Aislamiento y<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

Resumen

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Resumen

El timo, el órgano principal para la generación de células T delta gamma y columna vertebral del sistema inmune adaptativo en los vertebrados, ha sido considerado como la única fuente de células αβT. Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a una reducción de la producción de manera drástica de las células αβT ingenuos en la periferia. Sin embargo, incluso los centenarios pueden crear inmunidad contra patógenos recién adquiridas. Investigaciones recientes sugieren el desarrollo de células αβT extrathymic, sin embargo, nuestra comprensión de las vías que pueden compensar la pérdida de la función del timo son todavía rudimentario. células γδ T son linfocitos innatas que constituyen la principal subconjunto de células T en los tejidos. Recientemente nos atribuimos una función destacada hasta ahora poco apreciado a un γδ T subconjunto de células al mostrar que la entidad escasa ^de células CD4 + Vδ1 ⁺ γδ células T pueden transdiferenciarse en células αβT en condiciones inflamatorias. En este sentido, provide el protocolo para el aislamiento de este progenitoras de la sangre periférica y su cultivo posterior. Vδ1 células se enriquecen positivamente a partir de PBMCs de donantes humanos sanos, utilizando perlas magnéticas, seguido de una segunda etapa en la que nos dirigimos a la escasa fracción de células ^CD4 + con una técnica de etiquetado magnético más. La fuerza magnética del segundo etiquetado excede el de la primera etiqueta magnética, y por lo tanto permite el aislamiento positivo eficiente, cuantitativa y específica de la población de interés. Se introduce entonces la condición técnica y la cultura requerida para la clonación y eficientemente la expansión de las células y para la identificación de los clones generados por análisis FACS. Por lo tanto, ofrecemos un protocolo detallado para la purificación, la cultura y la expansión ex vivo de delta gamma células T CD4 ⁺ Vδ1 ^+. Este conocimiento es requisito indispensable para los estudios que se relacionan con este αβT progenitor`s celulares biología y para aquellos que pretenden identify los desencadenantes moleculares que intervienen en su transdiferenciación.

Introducción

En los vertebrados, la inmunidad adaptativa que se estructura en el celular y una parte de la inmunidad humoral desempeña un papel importante en la defensa contra patógenos. El reconocimiento de una amplia gama de antígenos está mediada por T- hyperpolymorphic y receptores de células B (TCR / BCR), que con respecto a las células T se supone que se produce principalmente en el timo ^1. A esto, las células madre hematopoyéticas (HSC), derivadas de la médula ósea, el timo semillas y diferenciar a lo largo de las etapas bien definidas, finalmente, que dan lugar a todos los linajes de células T. Thymus progenitores siembra son CD4 ^- y CD8 ^- y por lo tanto constituyen la fracción de timocitos inmaduros, doble negación (DN). Señales derivadas del timo entonces inducen su compromiso linaje y la diferenciación en cualquiera de las células T delta gamma o delta gamma. La expresión de genes funcionalmente reordenados cadena TCR-gamma y TCR-delta en DN2 / 3 timocitos conduce a gamma δTCR complejos, que impulsan una proliferación celulard promover la diferenciación en células DT γ ^2,3. En contraste, el reordenamiento de una cadena TCR-β funcional, que puede emparejarse con preTα para construir un preTCR pT, induce el silenciamiento transcripcional de la cadena TCR-γ en timocitos DN3 y su transición a CD4 ⁺ CD8 ⁺ doble positivas timocitos ⁴ . En esta etapa, la recombinación de la cadena TCR-α se produce, eliminar el locus TCR-δ que está ubicado dentro del locus TCR-α, abrogando así la producción de un γδTCR en estas células irrevocablemente ^5-9. ΑβTCRs reordenados se seleccionan posteriormente por su capacidad para unirse a la auto-MHC débilmente (selección positiva), que no podrá exceder de un cierto umbral para evitar la autoinmunidad (selección negativa). De acuerdo con su capacidad de unión a MHC de clase I o II, las células αβT seleccionados se convierten en células CD4 ⁺ de un solo positivo o T CD8 ^{+, que} salga el timo los linfocitos T como ingenuos.

Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a la producción de forma exponencial reducido de células T ingenuas que es casi extinguido después de la adolescencia ^10. Sin embargo, el tamaño del grupo de células T permanece constante durante toda la vida, lo que se explica sólo en parte por la proliferación homeostática post-timo de las células T y la proliferación de larga vida memoria inmunológica ^11. En consecuencia, debe ocurrir extrathymic desarrollo de las células T. Investigaciones recientes han ganado atractivo importante que caracterizó progenitores de células αβT, que -al extrathymic sitios dieron origen al delta gamma funcional células T ^12-17. Sin embargo, un conocimiento detallado de extrathymic precursores de células αβT que independiente de un timo diferenciarse en células αβT es tan fragmentaria como el fondo que tenemos en la ruta que toman los mismos.

