単離と<em&gt;エクスビボ</emVδ1の&gt;文化<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt;γδT細胞、胸腺外αβT細胞前駆

要約

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

要約

胸腺、αβT細胞および脊椎動物における適応免疫系の主鎖を生成するための主要な器官は、長いαβT細胞の唯一の供給源として考えられてきました。しかし、胸腺退縮は、周囲へのナイーブαβT細胞の劇的に減少出力につながる人生の早い段階で開始します。それにもかかわらず、あっても百歳は、新たに取得した病原体に対する免疫を構築することができます。最近の研究では、機能の胸腺損失を補償することができる経路のが我々の理解はまだルディメンタルあり、胸腺外αβT細胞の発生を示唆しています。 γδT細胞は、組織における主要なT細胞のサブセットを構成する生来のリンパ球です。我々は最近^{、CD4 +Vδ1+の} γδの希少エンティティT細胞が炎症状態にαβT細胞に分化転換できることを示すことによって、γδT細胞サブセットに、これまで正しく評価されていない優れた機能を帰する。ここでは、P末梢血から、この前駆細胞の単離およびその後の培養のためのプロトコルをrovide。 Vδ1細胞を積極我々は、磁気標識技術とCD4 ^+細胞の乏しい部分を対象と第2のステップが続く、磁気ビーズを使用して、健康なヒトのドナーのPBMCから濃縮されます。第二の標識の磁力が第一の磁性ラベルの1を超え、従って、関心の人口の、効率的な定量的・具体的な正の単離を可能にします。それから、細胞をクローニングし、効率的に拡大するためのFACS解析によって生成されたクローンの同定に必要な技術や文化状況を紹介します。そこで、精製、文化^および CD4 ^+Vδ1+γδT細胞のex vivoでの拡大のための詳細なプロトコルを提供します。この知識は、このαβT細胞progenitor`s生物学に関連する研究のため、IDEに目指す人のための前提条件でありますその転換に関与している分子トリガーをntify。

概要

脊椎動物では、細胞性および体液性免疫の部分で構成されている適応免疫は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしています。抗原の広範囲の認識は、T細胞に関して胸腺¹を中心に製造されているものとするhyperpolymorphic T-およびB細胞受容体（TCR / BCR）によって媒介されます。これには、骨髄由来の造血幹細胞（HSC）は、胸腺に播種し、最終的にすべてのT細胞系統を生じる明確に定義されたステージに沿って分化します。およびCD8 ^{- -}胸腺播種前駆細胞は、CD4であり、したがって、未熟、ダブルネガティブ（DN）胸腺細胞の割合を構成しています。胸腺由来の信号は、その系統のコミットメントとαβまたはγδT細胞のいずれかへの分化を誘導します。 DN2 / 3胸腺細胞で機能的に再編成されたTCR-γおよびTCR-δ鎖遺伝子の発現は、細胞増殖のANを駆動δTCR複合体を、γにつながりますDγδT細胞^2,3への分化を促進します。これとは対照的に、preTCRのpTを構築するためにpreTαとペアにすることができ、機能TCR-β鎖の再配列は、転写DN3胸腺細胞におけるTCR-γ鎖のサイレンシング^および CD4 + CD8 ⁺ダブルポジティブ胸腺細胞⁴への移行を誘導。この段階では、TCR-α鎖の再結合は、このようにこれらの細胞取消不能^5-9で生産γδTCRを抑止、TCR-α遺伝子座内にたたずむTCR-δ遺伝子座を削除、発生します。再配置αβTCRsはその後自己免疫（ネガティブ選択）を避けるために、特定のしきい値を超えてはならない弱（ポジティブ選択）、自己MHCに結合するそれらの能力のために選択されます。結合MHCクラスIまたはIIの能力に応じて、選択されたαβT細胞は、単一陽性CD4 ⁺またはCD8 ⁺ T細胞にその出口胸腺としてナイーブT細胞を開発します。

