolasyon

1. Vδ1 CD4 T hücrelerinin frekansı belirleyen bir ilk FACS <1 x 10 ⁶ izole edilen lenfositlerin al.
   NOT: Bu T-hücresi varlığın Nüfus büyüklüğü bireylere ve onların immünolojik durumuna göre arasında büyük farklılık gösterebilir. Typically, T hücrelerin yaklaşık% 1 Vδ1 ⁺ ve Vδ1 ^{+ hücreleri,} yaklaşık% 1-5 olan CD4 ^{+ 'dır.}
   1. PBS,% 2 FCS ve 5 mM EDTA içeren oluşur 1 ml FACS tamponu ile hücreleri seyreltilir. 2 dakika süreyle 660 xg'de Santrifüj ve süpernatant süzün. 100 ul FACS tampon akış hacmi daha sonraki boyama için yeterlidir. Kısaca bir girdap ve 5 ul FACS boyaması etkisi arttığından, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaktifi Fc bloke ile hücrelerin inkübe edin.
   2. Fc bloke edici tepkin madde çıkartılmadan direkt olarak hücrelere insan monoklonal antikor ekleyin. , CD8 (1: 200) ve TCRαβ (01:25): Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (200 1) karşı antikorlar ile hücrelerin leke emin olun. Karşılık gelen immünoglobulin izotipleri ile izotip kontrolü hazırlayın. Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca antikorlar ile inkübe hücreleri.
   3. (2 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 660 xg) 1 ml FACS tampon maddesi içinde hücrelerin yıkayın, Süpernatant, süzünatant ve kalan tampon hacminde FACS edinimi geçin.
2. 12 dakika boyunca santrifüj ile (FACS analizi kullanılmaz) hücreler topaklaşmasına; 300 g; 8 ° C. Süpernatantı ve 1 x 10 ⁷ hücre başına 60 ul MACS-tamponu pelletin hücreyi tekrar süspansiyon. 1 x 10 ⁷ hücre başına 20 ul Fc bloke edici tepkin madde ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
3. Şirketinden hücrelere 1 x 10 ⁷ hücre başına 10 ul FITC-konjüge anti-insan Vδ1 antikor ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'da 12 dakika kuluçkalayın.
4. 14 ml MACS-tamponu kullanılarak hücre yıkayın (12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 300 g, 8 ° C). Tamamen Süpernatant atın ve 1x10 ⁷ hücre başına 80 ul MACS tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon.
5. 1-2 x 10 ⁵ hücre almak ve FACS analizi ile etiketleme doğrulanması için 100 ul FACS tampon maddesi içinde seyreltilmesi. Daha başka katkı maddeleri, bu aşama için ihtiyaç vardır. Bir taşıdıkları risklerle olduğundan emin olunVδ1 için parlaklık cient farkı ^- ve Vδ1 ^{+ hücreler.} Bu durumda değilse, tekrar) 2.3) ve 2.4 adımları tekrarlayın.
6. Geri kalan hücreler 1 x 10 ⁷ hücre başına 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, (300 x g'de, 12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 8 ° C), en az 10 ml MACS tamponu ile yıkama hücreleri.
7. Santrifüj sırasında, 500 ul MACS tamponu ile bir mıknatıs yerleştirilen önceden soğutulmuş bir manyetik sütun dengeye.
8. (Hücre sayıları daha yüksek 1 x 10 ⁸ bu hacim buna göre büyütmek) 500 ul MACS-tampon hücreleri yeniden süspanse ve kolona dikkatle hücreleri geçerlidir. Vδ1 içeren flow-through toplayın ^- hücrelerini.
9. 500 ul MACS tamponu ile sütun üç kez yıkayın ve aynı tüp içinde tekrar flow-through toplamak. Rezervuar kolona tampon uygulamadan önce boş olması gerektiğini unutmayın.
10. Manyetik cihazdan sütun çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Hızlı bir şekilde sıkı bir şekilde sütuna pistonu iterek 1 ml MACS tamponu ile kolonu temizlemek. Bir tüp içinde eluat toplayın.
    NOT:>% 98 bir saflığa elde etmek için, genellikle tekrar için gerekli olan ikinci bir sütun ile) 2.7-2.9 adımları tekrarlayın.
11. (2.1.2 bakınız) eskisi gibi antikor paneli ile FACS analizi ¹⁸ ile hücrelerin saflığını doğrulayın ve hücreleri saymak.