Recientemente hemos identificado la pequeña entidad de células T de Vδ1 ⁺ células CD4 ⁺ γδT como un extrathymic prognitor celular αβT ^18, que cuando se aislaron de sangre periférica de donantes humanos sanos pueden transdiferenciarse en células αβT en un entorno inflamatoria leve. Curiosamente y contrario a la proliferación homeostática de las células T post-tímicos, transdiferenciación de las células Vδ1 ^CD4 + genera nuevos receptores de células T, ampliando así la diversidad repertorio, por lo que potencialmente nuevos antígenos pueden ser reconocidos y puede protección del huésped contra los patógenos recién adquiridas. Esto se suma a la plasticidad de las células T y añade una nueva vía hasta ahora no apreciado para extrathymic desarrollo de células T.

El aislamiento cuantitativa de fuentes linfocítica, la generación de clones de células individuales y su expansión eficiente son esenciales para el objetivo de identificar a los marcadores y moléculas que desencadenan esta célula αβT precursor`s desarrollo extrathymic.

Protocolo

Declaración de Ética: Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Clínica en la Universidad de Tubinga (proyecta 38 / 2009B02 y 470 / 2013B02).

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs)

1. Tome 50-100 ml de un voluntario sano a través de la punción venosa utilizando una jeringa de 50 ml que contiene 1.000 UI de heparina sulfato y diluir la sangre 1: 2 con PBS (pH = 7,2).
2. La capa cuidadosamente 35 ml de la sangre: solución de PBS en solución separando 15 ml de sangre tales como Biocoll (d = 1,077 g / ml) en un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar durante 15 min a 800 xg a TA.
   NOTA: El freno no debe ser utilizado.
3. Recoger las células de la capa linfocítica con una pipeta y se lavan las células dos veces en por lo menos 50 ml de PBS (centrífuga de 12 min; a 400 xg). Eliminar el sobrenadante después de la centrifugación con una pipeta.
4. Lyse restante eritrocitos suspendiendo y incubAting la fracción linfocítica con 1-5 ml de una solución tampón hipotónico durante 2-4 min.
   NOTA: Duración de la exposición y el volumen de tampón de lisis depende del tampón de lisis utilizado y de la cantidad de glóbulos rojos que quedan en la fracción de linfocitos.
5. Diluir las células con PBS (01:10) y se centrifuga a 250 xg durante 12 min y, posteriormente, volver a suspender y se lava el sedimento celular una vez en 10 ml de PBS a 300 xg durante 12 min.
6. Resuspender los linfocitos en PBS y contar las células en una cámara de recuento Neubauer utilizando solución de azul de tripano.
   NOTA: Por lo general,> 1 x 10 ⁸ linfocitos se reciben de 100 ml recién extraída de la sangre periférica.