しかし、胸腺の退縮はほとんど消灯後思春期¹⁰でナイーブT細胞の指数関数的に減少する出力をリードする人生の早い段階で開始します。それにもかかわらず、T細胞プールのサイズは、ポスト胸腺恒常性T細胞の増殖および長寿命の免疫メモリ¹¹の増殖によってのみ部分的に説明できる寿命を通して一定のままです。したがって、胸腺外T細胞の開発が行われなければなりません。最近の研究では、胸腺外で機能αβT細胞^12-17を生じサイト-たαβT細胞前駆体を、特徴であるかなりの魅力を得ています。しかし、胸腺から独立したが、αβT細胞に分化胸腺外αβT細胞前駆体についての詳細な知識は、我々は、彼らがそれによって取るルート上に持っている背景のように断片的です。

我々は最近^、Vδ1+の小さなT細胞エンティティを特定し18、などのp> ^CD4 +γδT細胞は軽度の炎症環境でαβT細胞に分化転換することができます。興味深いことに、潜在的に新規の抗原を認識することができるように、このように、レパートリーの多様性を拡大後の胸腺T細胞の恒常性増殖、Vδ1CD4 ⁺細胞の分化転換新たなT細胞受容体を生成する逆保護よい新たに取得された病原体に対する宿主。これは、T細胞の可塑性に追加され、胸腺外T細胞の開発のために、これまで正しく評価されていない新しい経路を追加します。

目的は、このαβT細胞が胸腺外発達をprecursor`sトリガこれらのマーカーおよび分子を同定するために、リンパ球の供給源からの定量的な分離は、単一細胞クローンの生成及びその効率的な拡張が必須です。

プロトコル

倫理文：すべての手順は、ヘルシンキ宣言に従って実施し、テュービンゲン大学で臨床倫理委員会によって承認された（38 / 2009B02と470 / 2013B02プロジェクト）。

末梢血単核細胞（PBMC）の単離1。

1. 千IUのヘパリン硫酸を含む50 mlシリンジを使用して静脈穿刺を介し健常者50〜100ミリリットルを取り、血液1希釈：PBS（pH値= 7.2）と2。
2. 15ミリリットルの血液分離ソリューションのPBS溶液などBiocollとして（D = 1.077グラム/ ml）を50ml中の円錐管：慎重に血液35mlのレイヤ。室温で800×gで15分間遠心します。
   注：ブレーキを使用することはできません。
3. ピペットでリンパ球層の細胞を収集し、少なくとも50 mlのPBSで細胞を2回洗浄（; 400×gで12分間遠心分離）。ピペットで遠心分離後、上清を取り除きます。
4. 溶解残り懸濁させることによって赤血球およびincub2-4分間低張緩衝液1-5 mlのリンパ球画分をレーティング。
   注：溶解緩衝液の曝露とボリュームの持続時間は、使用される溶解バッファーにし、リンパ球画分に残った赤血球の量に依存します。
5. 12分間2​​50×gでPBS（1:10）、遠心分離で細胞を希釈し、その後12分間300×gで一回10mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、洗います。
6. PBS中のリンパ球を再懸濁し、トリパンブルー溶液を使用して、ノイバウアーカウントチャンバー内の細胞をカウントします。
   注：通常、> 1×10 ⁸のリンパ球を新たに末梢血を集めて100ミリリットルから受信されます。