Vδ1CD4 ^{+ T} hücrelerinin 3. İzolasyon

1. > 30 saniye boyunca bir vorteks CD4 boncuk 25 ul yeniden süspanse edin. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirilmesi ile, 1.5 ml reaksiyon tüpünde 1 ml MACS tamponu boncuk (üretici tarafından gösterildiği gibi az miktarda) yıkayın. Küçük ölçekli bir pipet (200 ul) ile dikkatlice süpernatant atın ve MACS-tampon orijinal hacminin boncuk tekrar süspansiyon.
2. 1 için Vδ1 ^{+ hücreleri} (santrifüj topaklaşmasına2 dk; ve) 300 xg'de süpernatant aspirat ve 500 ul MACS-tamponu tüm Vδ1 ⁺ hücreleri tekrar süspansiyon ve boncuk içeren tüp ekleyebilirsiniz. Kuvvetli bir şekilde karıştırın ve (bir rotatör içine örneğin) sabit bir eğimlenme 4 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
3. 2 dakika için bir mıknatıs hücreleri ihtiva eden tüp yerleştirin. Kapaktaki hiçbir kalıntıları olmadığından emin olun.
   Not: ^CD4 + hücreleri manyetik taneler bağlanmış ve mıknatısın bakan tüp yan eklemek olacaktır.
4. Bir küçük ölçekli pipet kullanarak Vδ1 ^{+ hücreler - dikkatle} manyetik cihazın içindeki tüpü tutarak kapağı açın ve CD4 içeren süpernatant toplamak. Ayrı bir tüp içine Vδ1 ⁺ hücreleri ve nüfus CD4 hücreleri veya boncuk kalan muhtemelen önlemek için tekrar cazibe merkezi haline bu tüp yerleştirmek ^- CD4 yerleştirin.
   1. CD4 yıkayın ^- hücreleri, 5 ml MACS tamponu içinde (santrifüj 12 dakika boyunca, 300 xg da) and 100 ul ortam başına 1 x 10 ⁵ hücre konsantrasyonunda bunları tekrar süspansiyon. CD4 ^- hücreler hali hazırda (4.2) aşağıda belirtilen koşullar altında kültive edilebilir.
5. , Manyetik alanın dışında ^CD4 + hücre hedefleri ile tüp koyun 500 ul MACS-tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon ve manyetik cihazın içine geri koydu. Tekrarlayın daha yüksek bir saflık elde etmek için iki kez 3.3-3.5 adımları tekrarlayın. Pipetleme süpernatantı
6. 100 ul kültür ortamı ^CD4 + hücreleri (RPMI 1640,% 10 FCS,% 1 L-glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin) yeniden süspanse edin ve bir boncuk-ayırma çözeltisi 10 ul ekle. Sabit devirme (örneğin, bir rotatör içinde) ile birlikte 45 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
7. 1 dakika süre ile bir mıknatıs hücreleri yerleştirin. Dikkatle küçük ölçekli bir pipet kullanarak boncuk ücretsiz Vδ1 ^{+ CD4} + hücreleri içeren süpernatant toplamak.
8. Mıknatıs dışında, 100 ul kültür ortamı ve tekrar ile boncuklar tekrar süspansiyon^CD4 + hücrelerinin yüksek hücre sayıları elde etmek için iki kez 3.6 ve 3.7 adımları tekrarlayın.
9. Hücreleri pellet'leştirilmesi (12 dakika boyunca, 300 xg'de santrifüj) ve pipetleme tamamen süpernatant atın. Taze, önceden ısıtılmış medya hücrelerin tekrar süspansiyon ve onları saymak. 2.1.1-2.1.3 adımda tasvir, FACS analizi ile Vδ1 ^{+ CD4 + hücrelerinin} saflığı inceleyin.