2. Aislamiento de células T Vδ1

1. Tome <1 x 10 ⁶ linfocitos aislados durante iniciales FACS que determinan la frecuencia de células T CD4 Vδ1.
   NOTA: Tamaño de la población de esta entidad de células T puede diferir mucho entre individuos y en función de su estado inmunológico. Typicaliado, aproximadamente 1% de las células T son Vδ1 ⁺ y aproximadamente 1-5% de las células son Vδ1 ^{+ CD4} +.
   1. Diluir las células con 1 ml de tampón FACS-, que consiste en PBS que contenía 2% de FCS y EDTA 5 mM. Centrifugar a 660 xg durante 2 minutos y decantar el sobrenadante. El volumen de reflujo de tampón FACS sobre 100 l es suficiente para la posterior tinción. Vórtice brevemente e incubar las células con 5 l de reactivo Fc-bloqueo durante 5 min a RT para aumentar la especificidad de la tinción FACS.
   2. Añadir anticuerpos monoclonales humanos directamente a las células sin retirar el reactivo Fc-bloqueo. Asegúrese de teñir las células con anticuerpos contra Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) y TCRαβ (1:25). Preparación del control isotipo con los isotipos de inmunoglobulinas correspondientes. Se incuban las células con anticuerpos durante 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
   3. Lavar las células en 1 ml de tampón FACS (Centrifugar durante 2 min; a 660 xg), se decanta el supernatant y proceder a la adquisición FACS en el volumen de tampón restante.
2. Peletizar las células (que no se utilizan en el análisis FACS) por centrifugación durante 12 min; a 300 g; 8 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el celular pelletin 60 l MACS-buffer por 1 x 10 ⁷ células. Añadir 20 l de reactivo Fc-bloqueo por 1 x 10 ⁷ células e incubar durante 5 min a 4 ° C.
3. Añadir 10 l de anticuerpo anti-Vδ1 humana conjugado con FITC por 1 x 10 ⁷ células directamente a las células. Incubar durante 12 min a 4 ° C en la oscuridad.
4. Lavar las células utilizando 14 ml MACS-buffer (centrifugar durante 12 min; a 300 g; 8 ° C). Desechar el sobrenadante y resuspender completamente las células en 80 l de tampón MACS por 1x10 ⁷ células.
5. Tome 1-2 x 10 ⁵ células y las diluir en tampón FACS 100 l para la verificación del etiquetado por análisis FACS. No se necesitan aditivos adicionales para este paso. Asegúrese de que no es un suficiente diferencia en el brillo para Vδ1 ^- y las células Vδ1 ^+. Si este no es el caso, repita los pasos 2.3) y 2.4).
6. Añadir 20 l microperlas anti-FITC por 1 x 10 ⁷ células para las células restantes, mezclar bien e incubar durante 15 min en la oscuridad a 4 ° C. A partir de entonces, se lavan las células utilizando al menos 10 ml de tampón MACS (centrifugar durante 12 min, a 300 xg; 8 ° C).
7. Durante la centrifugación, equilibrar la columna magnética pre-enfriado colocado en un imán con tampón MACS 500 microlitros.
8. Resuspender las células en 500 l de tampón MACS-(para el número de células mayor que 1 x 10 ^8, ampliar este volumen en consecuencia) y aplicar cuidadosamente las células en la columna. Recoger el flujo a través que contiene el Vδ1 ^- células.
9. Lavar la columna tres veces con l MACS-buffer 500 y recoger el flujo a través de nuevo en el mismo tubo. Tenga en cuenta que el depósito debe estar vacío antes de aplicar tampón en la columna.
10. Retire la columna del dispositivo magnético y colocarlo en un tubo cónico de 15 ml. Vaciar rápidamente la columna con tampón MACS 1 ml empujando firmemente el émbolo en la columna. Recoger el eluido en un tubo.
    NOTA: Para obtener una pureza> 98%, por lo general es necesario repetir los pasos 2,7 a 2,9) con una segunda columna.
11. Verificar la pureza de las células mediante análisis FACS ¹⁸ con el mismo panel de anticuerpos como antes (ver 2.1.2) y contar las células.

3. Aislamiento de células T ⁺ Vδ1CD4

1. Resuspender 25 l de cuentas de CD4 con un vórtice de> 30 seg. Lavar las perlas (la cantidad mínima tal como se representa por el fabricante) en 1 ml de tampón MACS en un tubo de 1,5 ml de reacción colocando el tubo en un imán durante 1 min. Descartar el sobrenadante cuidadosamente con una pipeta a pequeña escala (200 l) y resuspender las perlas en el volumen original de tampón MACS-.
2. Granular Vδ1 ⁺ células (centrífuga de 12 minutos; a 300 xg) y aspirar el sobrenadante y resuspender todas las células ⁺ Vδ1 en 500 l de tampón MACS-y añadirlos al tubo que contenía las perlas. Mezclar vigorosamente y se incuba durante 20 min a 4 ° C con inclinación constante (por ejemplo, en un rotador).
3. Se coloca el tubo que contiene las células en un imán para 2 min. Asegúrese de que no hay restos en la tapa.
   NOTA: Las células CD4 ⁺ se han unido las perlas magnéticas y adjuntar a un lado del tubo frente al imán.
4. Abrir con cuidado la tapa mientras se mantiene el tubo en el interior del dispositivo magnético y recoger el sobrenadante que contiene el CD4 ^- células Vδ1 ⁺ usando una pipeta de pequeña escala. Coloque CD4 ^- las células Vδ1 ⁺ en un tubo separado y colocar este tubo en el imán de nuevo para evitar posiblemente restante células CD4 o perlas de la población.
   1. Lave el CD4 ^- las células en 5 ml MACS-buffer (centrifugar durante 12 min; a 300 xg) unnd resuspender en una concentración de 1 x 10 ⁵ células por 100 medios de comunicación mu l. CD4 ^{- las células} pueden cultivarse fácilmente en las condiciones dadas a continuación (4.2).
5. Coloque el tubo con los objetivos ^de células CD4 + fuera del campo magnético, resuspender las células en 500 l MACS-buffer y ponerlos de nuevo en el dispositivo magnético. Repetir los pasos 3.3 a 3.5 dos veces para obtener una mayor pureza. Aspirar el sobrenadante con la pipeta
6. Resuspender las ^{células CD4 +} en 100 l de medios de cultivo (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina / estreptomicina) y añadir 10 l de una solución de perlas de desprendimiento. Incubar a TA durante 45 min con inclinación constante (por ejemplo, en un rotador).
7. Colocar las células en un imán para 1 min. Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene células CD4 ^{+ +} Vδ1-talón gratis con una pipeta de pequeña escala.
8. Fuera del imán, resuspender las perlas con medios de cultivo y 100 l de repeticiónpasos 3.6 y 3.7 dos veces para obtener el número de células más altos de células CD4 ^+.
9. Granular las células (centrifugar a 300 xg, durante 12 minutos) y descartar el sobrenadante por completo con la pipeta. Resuspender las células en los medios de comunicación, pre-calentado frescos y contarlos. Examinar la pureza de las células Vδ1 ^{+ +} CD4 por análisis FACS representados en los pasos 2.1.1-2.1.3.