Vδ1T細胞の単離2。

1. 6単離したリンパ球を取ります。
   注：このT細胞の実体の人口規模は、個人とその免疫学的状態に応じ間で大きく異なる可能性があります。 Typic味方、T細胞の約1％が^Vδ1+であり^、Vδ1+細胞の約1-5％がCD4 ⁺です。
   1. PBS、2％FCSおよび5mM EDTAを含んで構成され、1mLのFACS緩衝液で細胞を希釈します。 2分間660×gで遠心分離し、上清をデカント。約100μlのFACS緩衝液の還流量は、その後の染色のために十分です。簡単に言うと渦とFACS染色の特異性を増大させるために室温で5分間、5μlのFcをブロッキング試薬で細胞を培養します。
   2. Fcブロッキング試薬を除去することなく、細胞に直接ヒトモノクローナル抗体を追加します。 （1：200）、CD8（1：200）とTCRαβ（1：25）Vδ1（1時50分）、CD3（1時50分）、CD4に対する抗体で細胞を染色することを確認します。対応する免疫グロブリンアイソタイプとアイソタイプコントロールを準備します。暗所で4℃で20分間、抗体と細胞をインキュベートします。
   3. （2分間遠心分離; 660×gにて）を1mlのFACS緩衝液中で細胞を洗浄し、supernをデカントatant、残りのバッファ量にFACS取得に進みます。
2. 12分間の遠心分離（FACS分析に使用されていない）細胞をペレット化します。 300 gで。 8℃。上清を除去し、1×10 ⁷個の細胞あたり60μlのMACSバッファーpelletin細胞を再懸濁します。 1×10 ⁷個の細胞あたり20μlのFcをブロッキング試薬を加え、4℃で5分間インキュベートします。
3. 細胞に直接1×10 ⁷個の細胞あたり10μlのFITC結合抗ヒトVδ1抗体を追加します。暗闇の中で4℃で12分間インキュベートします。
4. 14ミリリットルMACSバッファー（; 300グラムで、8℃12分間遠心分離器）を用いて細胞を洗浄します。完全に上澄みを捨て、1×10 ⁷個の細胞あたり80μlのMACS緩衝液で細胞を再懸濁します。
5. 1-2×10 ^{5個の細胞}を取り、FACS分析により標識の検証のために、100μlのFACS緩衝液でそれらを希釈します。さらなる添加剤は、このステップのために必要とされていません。 suffiがあることを確認してくださいcientのVδ1のための明るさの違い^-と^Vδ1+細胞 。そうでない場合は、繰り返し）は2.3）と2.4を繰り返します。
6. 残りのセルに1×10 ⁷細胞あたり20μlの抗FITCマイクロビーズを加え、よく混ぜ、4℃で暗所で15分間インキュベートします。その後、（300×gで、12分間の遠心分離; 8°C）を少なくとも10ミリリットルのMACS緩衝液を用いて細胞を洗浄します。
7. 遠心分離の間に、500μlのMACS緩衝液で磁石に配置された予備冷却磁気カラムを平衡化。
8. （1×10 ⁸よりも高い細胞数のために、それに応じてこのボリュームをスケールアップ）500μlのMACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、カラムに慎重に細胞を適用します。細胞^- Vδ1を含むフロースルーを収集します。
9. 500μlのMACS緩衝液でカラムを3回洗浄し、同じチューブに再びフロースルーを収集します。リザーバーはカラム上にバッファを適用する前に、空でなければならないことに注意してください。
10. 磁気デバイスから列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブにそれを置きます。すばやくしっかりと列にプランジャーを押して1ミリリットルMACS緩衝液でカラムを洗浄します。チューブに溶出液を収集します。
    注：> 98％の純度を得るためには、第二列を含むステップ2.7から2.9）を繰り返すことが通常必要です。
11. 前と同じ抗体パネルとのFACS分析¹⁸によって細胞の純度を確認します（2.1.2を参照）、細胞をカウントします。

^Vδ1CD4+ T細胞の単離3

1. > 30秒間ボルテックスでCD4ビーズ25μlの再懸濁します。 1分間磁石にチューブを配置することにより、1.5 mlの反応チューブに1 mlのMACS緩衝液でビーズ（製造業者によって示されるように最小量）を洗浄します。小規模ピペット（200μL）で慎重に上清を廃棄し、MACSバッファーの元のボリュームにビーズを再懸濁します。
2. ^1Vδ1+細胞 （遠心分離をペレット化2分; 300×gで）し、上清を吸引し、500μlのMACSバッファー内のすべての^Vδ1+細胞を再懸濁し、ビーズを含むチューブに追加します。勢いよく混合し、（回転子に、例えば ）一定の傾斜で4℃で20分間インキュベートします。
3. 2分間磁石に細胞を含有するチューブを置きます。蓋には名残がないことを確認してください。
   注：CD4 ^{+細胞は、}磁気ビーズを結合させ、磁石が直面しているチューブの側面に取り付けられています。
4. 慎重に、磁気装置内チューブを保持しながら、蓋を開け、CD4含ま上清を収集^-小規模のピペットを用いて^Vδ1+細胞。別のチューブに^{Vδ1+細胞および}集団から、おそらく残りのCD4細胞またはビーズを避けるために、再び磁石にこのチューブを置く^- CD4を置きます。
   1. CD4を洗う^- 5ミリリットルMACS緩衝液中で細胞（12分間遠心; 300×gで）AND100μlの培地あたり1×10 ⁵細胞の濃度で再懸濁します。 CD4 ^-細胞が容易に（4.2）の下に与えられた条件下で培養することができます。
5. 500μlのMACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、磁気デバイスに戻し入れ、磁場の外^CD4 + ^細胞標的にチューブを置きます。繰り返しは、より高い純度を得るために二度3.3から3.5を繰り返します。ピペットで上清を除去
6. 100μlの培養培地中のCD4 ⁺細胞（RPMI 1640、10％FCS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）に再懸濁し、ビーズ取り外し溶液10μlを加えます。一定の傾斜（例えば、回転体で）と室温で45分間インキュベートします。
7. 1分間磁石に細胞を配置します。注意深く小規模ピペットを用いてビーズを含まない^Vδ1+ CD4 ⁺細胞を含む上清を収集します。
8. 磁石の外では、100μlの培地を繰り返してビーズを再懸濁CD4 ⁺細胞の高い細胞数を得るために、3.6倍及び3.7ステップ。
9. 細胞をペレット化する（12分間、300×gで遠心分離）し、ピペッティングにより完全に上清を捨てます。新鮮な、予め温めておいたメディアで細胞を再懸濁し、それらを数えます。ステップ2.1.1-2.1.3に示されたFACS分析によって^{Vδ1+ CD4 +細胞}の純度を調べます。