Sınırlı seyreltme ile 4. Tek hücreli Klonlama

1. 1.1-1.6 tasvir edildiği gibi, bir allojenik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) izole edilir.
2. Γ-ışını kullanılan 25 ml kültür ortamı içinde 80 Gy ile 2.5 x 10 ⁷ allojeneik PBMC'ler ışın tedavisi.
3. , 96 oyuklu U-şekli plakalarında 5 x 10 ⁴ besleyici bunları ışınlanmış besleyici hücreler IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) ve PHA (2 ug / ml) ilave edin ve dağıtma oyuk başına 50 ul hücre.
4. 50 ul başına 0,3 hücre konsantrasyonuna Vδ1 ^{+ CD4 +} hücreleri ile seyreltilir. Pipette her bir oyuğa ışınlanmış hücreleri ve sitokinler barındıran hücre çözeltisi 50 ul.
   NOT: Bu nedenle, sitokinler 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 ve 1 ug / ml PHA nihai konsantrasyona kadar seyreltilir. 37 ° _C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer içinde, bir kuluçka makinesi içinde, 96 gözlü levhalar inkübe edin.
   1. İsteğe bağlı olarak, klonlar aynı kültür koşulları altında dökme kültürü olarak Vδ1 ^{+ CD4 + hücreleri üzerinde} saflaştırılmıştır kalan geliştirin.
5. Sitokinler ve taze medya ile her 3-4 günde hücre kaynağı. Bunun için, pipetleme ile 50 ul taze ortam ile kuyu ortamın değişimi yarısı. Her takviyesine sitokinlerin 2 kat konsantrasyon ekleyin. Beslenme de her tur başına 5x10 ⁴ ışınlanmış besleyici hücreler ekleyin.
6. Kültür ortamı ve form kolonilerinin rengini değiştirmek böylece metabolize olarak, ilk klon 3-4 hafta sonra görünür hale gözlemlemek ve bir mikroskop kullanarak.
   NOT: kürk içinther ekimi, iyi klon tekrar süspansiyon ve bunları, 96 gözlü levhalar ayrı aktarın. 2.1.1-2.1.3 belirtildiği gibi FACS yoluyla hücreleri analiz edin. Bu şartlar altında tutulmuştur klonlar nihayetinde αβTCR için Vδ1 kendi TCR değişebilir. Bu transdiferansiyonun için zaman noktası klonlamak için klon değişir.

Sonuçlar

Şekil 1, farklı aşamaları ve periferal kandan Vδ1 T hücrelerinin izolasyonu sonucunu göstermektedir. Şekil ^1A, CD3 + lenfositler, Vδ1 ^{+ hücrelerinin} tipik dağılımı, hem de Vδ1 ^{+ popülasyonunun} ko-reseptör ifadesini gösterir. Bu donör olarak Vδ1 ^{+ hücreleri} (kırmızı) sıklığı toplam lenfosit sayımları% 2.3 ve Vδ1 ⁺ lenfositlerin CD4 ifadesi (yeşil)% 2.6 olduğunu. Tamamen, izolasyon için hedef nüfusu ...

Tartışmalar

Pozitif manyetik hücre izolasyonu için Vδ1 ve CD4: kıt (T-) hücre varlığın fenotip, biyoloji ve işlevini incelemek için, yani Vδ1 ^{+ CD4} + T hücreleri, iki işaret kullanılır. CD4 monositler ve dendritik hücreler üzerinde daha düşük bir seviyede, T yardımcı hücreleri üzerinde ifade edilen ve hematopoietik progenitör hücreler üzerindeki çok düşük bir seviyede, oysa Vδ1, yetim reseptörüdür.

Yüksek saflıkta hücrelerin zenginleştirilmesi ve seçim ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D