Clonación 4.-célula individual por dilución limitada

1. Aislar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de un donante alogénico como se representa en 1/1 a 1/6.
2. Irradiar 2,5 x 10 ⁷ PBMC alogénicas con 80 Gy en 25 ml de medio de cultivo utilizando γ-radiación.
3. Añadir IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) y PHA (2 mg / ml) a las células alimentadoras irradiadas y distribuirlos en placas de 96 pocillos en forma de U, 5 x 10 ⁴ alimentador células en 50 l por pocillo.
4. Diluir las células Vδ1 ^{+ CD4} + a una concentración de 0,3 células por 50 l. Pipetate 50 l de la solución de células a cada pocillo que alberga las células irradiadas y citoquinas.
   NOTA: Por lo tanto, las citoquinas se diluyen a la concentración final de 100 U / ml de IL-2, 10 ng / ml de IL-7 y 1 mg / ml de PHA. Se incuban las placas de 96 pocillos en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ humidificado atmósfera.
   1. Opcionalmente, cultivar restante purificado células Vδ1 ^{+ CD4} + como cultivo en masa en las mismas condiciones de cultivo como los clones.
5. Suministrar las células cada 3-4 días con citoquinas y medio fresco. Para ello, el intercambio de la mitad del medio en los pocillos con 50 l de medio fresco mediante pipeteo. Añadir concentración 2 veces de citoquinas para cada suplementación. Añadir 5x10 ⁴ células alimentadoras irradiados por pozo cada otra ronda de alimentación.
6. Usando un microscopio, observar primeros clones se hacen visibles después de 3-4 semanas, ya que metabolizan y por lo tanto cambiar el color de las colonias del medio de cultivo y la forma.
   NOTA: Para pielesTher cultivo, resuspender los clones bien y transferirlos para separar las placas de 96 pocillos. Analizar las células a través de FACS como se indica en 2.1.1-2.1.3. Los clones mantenidos en estas condiciones pueden llegar a cambiar su TCR de Vδ1 a αβTCR. El punto de tiempo para esto transdiferenciación varía de clon para clonar.

Resultados

La Figura 1 representa las diferentes etapas y el resultado del aislamiento de células T Vδ1 partir de sangre periférica. La Figura 1A muestra una distribución típica de las células Vδ1 ⁺ en los linfocitos CD3 ^+, así como la expresión co-receptor de la población Vδ1 ^+. En este donante, la frecuencia de Vδ1 ⁺ células (rojo) es 2,3% de total de linfocitos y la expresión de CD4 (verde) de Vδ1 ^{+ linfocitos} es 2,6%. En tot...

Discusión

Para estudiar el fenotipo, la biología y la función de una entidad de células escasas (T-), es decir, las células T CD4 ^{+ +} Vδ1, se utilizaron dos marcadores: Vδ1 y CD4 para su aislamiento celular magnética positiva. Vδ1 es un receptor huérfano, mientras que CD4 se expresa en células T helper, a un nivel inferior en monocitos y células dendríticas, y en un nivel muy bajo en las células progenitoras hematopoyéticas.

Las técnicas para el enriquecimiento y la selecció...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D