Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

Riepilogo

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1⁺CD4⁺ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

Il timo, l'organo principale per la generazione di cellule T αβ e spina dorsale del sistema immunitario adattativo in vertebrati, è stata a lungo considerata come unica fonte di cellule αβT. Eppure, involuzione timica inizia presto nella vita che porta ad un'uscita drasticamente ridotto di cellule αβT naïve in periferia. Tuttavia, anche centenari possono costruire immunità contro gli agenti patogeni di nuova acquisizione. Recenti ricerche suggeriscono lo sviluppo delle cellule αβT extrathymic, tuttavia la nostra comprensione dei percorsi che possono compensare la perdita della funzione timica sono ancora rudimentali. γδ cellule T sono linfociti innate che costituiscono il principale sottoinsieme cellule T nei tessuti. Recentemente abbiamo attribuito un finora incompreso importante funzione di un sottoinsieme delle cellule T γδ mostrando che la scarsa entità dei CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ cellule T possono transdifferenziarsi in cellule αβT in condizioni infiammatorie. Qui, si provide il protocollo per l'isolamento di questo progenitrici da sangue periferico e la sua successiva coltivazione. Cellule Vδ1 sono positivamente arricchiti da PBMC di donatori umani sani utilizzando sfere magnetiche, seguita da una seconda fase in cui puntiamo la scarsa frazione di ^{cellule CD4 +} con un ulteriore tecnica di etichettatura magnetica. La forza magnetica del secondo nell'etichettatura supera quello della prima etichetta magnetica, e quindi permette efficiente, quantitative e specifiche isolamento positivo della popolazione di interesse. Abbiamo poi introdurre la condizione tecnica e la cultura necessaria per la clonazione e in modo efficiente l'espansione delle cellule e per l'identificazione dei cloni generati mediante analisi FACS. Quindi, mettiamo a disposizione un protocollo dettagliato per la purificazione, la cultura e l'espansione ex vivo ^di cellule CD4 + Vδ1 ⁺ γδ cellule T. Questa conoscenza è condizione indispensabile per gli studi che riguardano questo αβT progenitor`s biologico cellula e per coloro che mirano a identify i trigger molecolari che sono coinvolti nel suo transdifferenziamento.

Introduzione

Nei vertebrati, immunità adattativa che si struttura nel cellulare e una parte umorale di immunità svolge un ruolo importante nella difesa contro gli agenti patogeni. Il riconoscimento di una vasta gamma di antigeni è mediata da T- hyperpolymorphic e recettori cellulari B (TCR / BCR), che per quanto riguarda le cellule T sono assunti essere prodotta principalmente nel timo ^1. A tale scopo, le cellule staminali ematopoietiche (CSE), derivate dal midollo osseo, il timo seme e differenziare lungo fasi ben definite finalmente danno origine a tutte le linee cellulari T. Thymus progenitori semina sono CD4 ^- e CD8 ^- e costituiscono quindi la frazione timocita immaturo, doppio negativo (DN). Segnali Thymus derivate poi inducono il loro impegno lignaggio e la differenziazione in cellule T αβ sia o γδ. L'espressione di funzionalmente riarrangiati TCR-gamma e TCR-δ catena geni in DN2 / 3 timociti porta a γ δTCR complessi, che guidano la proliferazione cellulare und promuovere la differenziazione in cellule γ DT ^2,3. Al contrario, il riarrangiamento di un funzionale catena TCR-β, che può accoppiarsi con preTα costruire una preTCR pT, induce il silenziamento trascrizionale della catena TCR-γ in timociti DN3 e il loro inserimento CD4 ⁺ CD8 ⁺ doppio positive timociti ⁴ . In questa fase, la ricombinazione della catena TCR-α si verifica, eliminando il locus TCR-δ che annida nel locus TCR-α, abrogando quindi la produzione di un γδTCR in queste cellule irrevocabilmente ^5-9. ΑβTCRs riarrangiati sono successivamente selezionati per la loro capacità di legarsi auto-MHC debolmente (selezione positiva), che non può superare una certa soglia per evitare autoimmunità (selezione negativa). Secondo la loro capacità di I o II legame MHC di classe, le celle selezionate αβT si sviluppano in cellule singole positive ^CD4 + o ^CD8 +, che uscita il timo cellule T come naïve.