限界希釈4.単一細胞クローニング

1. 1.1〜1.6に示すように、同種異系のドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。
2. γ線照射を用いて、25 mlの培養培地中で80グレイで2.5×10 ⁷の同種異系のPBMCを照射します。
3. 照射されたフィーダー細胞をIL-2（200 U / ml）を、IL-7（20ng / ml）およびPHA（2μg/ ml）を添加し、96ウェルU型プレートに配布し、5×10 ⁴フィーダウェルあたり50μl中の細胞。
4. 50μlの0.3細胞の濃度に^{Vδ1+ CD4 +細胞}を希釈します。ピペット各ウェル照射された細胞およびサイトカインを保有する細胞溶液の50μlのTE。
   注：このように、サイトカインは、100 U / mlのIL-2を10ng / mlのIL-7とを1μg/ mLのPHAの最終濃度に希釈します。 37℃、5％CO ₂の加湿雰囲気でインキュベーター中で96ウェルプレートをインキュベートします。
   1. 必要に応じて、クローンの同じ培養条件下でバルク培養物として^Vδ1+ CD4 ⁺細胞を精製したまま養います。
5. サイトカインおよび新鮮な培地で3〜4日ごとに細胞を供給してください。このため、ピペッティングにより50μlの新鮮な培地でウェル中の培地の交換半分。すべての補充にサイトカインの2倍の濃度を追加します。給餌のも、他のすべてのラウンドあたり5×10 ⁴照射フィーダー細胞を追加します。
6. 彼らは代謝、したがって、培地およびフォームコロニーの色を変更すると、顕微鏡を用いて、観察最初のクローンは、3〜4週間後に目に見えるようになります。
   注：毛皮のためにTHER栽培は、よくクローンを再懸濁し、96ウェルプレートを分離するためにそれらを転送します。 2.1.1-2.1.3に示すように、FACSを介して細胞を分析します。これらの条件の下に保持したクローンは、最終的にαβTCRにVδ1から自分のTCRを変更することがあります。この分化転換のための時点は、クローンからクローンに変化します。

結果

図1は、種々の段階及び末梢血からVδ1T細胞の単離の結果を示している。 図1Aは、CD3 ⁺リンパ球における^Vδ1+細胞の代表的な分布、ならびに^{Vδ1+集団の}共受容体の発現を示します。このドナーでは^{、Vδ1+細胞} （赤）の周波数は、総リンパ球数の2.3％であり^{、Vδ1+リンパ球}のCD4発現（緑）が2.6％です。要するに、分離のための標的?...

ディスカッション

その正磁気細胞分離のためVδ1およびCD4：希少（T-）細胞エンティティ、すなわち^{Vδ1+ CD4} + T細胞の表現型、生物学と機能を研究するために、我々は二つのマーカーを使用していました。 CD4は、Tヘルパー細胞上に発現されるのに対し、Vδ1は、単球および樹状細胞上に低レベルで、および造血前駆細胞上で非常に低レベルで、オーファン受容体です。

高純度の細胞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D