Tuttavia, involuzione del timo inizia presto nella vita che porta a esponenzialmente ridotto la produzione di cellule T naive che è quasi estinta dopo l'adolescenza ^10. Tuttavia, la dimensione del pool di cellule T rimane costante per tutta la vita, che può essere spiegato solo in parte dal post-timica proliferazione omeostatica di cellule T e la proliferazione di lunga durata memoria immunologica ^11. Di conseguenza, deve avvenire lo sviluppo extrathymic cellule T. La ricerca recente ha acquisito notevole attrazione che caratterizza progenitori delle cellule αβT che-a-extrathymic siti hanno dato origine alla αβ funzionale cellule T ^12-17. Eppure, conoscenza dettagliata extrathymic precursori delle cellule αβT che indipendente da un timo differenziarsi in cellule αβT è frammentaria come i precedenti che abbiamo sulla rotta prendono così.

Recentemente abbiamo identificato la piccola impresa a cellule T di Vδ1 ^{+ CD4} + γδT come un extrathymic prognitor cella αβT ^18, che una volta isolato dal sangue periferico di donatori umani sani possono transdifferenziarsi in cellule αβT in un ambiente infiammatorio lieve. È interessante notare che e contrario alla proliferazione omeostatica delle cellule T post-timo, transdifferenziazione di ^cellule CD4 + Vδ1 genera nuovi recettori delle cellule T, ampliando così la diversità repertorio, in modo che potenzialmente nuovi antigeni possono essere riconosciuti e può tutela dell'ospite contro gli agenti patogeni di nuova acquisizione. Questo aggiunge alla plasticità delle cellule T e aggiunge un nuovo percorso finora unappreciated per lo sviluppo delle cellule T extrathymic.

L'isolamento quantitativo da fonti linfocitari, la generazione di cloni unicellulari e la loro espansione efficiente sono essenziali per l'obiettivo di individuare i marcatori e molecole che innescano questa cella αβT precursor`s sviluppo extrathymic.

Protocollo

Dichiarazione etica: Tutte le procedure sono state eseguite secondo la Dichiarazione di Helsinki e sono stati approvati dal Comitato Etico Clinica presso l'Università di Tübingen (progetti 38 / 2009B02 e 470 / 2013B02).

1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

1. Prendere 50-100 ml da un volontario sano tramite venipuntura utilizzando una siringa da 50 ml contenente 1.000 UI eparina solfato e diluire il sangue 1: 2 con PBS (pH = 7,2).
2. Strato cautela 35 ml di sangue: soluzione PBS soluzione separazione 15 ml di sangue come Biocoll (d = 1.077 g / ml) in un tubo da 50 ml. Centrifugare per 15 minuti a 800 xg a RT.
   NOTA: Il freno non deve essere utilizzato.
3. Raccogliere le cellule dello strato linfocitica con una pipetta e lavare le cellule due volte in almeno 50 ml di PBS (centrifuga per 12 min; a 400 xg). Rimuovere il surnatante dopo centrifugazione con una pipetta.
4. Lyse restante eritrociti sospendendo e incubdall'uso della frazione linfocitica con 1-5 ml di una soluzione tampone ipotonico per 2-4 min.
   NOTA: Durata dell'esposizione e il volume di tampone di lisi dipendono dal tampone di lisi utilizzato e la quantità di globuli rossi lasciati nella frazione linfociti.
5. Diluire le cellule con PBS (1,10) e centrifugare a 250 xg per 12 min e poi risospendere e lavare il pellet cellulare una volta in 10 ml di PBS a 300 xg per 12 min.
6. Risospendere i linfociti in PBS e contare le cellule in una camera di Neubauer conteggio utilizzando Trypan blue soluzione.
   NOTA: Di solito,> 1 x ¹⁰ 8 linfociti vengono ricevuti da 100 ml appena disegnato sangue periferico.

2. Isolamento di Vδ1 cellule T

1. Prendere <1 x ¹⁰ 6 linfociti isolati per un periodo iniziale di FACS che determinano la frequenza di cellule T CD4 Vδ1.
   NOTA: le dimensioni della popolazione di questa entità delle cellule T può variare notevolmente tra gli individui e secondo il loro stato immunologico. Typicalleato, circa l'1% delle cellule T sono Vδ1 ⁺ e circa il 1-5% del ^{+ cellule} Vδ1 sono ^CD4 +.
   1. Diluire le cellule con 1 ml FACS-buffer, che consiste di PBS contenente 2% di FCS e 5 mM EDTA. Centrifugare a 660 xg per 2 minuti e decantare il surnatante. Il volume reflusso di circa 100 microlitri tampone FACS è sufficiente per la successiva colorazione. Brevemente vortex e incubare le cellule con 5 ml Reagente Fc-Blocking per 5 minuti a temperatura ambiente per una maggiore specificità della colorazione FACS.
   2. Aggiungere anticorpi umani monoclonali direttamente alle cellule senza rimuovere il reagente-Fc Blocking. Assicurati di macchiare le cellule con anticorpi contro Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) e TCRαβ (1,25). Preparare il controllo isotipico con i corrispondenti isotipo di immunoglobulina. Incubare le cellule con anticorpi per 20 min a 4 ° C al buio.
   3. Lavare le cellule in 1 ml FACS tampone (centrifugare per 2 minuti; a 660 xg), decantare il supernatant e procedere all'acquisizione FACS nel volume buffer residuo.
2. Pelletizzare cellule (che non vengono utilizzati nell'analisi FACS) mediante centrifugazione per 12 min; a 300 g; 8 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il cellulare pelletin 60 microlitri MACS-tampone per 1 x ¹⁰ 7 cellule. Aggiungere 20 ml Reattivo-Fc Blocco per 1 x ¹⁰ 7 cellule e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
3. Aggiungere 10 microlitri FITC-coniugato anticorpo anti-umano Vδ1 per 1 x 10 ⁷ cellule direttamente alle cellule. Incubare per 12 minuti a 4 ° C al buio.
4. Lavare le cellule con 14 ml MACS-buffer (centrifuga per 12 minuti; a 300 g; 8 ° C). Gettare il surnatante completamente e risospendere le cellule in 80 microlitri di buffer MACS per 1x10 ⁷ cellule.
5. Prendere 1-2 x 10 ⁵ cellule e diluirli in 100 microlitri di buffer FACS per la verifica dell'etichettatura mediante analisi FACS. Nessun ulteriore additivi sono necessari per questa operazione. Assicurarsi che ci sia una suffidifferenza ciente di luminosità per Vδ1 ^- e le cellule Vδ1 ^+. Se questo non è il caso, ripetere i passaggi 2.3) e 2.4).
6. Aggiungere 20 microlitri microsfere anti-FITC per 1 x ¹⁰ 7 cellule alle cellule rimanenti, mescolare bene e incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C. Successivamente, lavare le cellule utilizzando almeno 10 ml MACS tampone (centrifuga per 12 minuti, a 300 xg; 8 ° C).
7. Durante la centrifugazione, equilibrare la colonna magnetica pre-raffreddata collocato in un magnete con tampone MACS 500 microlitri.
8. Risospendere le cellule in 500 microlitri MACS-buffer (per il numero di cellule superiore 1 x 10 ^8, scalare questo volume di conseguenza) e applicare le cellule con attenzione sulla colonna. Raccogliere il flow-through contiene il Vδ1 ^- cellule.
9. Lavare la colonna tre volte con 500 microlitri MACS-buffer e raccogliere nuovamente il flusso continuo nello stesso tubo. Si noti che il serbatoio deve essere vuoto prima di applicare tampone sulla colonna.
10. Rimuovere la colonna dal dispositivo magnetico e posizionarlo in un tubo da 15 ml. Svuotare rapidamente la colonna con tampone 1 ml MACS con fermezza spingendo lo stantuffo nella colonna. Raccogliere l'eluato in un tubo.
    NOTA: Per ottenere una purezza> 98%, di solito è necessario ripetere i passaggi 2,7-2,9) con una seconda colonna.
11. Verificare la purezza delle cellule mediante analisi FACS ^{18 con} lo stesso pannello di anticorpi come prima (vedi 2.1.2) e contare le cellule.

3. Isolamento di Vδ1CD4 ⁺ cellule T

1. Risospendere 25 ml di CD4 perle con un vortice per> 30 sec. Lavare le perline (la quantità minima come descritto dal produttore) in 1 ml di tampone di MACS in una provetta da 1,5 ml di reazione ponendo la provetta in un magnete per 1 min. Eliminare il surnatante con cura con una pipetta su piccola scala (200 ml) e risospendere le sfere nel volume originale di MACS-buffer.
2. Pelletizzare Vδ1 cellule ⁺ (centrifugare per 12 min; a 300 xg) e aspirare il surnatante e risospendere le cellule ⁺ Vδ1 in 500 microlitri MACS-buffer e aggiungerli alla provetta contenente le perline. Mescolare vigorosamente e incubare per 20 minuti a 4 ° C con costante inclinazione (esempio, in un rotatore).
3. Posizionare il tubo contenente le cellule in un magnete per 2 min. Assicurarsi che non ci siano residui nel coperchio.
   NOTA: cellule CD4 ⁺ sarà vincolato sfere magnetiche e allegare al lato del tubo rivolto verso il magnete.
4. Aprire con cautela il coperchio, mantenendo il tubo all'interno del dispositivo magnetico e raccogliere il surnatante che contiene il CD4 ^{- + cellule} Vδ1 utilizzando una pipetta su piccola scala. Posizionare CD4 ^{- + cellule} Vδ1 in un tubo separato e collocare questo tubo nel magnete di nuovo per evitare possibilmente rimanendo cellule CD4 o perline da parte della popolazione.
   1. Lavare il CD4 ^- le cellule in 5 ml MACS-buffer (centrifuga per 12 minuti; a 300 xg) unand risospendere in una concentrazione di 1 x 10 ⁵ cellule per 100 microlitri mezzi. CD4 ^- le cellule possono essere facilmente coltivate secondo le condizioni riportate di seguito (4.2).
5. Posizionare il tubo con gli obiettivi ^di cellule CD4 + al di fuori del campo magnetico, sospendere nuovamente le cellule in 500 microlitri MACS-buffer e rimetterli nel dispositivo magnetico. Ripetere i passaggi 3,3-3,5 due volte per ottenere una maggiore purezza. Rimuovere il surnatante pipettando
6. Risospendere le ^{cellule CD4 +} in 100 ml di coltura (RPMI 1640, il 10% FCS, 1% di L-glutammina, 1% penicillina / streptomicina) e aggiungere 10 ml di una soluzione stallonatore. Incubare a temperatura ambiente per 45 min con inclinazione costante (ad esempio, in un rotatore).
7. Collocare le cellule in un magnete per 1 min. Raccogliere accuratamente il surnatante contenente Vδ1 cellule CD4 ^{+ +} senza tallone con una pipetta su piccola scala.
8. Al di fuori del magnete, risospendere le sfere con i terreni di coltura 100 microlitri e ripeterepassi 3.6 e 3.7 due volte per ottenere il numero di cellule più alti di cellule CD4 ^+.
9. Pelletizzare le cellule (centrifugare a 300 xg per 12 minuti) ed eliminare completamente il surnatante pipettando. Risospendere le cellule in mezzi freschi, preriscaldata e contarli. Esaminare la purezza delle Vδ1 ^{+ CD4} + cellule mediante analisi FACS raffigurati nei passaggi 2.1.1-2.1.3.

Clonazione 4. Single-cella limitata diluizione

1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da un donatore allogenico come illustrato in 1,1-1,6.
2. Irradiare 2,5 x ¹⁰ 7 PBMC allogenici con 80 Gy in 25 ml di coltura utilizzando γ-radiazioni.
3. Aggiungere IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) e PHA (2 mg / ml) per le cellule feeder irradiate e distribuirli in piastre da 96 pozzetti ad U, 5 x 10 ⁴ alimentatore cellule in 50 pl per pozzetto.
4. Diluire le cellule Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ a una concentrazione di 0,3 cellule per 50 ml. Dispensarete 50 microlitri della soluzione di cellule in ciascun pozzetto ospitare le cellule irradiate e citochine.
   NOTA: Così, le citochine sono diluiti alla concentrazione finale di 100 U / ml di IL-2, 10 ng / ml di IL-7 e 1 mg / ml PHA. Incubare le piastre a 96 pozzetti in un incubatore a 37 ° C, 5% CO ₂ atmosfera umidificata.
   1. Facoltativamente, coltivare rimanendo purificato ^{+ cellule} CD4 ⁺ Vδ1 come la cultura di massa, alle stesse condizioni di coltura, come i cloni.
5. Fornire le cellule ogni 3-4 giorni con citochine e mezzi freschi. Per questo, la metà scambio del mezzo nei pozzetti con 50 microlitri fresca media pipettando. Aggiungere la concentrazione di 2 volte di citochine a ogni integrazione. Aggiungere 5x10 ⁴ cellule di alimentazione irradiati per bene ogni altro giro di alimentazione.
6. Utilizzando un microscopio, osservare primi cloni diventano visibili dopo 3-4 settimane, in quanto metabolizzano e quindi modificare il colore delle colonie di coltura e di forma.
   NOTA: per pelliccether coltivazione, risospendere i cloni bene e trasferire loro di separare piastre a 96 pozzetti. Analizzare le cellule tramite FACS, come indicato in 2.1.1-2.1.3. Cloni conservati in queste condizioni possono finalmente cambiare il loro TCR da Vδ1 a αβTCR. Il punto di tempo per questo transdifferenziazione varia da clone per clonare.

Risultati

La figura 1 illustra le diverse fasi e il risultato l'isolamento delle cellule T Vδ1 da sangue periferico. La figura 1A mostra una tipica distribuzione di ^{+ cellule} CD3 ⁺ Vδ1 in linfociti, così come l'espressione co-recettore della popolazione Vδ1 ^+. In questo donatore, la frequenza di cellule Vδ1 ⁺ (rosso) è 2,3% del totale delle conta dei linfociti CD4 e l'espressione (verde) di Vδ1 ⁺ linfociti è del 2,6%. Comp...

Discussione

Per studiare il fenotipo, la biologia e la funzione di una scarsa (T) entità delle cellule, ovvero cellule Vδ1 ^{+ T} CD4 +, abbiamo usato due marcatori: Vδ1 e CD4 per il suo isolamento positivo cella magnetica. Vδ1 è un recettore orfano, considerando CD4 è espresso sulle cellule T helper, ad un livello inferiore su monociti e cellule dendritiche, e ad un livello molto basso sulle cellule progenitrici ematopoietiche.

Tecniche per l'arricchimento e la selezione di celle a el...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	lymphocyte separating solution
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	lysis of erythrocytes
Phosphate-buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537
MACS buffer	Miltenyi Biotec	130-091-222	supplement with BSA and pre-cool before use
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)	BD BioSciences	345766	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)	BD BioSciences	555548	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)	Miltenyi Biotec	130-097-333	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)	BD BioSciences	641400	not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-058-701	yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	pre-cool before use
MiniMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit	life technologies	11331D